Name: 激光捕获显微切割液相色谱质谱 (LCM-LC/MS) 对肺结核患者药物的空间量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习激光捕获显微切割结合液相色谱质谱技术，用于肺结核病灶组织中乙胺丁醇药物的空间定量分析。该方法可精确测定药物在不同肉芽肿区域的杀菌浓度分布，为抗结核药物研发提供关键数据支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 Paul O'Brien、Marizel Mina 和 Isabella Freedman 在动物实验方面的协助，感谢美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）的 Jacquie Gonzalez 和 Danielle Weiner 在激光显微切割前对兔组织进行γ射线照射的帮助，以及 Jansy Sarathy 在论文撰写方面的思路与建议。本研究得到了比尔及梅琳达·盖茨基金会（OPP1174780）和美国国立卫生研究院共享仪器资助项目（1S10OD018072）的资金支持。我们感谢 Eliseo A. Eugenin 提供使用 Leica LMD 6500 显微镜的机会，并分享专业知识与建议。LMD 6500 显微镜的采购及后续维护由美国国家精神卫生研究所资助项目 MH096625、国家神经疾病与中风研究所 NS105584、PHRI 资金（资助对象：E.A.E）以及葛兰素史克（GSK）的资助（资助对象：E.A.E）共同支持。

所有动物实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行，并获得美国国立过敏与传染病研究所（NIAID，NIH）动物实验管理和使用委员会（IACUC）的批准，贝塞斯达，马里兰州。
1. 动物实验与组织采集
本方案的这一部分描述了在生物安全三级（BSL3）条件下进行的动物实验操作与样本采集。详细的操作流程如下： 结核分枝杆菌 此前已描述过兔子的气溶胶感染程序及药物给药方案11,12.
<ol>
	<li>使用仅暴露鼻腔的气溶胶系统，按照先前所述方法11，感染4至5月龄的新西兰白兔（雄性和雌性），菌株为M. tuberculosis HN878。</li>
	<li>通过选定的给药途径给予实验药物（本示例中为乙胺丁醇），并在给药后2、6和24小时处死动物。首先，通过肌肉注射给予每公斤体重35 mg的氯胺酮和每公斤体重5 mg的赛拉嗪进行麻醉。等待10分钟后，通过夹捏尾巴和轻触眼睛来确认麻醉效果。若无反应，则以每4.5 kg体重1 mL的剂量，在2 mL无菌生理盐水中静脉注射戊巴比妥和苯妥英钠（见材料表）实施安乐死。 
	注意：这些时间点最适合覆盖乙胺丁醇的药代动力学曲线，若研究其他药物可能需要调整或优化。</li>
	<li>使用镊子、剪刀和/或手术刀从胸腔中取出肺组织，切除包含大型坏死性肉芽肿的肺组织活检样本，确保周围保留未受累的肺组织（如先前所述3）。坏死性肉芽肿呈浅 beige 色，通常略微突出于周围红色或粉红色的肺组织。为便于冷冻切片，确保活检组织大小不超过2 × 1.5 × 1.5 cm。</li>
	<li>使用镊子将活检组织放置于预先标记好的冷冻模具托盘上，使所需切面直接接触托盘底部。冷冻后，该接触面将形成一个平整的表面，用于后续冷冻切片。</li>
	<li>在液氮蒸气中冷冻活检组织。将液氮倒入泡沫塑料容器中，深度约2英寸，并放入金属丝网架。网架应高出液氮表面，提供一个可放置组织托盘的平坦平台。盖上容器盖子，将组织放置其中冷冻10分钟，确保完全冻结。</li>
	<li>取出组织托盘，迅速用铝箔包裹，放入单独标记的可密封塑料袋中并封口。转移至-80 °C冰箱中保存。 
	注意：步骤1.1至1.6均在BSL3条件下进行（包括所有动物操作以及感染器官和组织的处理）。肺组织活检样本需经3兆拉德伽马射线照射，以允许在BSL3 containment之外进行操作。若已建立批准的安全规程，可在BLS3设施内对未灭菌组织进行激光捕获显微切割。然而，本方案其余部分描述的是在BSL-2实验室中进行的后续处理步骤。</li>
</ol>
2. 组织切片
<ol>
	<li>将冷冻切片机设定至所需的切片温度。将经γ射线辐照的肺活检组织从-80 °C储存环境中转移至冷冻切片机中，静置30分钟以平衡组织温度。注意：TB病灶活检组织的最佳切片温度为-20至-22 °C。</li>
	<li>使用镊子将活检组织固定在冷冻切片机的样品头（chuck）上，用少量最佳切割温度粘合剂（OCT）将组织底部粘附于样品头。调整组织方向，使与冷冻模具底面接触的平坦面朝上，作为切片时的暴露表面。确保OCT不污染组织表面，以免干扰后续的质谱分析。</li>
