利用激光显微切割液相色谱质谱法（LCM-LC/MS）对肺结核病灶中药物的空间分布进行定量分析

该分析技术的总体目标是定量测定结核病肺部病灶组织各区室中的抗结核药物乙胺丁醇含量，以确定是否达到了杀菌所需的药物浓度。该方法可通过判断给药后药物是否在肉芽肿所有组织区室中均达到灭菌浓度，从而解答结核病药物研发领域中的关键问题。该技术的主要优势在于，能够在特定组织结构和细胞群体中，以高空间分辨率全面定量药物浓度。

该方法的可视化演示至关重要，因为组织切片和封片步骤较难掌握，容易发生组织污染，且膜载玻片本身较为脆弱。请按照文字版实验方案所述，首先进行组织采集。进行组织切片前，先将冷冻切片机设定至所需的切片温度。

将经γ射线辐照的肺活检组织从–80摄氏度冰箱转移至冷冻切片机中，静置30分钟以平衡组织温度。使用镊子将活检组织固定在冷冻切片机的持样夹头上，用少量最佳切割温度包埋剂（OCT）将组织底部粘附于夹头。调整组织方向，使平坦面朝上，作为切片时的暴露表面。

确保OCT包埋剂不污染组织表面，以免干扰后续的质谱分析。以25微米厚度切下三片组织切片，并贴附于PET膜载玻片上。轻轻将膜接触组织切片，然后取下切片。

如果施加过大的压力，薄膜可能会撕裂。在安装前应避免过度操作载玻片，以免使PET膜带电，从而降低组织切片的黏附性。将膜载玻片保持在室温下，以实现冷冻贴附，并确保组织成功黏附于膜上。

从冷冻切片机中取出载玻片，静置空气中干燥三分钟。若不立即进行激光显微切割-液相色谱-串联质谱（LCM-LC-MS/MS）分析，应将载玻片密封于小型密闭自封袋中，并转移至零下80摄氏度保存，直至需要进行显微切割。另切一张厚度为10至12微米的相邻切片，展于常规玻璃载玻片上，用于苏木精和伊红染色。

此时可根据需要切取额外切片用于其他组织化学染色。将装有载玻片的密封袋从零下80摄氏度冰箱中取出，置于室温下5分钟，使其恢复至室温。若低温载玻片立即暴露于实验室环境中，组织表面将产生冷凝水，可能导致药物空间完整性的破坏。

打开显微镜和激光器。激光器需要预热5到10分钟，之后才能开始切割。将平盖0.20毫升PCR管装入支架中。

从袋子中取出载玻片后，使用平板扫描仪对 PET 载玻片上的组织切片进行光学成像。将载玻片放入载玻片架中，组织面朝下。利用显微镜软件为特定的肉芽肿感兴趣区域分配独立的收集管。

通常，这些组织包括未受累的肺组织、细胞肉芽肿和干酪样坏死物，但具体成分可能因肉芽肿活检样本的特定病理情况而有所不同。使用5倍物镜对组织进行聚焦观察，此放大倍数可提供包含细胞区域和坏死性肉芽肿区域在内的组织整体概览。

在软件中，选择标记为 caseum 的管子，将其移至组织下方的指定位置。输入所需的切片参数。对于厚度为 25 微米的肺组织切片，典型设置为激光功率 30、速度 15、孔径 35。

然而，这些参数会因所使用的显微镜以及激光器使用时间较长导致的功率衰减而有所不同。选择自由绘制工具，然后使用鼠标或触摸屏笔勾画出需要解剖的区域。该区域的表面积将在软件中显示。

为便于解剖操作，所选区域应保持在500,000平方微米以内。重复解剖过程，直至管盖中收集的总面积达到三百万平方微米。有时，解剖下来的组织可能仍附着在周围膜上，未能落入收集管盖中。

在软件中通过手动选择并移除这些区域，将其从累积的表面积总量中扣除。接下来，选择细胞病变区域的采样帽，采用相同流程采集三百万平方微米的组织。然后选择未受累肺组织的采样帽，并使用相同流程采集三百万平方微米的组织。

请注意，未受累的肺组织含有许多细支气管和肺泡腔。在划定解剖组织区域时，需仔细避免包含这些结构。取下帽架，小心地逐一解开夹子，封闭并标记每根导管。

防止已解剖的组织受到周围空气流动的影响。应立即分析解剖后的组织，或在处理及进行液相色谱/质谱（LC/MS）分析前，将组织储存于负80摄氏度并解冻。假设组织密度为1克/毫升，通过称取50毫克对照组织并加入PBS缓冲液稀释，制备匀浆储备液。

使用珠磨均质器在1750 rpm条件下，将肺组织与PBS缓冲液珠磨均质5分钟。接着，将浓度为1毫克/毫升的药物储备液用1:1的乙腈/水溶液稀释，以制备标准曲线加标溶液。根据加标体积和目标组织体积确定加标标准品的浓度。

图示示例为使用10微升加标体积的100纳克/毫升标准品。将含有显微切割组织的离心管从-80摄氏度冰箱中取出，室温放置5分钟使其升至室温。向含有显微切割组织的离心管中加入10微升1:1的乙腈/水溶液和2微升PBS缓冲液。

对于标准曲线和质控管，向2微升对照肺匀浆液中加入10微升加标溶液。向每根管中加入50微升提取液。将每根管涡旋振荡5分钟。

然后，超声处理5分钟。接着，以5,000 rpm离心5分钟，使每管中形成薄膜和组织的沉淀。离心后，将50微升上清液转移至96孔深孔板中，并在每个孔中加入额外的50微升去离子水进行稀释。

最后，按照文本方案中所述进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析及方法学验证。LCM-LC/MS 方法首先通过分析添加了乙胺丁醇的组织匀浆激光显微切割区域进行验证。如图所示，该方法具有高度可重复性，并表现出优异的药物回收率。

通过LCM-LC/MS在多种肺组织中测得的乙胺丁醇浓度，进一步与已建立的LC/MS方法所测定的浓度进行直接比较以验证结果。两种技术检测到的浓度相当。利用LCM-LC/MS测定了正常肺实质、细胞病变边缘和坏死干酪样物质中的乙胺丁醇绝对浓度。

所有病灶区室均达到了结核分枝杆菌的灭菌水平。图中显示了杀灭99%胞外复制菌和99%巨噬细胞内菌所需的最低药物浓度。观看本视频后，您应能够充分理解如何对组织进行显微解剖，并定量测定特定肺部肉芽肿结构内的药物浓度。

该技术可使抗菌药物研究领域的研究人员能够准确且定量地评估给药后的药物是否已达到对目标病原体种群具有杀灭作用的浓度。该方法可广泛适用于多种不同组织和疾病状态。