从正常结肠和结直肠癌组织中分离人内皮细胞——一种改进的方案

本细胞分离方案的总体目标是从结直肠癌患者（包括肿瘤组织及相应的正常结肠组织）中获取纯净且具有活性的内皮细胞。该方法有助于回答肿瘤生物学和血管生成领域中的关键问题，例如评估和分析血管系统对结直肠肿瘤发生的影响。该技术的主要优势在于，能够以相对较高的成功率从结直肠癌患者中获得纯净且具有活性的人源内皮细胞。

为了从结直肠癌患者获取组织标本，使用新的手术刀切取约1克重的组织块。然后，用无菌镊子将新鲜组织块转移至含有40毫升冰浴HBSS缓冲液（含抗生素）的50毫升离心管中。接着，使用不同的无菌镊子依次将癌组织和正常组织从一个离心管转移到另一个离心管，用40毫升冰浴HBSS缓冲液（含抗生素）洗涤四次。

为了去除所有脂肪组织、非肿瘤组织或可能坏死的组织部分，使用无菌镊子将组织块转移至无菌细胞培养用培养皿中。然后加入三到五毫升含抗生素的HBSS缓冲液，使组织块保持湿润。接着，使用新的手术刀修剪组织块。

然后，使用带有弧形刀片的手术刀将剩余组织切碎成小块。将切碎的组织块转移至含有预热细胞培养基的组织解离管中。使用组织解离仪，并结合人源组织肿瘤解离试剂盒，按照制造商说明书对切碎的组织块进行解离。

第一个关键步骤是正确处理和显微解剖手术标本，以获得具有合适大小和组织类型的组织块。在解离组织块后，在室温下以300 × g离心1分钟。然后，使用移液管向MACS管中加入10毫升预热的DMEM低糖培养基。

接下来，将试管中的细胞悬液倒入置于50毫升离心管上方、孔径为100微米的细胞筛中。用移液器向MACS管中加入额外的10毫升DMEM Low培养基，以冲洗残留细胞，使其通过细胞筛进入离心管中。待全部细胞悬液过滤完成后，再用额外的10毫升DMEM Low培养基冲洗细胞筛。

将细胞悬液在室温下以300 × g离心7分钟。离心结束后，弃去上清液。然后，将细胞沉淀溶解于同一50 mL离心管中的5 mL添加了抗生素的预温EBM-2-MV培养基中。

从培养瓶中移除包被液，并将细胞悬液直接转移至维持在37摄氏度和5%二氧化碳环境中的T-25培养瓶中。当细胞融合度达到约80%至90%时，加入1毫升Accutase以使瓶内细胞脱落。随后，让细胞与Accutase作用10分钟。

接下来，向细胞中加入4毫升、37摄氏度的EBM-2-MV培养基。然后，使用检测范围为10至25微米的自动细胞计数仪对细胞进行计数。第二关键的步骤是所有需要对细胞进行传代的步骤。

准确判断消化时间需要经验。如果消化过早，细胞将会死亡；如果消化过晚，内皮细胞将进入衰老状态，或出现成纤维细胞过度生长的问题。

接下来，在室温下以250 × g离心4分钟，离心结束后弃去上清液。然后，将细胞沉淀重悬于预热的FACS缓冲液中。随后，向细胞中加入FACS染色抗体。

混合后，在室温下孵育，总时长为15分钟。在孵育进行至一半时，轻弹试管一次。使用刻度移液管向标记的细胞悬液中加入2 mL FACS缓冲液。

然后，在室温下以250 × g离心细胞悬液4分钟，离心结束后弃去上清液。接着加入2毫升FACS缓冲液以重悬细胞沉淀，并在室温下以250 × g再次离心细胞悬液4分钟。随后，将沉淀重悬于500微升含有抗生素的EBM-2-MV培养基中。

接下来，将细胞转移至流式细胞分选仪。鉴定三重阳性细胞，并使其接种于含有新鲜预热的EBM-2-MV培养基的24孔培养板中。继续培养细胞48小时，随后更换培养基。

每两天更换一次培养基，持续至5到10天后细胞融合度达到90%至100%。然后根据所需的培养皿扩大细胞群体。待细胞融合度达到后进行收获，并进行后续的鉴定分析。

首先，将获得的肿瘤标本进行解离，并接种于细胞培养皿中。洗去非贴壁细胞后，将贴壁细胞培养至80%至90%融合度，随后进行FACS分选。接着，通过FACS分析鉴定经免疫标记的活肿瘤细胞和正常内皮细胞群体。

为此，使用荧光染料偶联抗体对正常和肿瘤血管内皮细胞进行特异性三重标记，以便通过流式细胞术（FACS）分选。分选后，肿瘤和正常血管内皮细胞分别占整个细胞群的平均比例为 3.6% 和 5.6%。接下来，为了鉴定血管内皮细胞标志物的表达情况，将获得的正常和肿瘤血管内皮细胞进行免疫细胞化学分析。

图中显示了 CD31 阳性的正常和肿瘤内皮细胞。随后，从 CD31 阳性的内皮细胞群体中分离 RNA，并进行 RT-qPCR，以鉴定其他内皮细胞特异性标志物。从图中可见，内皮细胞标志物（如 CD105、VE-钙黏蛋白和血管性血友病因子）均有表达，而可能污染的其他细胞群体的标志物则未检测到，表明分离获得的内皮细胞培养物具有较高的纯度。

一旦掌握，该技术若操作得当，大约可在三周内完成。通常，初次接触此方法的研究者会遇到困难，因为该方法需要具备原代内皮细胞培养的经验，才能准确判断细胞传代的时机及传代比例，或确定何时进一步处理细胞以进行FACS分选分析。该技术的应用意义延伸至结直肠癌的治疗领域，因为这些细胞培养体系可用于研究结直肠癌发生机制以及治疗反应或耐药性的相关机制。

我们最初产生这一方法的想法，源于阅读了文献中多篇报道，这些报道均指出从人类实体瘤中分离出真正纯净且具有活性的内皮细胞存在困难。该方法的可视化演示至关重要，因为组织显微解剖、用于FACS分选分析的组织处理，以及内皮细胞的进一步分离等步骤均需经验积累，才能准确判断合适的时间节点。在尝试该操作流程时，首先建立一个与外科、病理科及肿瘤登记处之间的有效协作网络尤为重要。

此外，您应接受过相关实验操作培训，以能够处理原代内皮细胞培养，因为这些细胞较为脆弱。观看本视频后，您应充分掌握如何从人结直肠癌组织及相应的正常结肠组织中分离内皮细胞。