	<li>切取三片厚度为25 µm的组织切片，并贴附于PET膜载玻片上。轻轻将膜接触组织切片后移开。若施加压力过大，可能导致薄膜破裂。
	<ol>
		<li>在贴附前应避免过度操作载玻片，否则会导致PET膜带电，影响组织切片的贴附效果。确保膜载玻片保持在室温条件下，以利于组织的解冻贴附及成功粘附。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载玻片从冷冻切片机中取出，静置空气中干燥3分钟。若不立即进行显微切割-液相色谱/串联质谱（LCM-LC/MS/MS）分析，应将载玻片密封于小型密封袋中，并转移至-80 °C保存，待后续切割使用。</li>
	<li>切取相邻的另一组织切片，厚度为10–12 µm，并解冻贴附于标准玻璃载玻片上，用于苏木精-伊红（H&amp;E）染色及对照。此时也可根据需要切取额外切片，用于其他组织化学染色（如用于观察结核分枝杆菌（MTB）的Ziehl-Neelsen染色）。</li>
</ol>
3. 显微解剖
<ol>
	<li>从 -80 °C 保存环境中取出装有切片的密封袋，置于室温下平衡 5 分钟。 
	注意：若低温切片立即暴露于实验室环境中，组织表面将产生冷凝水，可能导致药物空间完整性的破坏。</li>
	<li>开启显微镜和激光器（激光器需预热 5 - 10 分钟后方可开始切割）。将平盖 0.20 mL PCR 管装入样品架中。</li>
	<li>从密封袋中取出切片，使用平板扫描仪对 PET 切片上的组织切片进行光学成像。</li>
	<li>将切片放入切片架中（组织面向下），并通过显微镜软件为特定的肉芽肿感兴趣区域分配独立的收集管。通常包括“未受累肺组织”、“细胞型肉芽肿”和“干酪样坏死中心”（坏死中心），但具体区域可根据肉芽肿/活检样本的病理特征进行调整。</li>
	<li>使用 5X 显微镜物镜对组织进行聚焦。该放大倍数可提供包含细胞区和坏死区在内的组织整体视野。在软件中选择标记为“干酪样坏死”的收集管，使其移动至组织下方对应位置。</li>
	<li>输入所需的切割参数。对于 25 µm 厚的肺组织切片，典型设置为激光功率 30、速度 15、孔径 35（任意单位）。然而，具体参数可能因所用显微镜型号及激光器使用年限导致的功率衰减而有所不同。</li>
	<li>选择“自由绘制”工具，使用鼠标或触控笔勾画出目标切割区域。软件将显示所选区域的表面积。为便于切割操作，建议单个区域面积不超过 500,000 µm2（0.5 mm2）。重复切割过程，直至收集管盖中累计收集面积达到 3 百万 µm2（3 mm2）。
	<ol>
		<li>偶尔，切割后的组织区域可能因静电吸附等原因仍粘附于周围膜上，未能落入收集管盖中。此时应在软件中手动选择并移除该区域，以从累计表面积中剔除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择“细胞型病灶”对应的管盖，按照步骤 3.7 所述方法收集总计 3 百万 µm2 的组织。</li>
	<li>选择“未受累肺组织”对应的管盖，同样按照步骤 3.7 所述方法收集 3 百万 µm2 的组织。需注意，未受累肺组织中含有大量细支气管和肺泡腔隙，在定义切割区域时应仔细排除这些结构。</li>
	<li>取下管盖架，小心取下每个管盖，密封并贴上标签。避免周围气流（如开门引起的空气扰动）影响切割后的组织样本。应立即进行后续分析，或于 -80 °C 保存，并在处理及 LCMS 分析前解冻。</li>
</ol>
4. 提取与液相色谱-质谱分析
<ol>
	<li>配制含有乙胺丁醇-d10内标物的1:1乙腈/甲醇提取溶液。选择内标物时，应使用分析物药物的稳定同位素标记形式（如本实验中使用的氘代EMB），其质量位移应足够大，以避免分析物药物与内标物之间发生同位素串扰（通常至少为4道尔顿）。 
	注意：由于可用于制备匀浆标准品的对照组织非常有限，因此很难通过各类相应组织的匀浆液来制备标准品。作为向加标匀浆样品中制备标准品的替代方法，可通过将空白组织与待测化合物混合后进行提取来制备标准品。将与研究样本组织切片目标体积相匹配的一定体积的对照组织，直接与相当于某一特定浓度下所含待测化合物的量混合。</li>
	<li>根据组织切片的表面积和厚度计算目标组织体积，并根据将加入标准品和质控样品的匀浆液体积，确定匀浆液所需的稀释倍数。以下以3百万µm2（3 mm2）的目标切割面积、25 µm厚度以及2 µL匀浆液体积为例说明计算过程。 
	<img alt="组织体积计算公式：\( \text{体积} = \text{面积} \times \text{厚度} \)。公式表达式。" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程1"> 
	<img alt="目标组织体积计算；公式；数学方程；体积换算过程。" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程2"> 
	<img alt="匀浆液稀释倍数公式：匀浆液体积 ÷ 目标体积，用于溶液配制。" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程3"> 
	<img alt="匀浆液稀释倍数公式，2 µL ÷ 0.075 µL = 26.67，计算过程。" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程4"></li>
	<li>假设组织密度为1 g/mL，通过称取50 mg对照组织并加入PBS缓冲液稀释，配制匀浆储备液（使用步骤4.2中计算出的26.67倍匀浆稀释倍数，稀释液体积为1.283 mL）。在珠磨匀浆仪上以1750 rpm转速对肺组织和PBS缓冲液进行珠磨匀浆5分钟。 
	<img alt="稀释计算公式：(匀浆稀释倍数-1)×对照组织体积=稀释液体积。" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程5"> 
	<img alt="稀释计算公式，利用质量和体积换算系数将mg转换为mL。" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程6"></li>
	<li>将1 mg/mL的药物储备液用1:1乙腈/水稀释，配制用于标准曲线加标的标准溶液。根据加标体积和目标组织体积确定加标标准品的浓度。图示示例为使用10 µL加标体积配制100 ng/mL标准品。 
	<img alt="分析化学过程中加标浓度计算公式。" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程7"> 
	<img alt="稀释计算公式，浓度换算，单位除法，教学用示意图。" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程8"></li>
	<li>从-80 °C冰箱中取出含有显微切割组织的离心管，置于室温平衡5分钟。</li>
	<li>向含有显微切割组织的离心管中加入10 µL的1:1乙腈/水溶液和2 µL PBS缓冲液。</li>
	<li>对于标准曲线管和质控管，向2 µL对照肺匀浆液中加入10 µL加标溶液。</li>
	<li>向每根离心管中加入50 µL提取溶液。</li>
	<li>每根离心管涡旋振荡5分钟，超声处理5分钟，然后在5000 RPM下离心5分钟，使每管中形成薄膜和组织沉淀。</li>
	<li>将50 µL上清液转移至96孔深孔板中，并在每孔中额外加入50 µL去离子水进行稀释。</li>
	<li>采用针对乙胺丁醇和乙胺丁醇-d10内标物优化的仪器参数进行LC/MS/MS分析（具体参数如先前文献12中详细描述）。</li>
	<li>使用稀释倍数校正每个样本实际切割组织的精确量。 
	<img alt="稀释倍数公式：目标面积 ÷ 实际面积；用于科学计算的教学方程。" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程9"></li>
</ol>
5. 方法验证
<ol>
	<li>通过将1份肺组织、2份PBS缓冲液和3-4个钢珠混合，制备对照肺组织的匀浆。使用珠磨匀浆器以1750 rpm转速研磨肺组织和PBS缓冲液5分钟。</li>
	<li>向匀浆中加入10 µL浓度为1 mg/mL的乙胺丁醇DMSO储备液至990 µL匀浆中，使终浓度达到10,000 ng/mL（10 mg/mL），涡旋混匀1分钟。</li>
	<li>将匀浆倒入冷冻模具中，在干冰上快速冷冻5分钟，制备成冷冻匀浆块。</li>
	<li>按照步骤2.1-2.5所述方法，从匀浆块中制备厚度为25 µm的切片。</li>
	<li>按照步骤3.2-3.10中规定的方法分离目标组织区域。</li>
	<li>向含有显微切割组织的各管中加入10 µL乙腈/水（1:1）溶液和2 µL PBS缓冲液。</li>
	<li>向每根试管中加入50 µL提取液。按照步骤4.9-4.12建立标准曲线，并测定组织匀浆块中的药物浓度。</li>
	<li>使用以下公式计算提取效率： 
	<img alt="提取效率公式；药物浓度方程；实测浓度与加标浓度的比值。" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程10"></li>
</ol>

<ol><li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+of+anti-tuberculosis+drugs%3A+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li>
<li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desorption+electrospray+ionization+%28DESI%29+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li>
<li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li>
<li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li>
<li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%2C+laser+capture+microdissection%2C+and+LC-MS%2FMS+of+the+same+tissue+section%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li>
<li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics%3A+methodologies+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li>
<li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li>
<li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits%3A+A+failed+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016(2011).</li>
<li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li>
<li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li>
<li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

需要对肺结核病变内药物进行空间分辨的定量分析，以确定药物暴露是否达到对存在于不同病灶区域内的细菌群体具有杀菌作用的浓度。本文所述的激光捕获显微切割-液相色谱/质谱（LCM-LC/MS）方法仅需总共1至3张组织切片，即可实现对所有病灶区域（包括富含细菌的干酪样坏死物）中抗结核药物的绝对定量。传统的组织匀化及用于组织中药物定量的液相色谱/质谱（LC/MS）方法通常缺乏足够的空间特异性来区分特定的病灶区域；即使能够实现，手动提取过程中也极易导致细胞区域与坏死病灶区域之间的交叉污染。
LCM-LC/MS 方法相较于基于质谱成像的技术具有若干关键优势，其中最主要的是该方法具备完全定量的能力，以及由于通过色谱分离将药物与内源性干扰/抑制物质区分开，从而提高了LC/MS分析的灵敏度。然而，MALDI-MSI 能够提供更详细的药物分布空间信息。由于 MALDI-MSI 和 LCM-LC/MS/MS 均需相同的样品制备步骤来制备冷冻组织切片，因此这两种技术可对同一组织活检样本进行联用分析，既实现药物分布的高分辨率成像，又提供完整的定量数据。分析灵敏度要求更高的一个实例见于<strong class=...

能够对药物浓度进行空间分辨和定量，是确定抗结核药物是否以杀菌浓度到达肺部病灶内细菌亚群的关键要求1。尤为重要的是确定药物是否能够渗透至病灶的坏死核心（称为干酪样物质），该区域通常含有最多数量的杆菌，且由于缺乏血管化，药物可能难以进入。
评估病灶渗透的传统方法包括对切除的肺部病灶进行匀浆，随后通过溶剂萃取并结合液相色谱-质谱联用（LC/MS）分析，这些方法对目标药物具有高度的灵敏度和选择性。然而，这些方法的空间分辨率较差，仅限于原始匀浆组织的尺寸。基于质谱成像的技术，如基质辅助激光解吸电离（MALDI）2,3、解吸电喷雾电离（DESI）4 或液体增强表面萃取5,6，可提供高空间分辨率的成像能力，但由于分析物在不同类型细胞或组织中存在离子抑制效应的不均一性以及萃取效率的差异，直接定量极为困难甚至无法实现7。此外，大多数直接组织质谱成像方法由于缺乏对内源性物质的色谱分离（这些物质会竞争电离），以及药物从组织中溶剂萃取效率较低，其固有灵敏度通常低于LC/MS。
激光捕获显微切割（LCM）结合液相色谱-质谱（LC/MS）分析已常规用于分离和表征不同组织区域，以开展蛋白质组学研究8,9，并最近被用于药物暴露动物组织中的药物定量10。本文介绍了一种优化的实验方案，采用LCM结合LC/MS（LCM-LC/MS）分析技术，用于定量结核病（TB）药物在不同肉芽肿结构区室中的分布。在激光捕获显微切割过程中，紫外激光通过显微镜物镜聚焦至组织切片上，沿用户定义的路径切割并分离目标组织区域。对于重力辅助式LCM（本研究所采用的技术），组织切片被固定在一层薄的聚合物膜载玻片（PET或PEN）上，切割后的组织在载玻片下方的收集管帽中被捕获。随后从切除的组织中提取药物，并采用标准的LC/MS方法进行定量。所需收集的组织量最终取决于组织中预期的药物浓度以及LC/MS方法的检测灵敏度。对于以治疗剂量给药、并使用常规三重四极杆质谱仪分析的大多数药物而言，收集3百万µm2（3 mm2）的组织表面积已足够。
本方案描述了LCM-LC/MS技术所提供的空间分布分析与完全定量的强大结合，可提供结核肉芽肿各组分内的药物绝对浓度。该技术也可用于测定多种不同病变组织中的药物浓度，从而提供至关重要的药物发现与开发信息。

<table><tbody><tr><td>新西兰白兔</td><td>Covance</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 结核分枝杆菌</td><td>BEI 资源</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（Ketamine）100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased（赛拉嗪）100 mg/mL</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol（戊巴比妥钠和苯妥英钠）溶液</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>乙腈（LC-MS级）</td><td>Fisher</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（LC-MS级）</td><td>Fisher</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>甲酸（LC-MS 级）</td><td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>水（LC-MS级）</td><td>Fisher</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 平盖 PCR 管</td><td>康宁</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>钢架，聚对苯二甲酸乙二醇酯膜</td><td>徕卡</td><td>11505151</td><td></td></tr><tr><td>高级磨砂载玻片</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96深孔板 2.0 mL PP RB</td><td>Fisher</td><td>NC0363259</td><td></td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 色谱柱（4.6 × 50 mm；粒径，3.5 &amp;mu;m)</td><td>安捷伦</td><td>820631-001D</td><td></td></tr><tr><td>&quot;拉链&amp;rdquo; 密封样品袋</td><td>Fisher</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>已停止</td><td>Leica CM1860 是当前型号</td></tr><tr><td>激光显微切割系统 6500</td><td>Leica</td><td>已停止</td><td>Leica LMD 6 是当前型号</td></tr><tr><td>安捷伦 1260 Infinity II 高效液相色谱仪</td><td>安捷伦</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 QTRAP 质谱仪</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用激光显微切割液相色谱质谱法（lcm-lc/ms）对肺结核病灶中药物的空间分布进行定量分析

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

结核病至今仍是全球发病和死亡的主要原因之一。迫切需要改进现有的药物治疗方案并开发新的治疗方法。结核病药物能否有效到达肺部肉芽肿内血管分布稀少的坏死区域（干酪样物质）并杀灭其中的细菌，是治疗成功的关键。因此，有效的治疗方案必须包含能够良好穿透干酪样物质的药物。目前用于定量生物组织中药物浓度的液相色谱-质谱（LC/MS）方法空间分辨率有限，难以准确测定坏死性肉芽肿等微小组织区域内药物的绝对浓度。本文介绍了一种将激光显微切割技术（LCM）与LC/MS定量相结合的实验方案。该技术可对肉芽肿干酪样核心、周围细胞病变区域以及未受累肺组织中的药物进行绝对定量，从而准确判断是否达到了杀菌药物浓度。除结核病研究外，该技术还可广泛应用于其他疾病组织中药物的空间分辨定量分析。

LCM-LC/MS 方法的总体流程如图1所示。在通过γ射线辐照对组织进行灭菌后，所有后续步骤（从组织切片开始）均在非BSL3条件下进行。图2展示了结核病灶组织在激光显微切割分离前后的病变活检切片。通过直接观察光学图像，即可清晰识别并分离结核病灶中的坏死区域和细胞区域（无需参考相邻的组织学染色切片）。切割过程可实现干净的切缘，对周围组织扰动极小，从病灶中分离每个目标区域约3百万µm2（3 mm2）的面积，总耗时约为1小时。
采用添加乙胺丁醇（EMB）的肺组织匀浆评估LCM-LC/MS方法的提取效率与稳定性（表1）。结果显示药物被完全提取，在解剖与提取过程中未发现药物稳定性问题。通过与已建立的LC/MS定量方法在相同组织上的结果进行比较，进一步验证了LCM-LC...

本文介绍了一种结合激光捕获显微切割与液相色谱-质谱分析的技术方案，用于在肺结核肉芽肿内对药物分布进行空间定量。该方法具有广泛适用性，可实现对组织内药物浓度的高空间分辨率定量。

利用激光显微切割液相色谱质谱法（LCM-LC/MS）对肺结核病灶中药物的空间分布进行定量分析

结核病仍然是全球发病和死亡的主要原因。现有药物治疗方案的改进以及新型……

该分析技术的总体目标是定量测定结核病肺部病灶组织各区室中的抗结核药物乙胺丁醇含量，以确定是否达到了杀菌所需的药物浓度。该方法可通过判断给药后药物是否在肉芽肿所有组织区室中均达到灭菌浓度，从而解答结核病药物研发领域中的关键问题。该技术的主要优势在于，能够在特定组织结构和细胞群体中，以高空间分辨率全面定量药物浓度。该方法的可视化演示至关重要，因为组织切片和封片步骤较难掌握，容易发生组织污染，且膜载玻片本身较为脆弱。请按照文字版实验方案所述，首先进行组织采集。进行组织切片前，先将冷冻切片机设定至所需的切片温度。将经γ射线辐照的肺活检组织从–80摄氏度冰箱转移至冷冻切片机中，静置30分钟以平衡组织温度。使用镊子将活检组织固定在冷冻切片机的持样夹头上，用少量最佳切割温度包埋剂（OCT）将组织底部粘附于夹头。调整组织方向，使平坦面朝上，作为切片时的暴露表面。确保OCT包埋剂不污染组织表面，以免干扰后续的质谱分析。以25微米厚度切下三片组织切片，并贴附于PET膜载玻片上。轻轻将膜接触组织切片，然后取下切片。如果施加过大的压力，薄膜可能会撕裂。在安装前应避免过度操作载玻片，以免使PET膜带电，从而降低组织切片的黏附性。将膜载玻片保持在室温下，以实现冷冻贴附，并确保组织成功黏附于膜上。从冷冻切片机中取出载玻片，静置空气中干燥三分钟。若不立即进行激光显微切割-液相色谱-串联质谱（LCM-LC-MS/MS）分析，应将载玻片密封于小型密闭自封袋中，并转移至零下80摄氏度保存，直至需要进行显微切割。另切一张厚度为10至12微米的相邻切片，展于常规玻璃载玻片上，用于苏木精和伊红染色。此时可根据需要切取额外切片用于其他组织化学染色。将装有载玻片的密封袋从零下80摄氏度冰箱中取出，置于室温下5分钟，使其恢复至室温。若低温载玻片立即暴露于实验室环境中，组织表面将产生冷凝水，可能导致药物空间完整性的破坏。打开显微镜和激光器。激光器需要预热5到10分钟，之后才能开始切割。将平盖0.20毫升PCR管装入支架中。从袋子中取出载玻片后，使用平板扫描仪对 PET 载玻片上的组织切片进行光学成像。将载玻片放入载玻片架中，组织面朝下。利用显微镜软件为特定的肉芽肿感兴趣区域分配独立的收集管。通常，这些组织包括未受累的肺组织、细胞肉芽肿和干酪样坏死物，但具体成分可能因肉芽肿活检样本的特定病理情况而有所不同。使用5倍物镜对组织进行聚焦观察，此放大倍数可提供包含细胞区域和坏死性肉芽肿区域在内的组织整体概览。在软件中，选择标记为 caseum 的管子，将其移至组织下方的指定位置。输入所需的切片参数。对于厚度为 25 微米的肺组织切片，典型设置为激光功率 30、速度 15、孔径 35。然而，这些参数会因所使用的显微镜以及激光器使用时间较长导致的功率衰减而有所不同。选择自由绘制工具，然后使用鼠标或触摸屏笔勾画出需要解剖的区域。该区域的表面积将在软件中显示。为便于解剖操作，所选区域应保持在500,000平方微米以内。重复解剖过程，直至管盖中收集的总面积达到三百万平方微米。有时，解剖下来的组织可能仍附着在周围膜上，未能落入收集管盖中。在软件中通过手动选择并移除这些区域，将其从累积的表面积总量中扣除。接下来，选择细胞病变区域的采样帽，采用相同流程采集三百万平方微米的组织。然后选择未受累肺组织的采样帽，并使用相同流程采集三百万平方微米的组织。请注意，未受累的肺组织含有许多细支气管和肺泡腔。在划定解剖组织区域时，需仔细避免包含这些结构。取下帽架，小心地逐一解开夹子，封闭并标记每根导管。防止已解剖的组织受到周围空气流动的影响。应立即分析解剖后的组织，或在处理及进行液相色谱/质谱（LC/MS）分析前，将组织储存于负80摄氏度并解冻。假设组织密度为1克/毫升，通过称取50毫克对照组织并加入PBS缓冲液稀释，制备匀浆储备液。使用珠磨均质器在1750 rpm条件下，将肺组织与PBS缓冲液珠磨均质5分钟。接着，将浓度为1毫克/毫升的药物储备液用1:1的乙腈/水溶液稀释，以制备标准曲线加标溶液。根据加标体积和目标组织体积确定加标标准品的浓度。图示示例为使用10微升加标体积的100纳克/毫升标准品。将含有显微切割组织的离心管从-80摄氏度冰箱中取出，室温放置5分钟使其升至室温。向含有显微切割组织的离心管中加入10微升1:1的乙腈/水溶液和2微升PBS缓冲液。对于标准曲线和质控管，向2微升对照肺匀浆液中加入10微升加标溶液。向每根管中加入50微升提取液。将每根管涡旋振荡5分钟。然后，超声处理5分钟。接着，以5,000 rpm离心5分钟，使每管中形成薄膜和组织的沉淀。离心后，将50微升上清液转移至96孔深孔板中，并在每个孔中加入额外的50微升去离子水进行稀释。最后，按照文本方案中所述进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析及方法学验证。LCM-LC/MS 方法首先通过分析添加了乙胺丁醇的组织匀浆激光显微切割区域进行验证。如图所示，该方法具有高度可重复性，并表现出优异的药物回收率。通过LCM-LC/MS在多种肺组织中测得的乙胺丁醇浓度，进一步与已建立的LC/MS方法所测定的浓度进行直接比较以验证结果。两种技术检测到的浓度相当。利用LCM-LC/MS测定了正常肺实质、细胞病变边缘和坏死干酪样物质中的乙胺丁醇绝对浓度。所有病灶区室均达到了结核分枝杆菌的灭菌水平。图中显示了杀灭99%胞外复制菌和99%巨噬细胞内菌所需的最低药物浓度。观看本视频后，您应能够充分理解如何对组织进行显微解剖，并定量测定特定肺部肉芽肿结构内的药物浓度。该技术可使抗菌药物研究领域的研究人员能够准确且定量地评估给药后的药物是否已达到对目标病原体种群具有杀灭作用的浓度。该方法可广泛适用于多种不同组织和疾病状态。

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

激光捕获显微切割液相色谱质谱 (LCM-LC/MS) 对肺结核患者药物的空间量化

激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）是一种用于质谱分析的常压电离源。在成像模式下，中红外激光用于探测组织切片或生物膜中分子的空间分布。该技术为在接近天然实验条件下开展多种生物分析研究提供了一种新方法。...

大气压分子成像技术在生物组织和生物膜的激光烧蚀电喷雾电离质谱分析中的应用

在薄层器官和肿瘤组织上进行的激光诱导击穿光谱成功检测到了天然元素以及人工注入的钆（Gd），后者来源于基于钆的纳米颗粒。化学元素成像的空间分辨率达到100...

激光诱导击穿光谱：一种用于组织中纳米颗粒成像与定量的新方法

显微解剖已广泛用于组织内DNA、RNA和蛋白质的检测。激光捕获显微切割（LCM）是最常用的方法，但一种新的研磨技术——中解剖（mesodissection）最近也已出现。我们展示了从中解剖的结核分枝杆菌Mycobacterium...

一种用于回收的新型显微解剖方法 结核分枝杆菌 福尔马林固定石蜡包埋肺肉芽肿中的特异性转录本

本文介绍了一种高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）检测方法，用于定量干燥血斑中的免疫抑制剂他克莫司，该方法采用简单的手工蛋白质沉淀步骤及在线柱提取技术。...

使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量检测干血斑中的免疫抑制剂他克莫司

人类结核感染是一个复杂的过程，难以建立模型...

一种用于功能研究的3D人体肺组织模型 结核分枝杆菌 感染

本文介绍了一种快速平衡透析（RED）方法，用于测定药物与肺结核病灶及空洞中干酪样坏死物的结合。该方案也可用于泡沫状巨噬细胞来源基质，后者是干酪样坏死物的有效替代物。...

一个 体外 预测药物在结核病病灶中渗透性的酪蛋白结合测定法

本方案介绍了一种集成拉曼光谱-质谱（MS）平台，可实现单细胞分辨率。拉曼光谱可用于研究细胞对药物的响应，而质谱则可用于药物摄取与代谢的靶向定量分析。...

一种集成拉曼光谱与质谱技术的平台用于研究单细胞药物摄取、代谢及效应

目前用于分析患者对耐药结核病（DR-TB）复杂治疗方案依从性的方法可能存在不准确且资源消耗大的问题。我们的方法利用易于采集和保存的毛发样本，检测其中11种DR-TB药物的浓度。通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），可测定低至亚纳克水平的药物含量，从而更准确地评估患者的用药依从性。...

经验证的LC-MS/MS检测面板用于定量小份毛发样本中11种耐药结核病药物

本文介绍了一种提取多种分枝杆菌细胞壁总脂质含量的方案。此外，还展示了不同类型分枝菌酸的提取与分析方案。同时提供了一种薄层色谱法用于监测这些分枝杆菌化合物。...

通过薄层色谱法分析分枝杆菌的脂质组成

本方案描述了在锥虫感染期间生成代谢物分布三维模型的步骤，包括样品采集、代谢物提取、液相色谱-串联质谱数据采集概述、三维模型构建以及最终的数据可视化。...

研究锥虫感染的化学图谱学方法

本方案描述了一种高通量工作流程，利用人工智能对染色的薄组织切片图像中经病理学确认的兴趣区域进行分割，以通过激光显微切割富集组织学分辨的细胞群体。该策略包含一种新算法，可将标记感兴趣细胞群体的边界直接传输至激光显微镜。...

工业化的、人工智能引导的激光显微切割技术用于肿瘤微环境的微尺度蛋白质组学分析

学习激光捕获显微切割结合液相色谱质谱技术，用于肺结核病灶组织中乙胺丁醇药物的空间定量分析。该方法可精确测定药物在不同肉芽肿区域的杀菌浓度分布，为抗结核药物研发提供关键数据支持。

利用激光显微切割液相色谱质谱法（LCM-LC/MS）对肺结核病灶中药物的空间分布进行定量分析

探索更多视频