Name: 成人耳皮肤全安装共焦显微术: 一种研究神经血管分支形态发生和免疫细胞分布的模型系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学习全安装共焦显微术用于研究小鼠耳皮肤神经血管分支形态发生和免疫细胞三维分布。该方法可揭示神经血管结构异常与炎症机制，为神经生物学、血管生物学和免疫学研究提供重要工具。

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感谢 K. Gill 提供的实验室管理和技术支持，感谢 J. Hawkins 以及美国国立卫生研究院（NIH）50 号楼动物设施的工作人员在小鼠饲养方面提供的帮助，感谢 R. Reed 和 F. Baldrey 提供的行政支持。同时感谢 S. Motegi 和 M. Udey 分享耳部皮肤解剖方案，感谢 N. Burns 提供的编辑协助，以及干细胞与神经血管生物学实验室成员提供的技术支持和富有见地的讨论。T. Yamazaki 得到了日本促进科学振兴会（JSPS）NIH-KAITOKU 项目的资助。本研究由美国国家心肺血液研究所（HL005702-11 至 Y.M.）的院内研究计划资助。

本节中的所有实验均经国家心肺血液研究所（NHLBI）动物护理与使用委员会批准进行。
1. 成年小鼠耳部皮肤采集
<ol>
	<li>将成年小鼠置于密闭容器中，通过二氧化碳（CO2）暴露实施安乐死，随后通过颈椎脱位确认死亡。 
	注：本实验遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于安乐死方法的指南。</li>
	<li>从基部解剖取下耳朵，并将其置于一个含有2 mL汉克斯平衡盐溶液（HBSS）的35 × 10 mm2培养皿中。用剪刀简单修剪毛发。</li>
	<li>小心地将耳后皮肤和耳前皮肤从中间的软骨上剥离。 
	注：软骨附着于耳前皮肤。</li>
	<li>将耳后皮肤和耳前皮肤分别转移至24孔板中，每孔加入1 mL冰上预冷的新鲜4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS），并将皮肤在4% PFA中展平。</li>
	<li>在4 °C条件下，用含软骨的耳后和耳前皮肤固定1小时。</li>
	<li>在室温下，用1 mL PBS轻轻振荡洗涤耳后和耳前皮肤，每次5分钟，共洗涤3次。</li>
	<li>将带软骨的耳后和耳前皮肤转移至35 × 10 mm2培养皿底部。剪除折叠的基部区域，该区域含有脂肪组织和结缔组织。使用精细弯头镊子将软骨从耳前皮肤上剥离。</li>
	<li>使用精细弯头镊子小心去除耳后皮肤内侧的毛发、脂肪组织和结缔组织。保持皮肤湿润，随时滴加PBS。</li>
</ol>
2. 小鼠耳部皮肤整体免疫组织化学染色
注意：以下各节中的所有实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）实验室安全指南进行。
<ol>
	<li>配制封闭缓冲液。使用 0.45 µm 滤器单元过滤含 0.2% 吐温 X-100（TX-100）的 PBS 中稀释的 10% 热灭活山羊血清（HIGS）封闭缓冲液，或含 0.2% TX-100 的 PBS 中稀释的 10% 驴血清（DS）封闭缓冲液。</li>
	<li>将后侧和前侧皮肤转移至 24 孔板中，每孔加入 1 mL 含 10% HIGS 的封闭缓冲液或含 10% DS 的封闭缓冲液。在室温下轻轻混匀孵育 30 分钟。</li>
	<li>将一抗（材料表）用封闭缓冲液（含 10% HIGS 或 10% DS）稀释，配制一抗溶液。 
	注：使用针对泛神经元标记物神经元特异性 III 类 β-微管蛋白（Tuj1，兔多克隆 IgG 或小鼠单克隆 IgG2a，最终浓度 2 µg/mL，1:500 稀释）、泛内皮细胞标记物血小板内皮细胞黏附分子 1（PECAM-1，仓鼠单克隆 IgG，最终浓度 3.3 µg/mL，1:300 稀释）、髓鞘标记物髓鞘碱性蛋白（MBP，兔多克隆 IgG，最终浓度 5 µg/mL，1:200 稀释）以及炎性髓系细胞标记物 CD11b（大鼠单克隆 IgG2b，最终浓度 20 µg/mL，1:50 稀释）的抗体对成年耳部皮肤进行整体免疫组织化学分析的结果如图 1和图 2所示。皮肤与 Cy3 标记的血管平滑肌细胞标记物 α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）抗体以及二抗（2.6）共同孵育。我们自行测试过的一抗列于材料表中。可同时混合来自不同物种的多种一抗。</li>
	<li>将后侧和前侧皮肤转移至新孔&#160;中，每孔加入 150 µL 一抗溶液。在 4 °C 下轻轻混匀孵育过夜。</li>
	<li>次日，将后侧和前侧皮肤转移至 24 孔板中的新孔，或用移液器完全吸除含一抗的封闭缓冲液。每孔加入 1 mL 含 0.2% TX-100 的 PBS 中稀释的 2% HIGS 洗涤缓冲液，或含 0.2% TX-100 的 PBS 中稀释的 2% DS 洗涤缓冲液。在室温下轻轻混匀，每隔 15 分钟更换一次洗涤缓冲液，共洗涤 3 次。</li>
	<li>配制&#160;二抗溶液（材料表）。将二抗用封闭缓冲液（含 10% HIGS 或 10% DS）稀释，并通过连接 1 mL 注射器的 0.22 µm 聚偏氟乙烯（PVDF）膜注射滤器过滤含二抗的封闭缓冲液。 
	注：使用 Alexa 488 或 633 标记的 goat anti-rabbit IgG (H+L) 或 mouse IgG2a 检测 Tuj1，Alexa 647 标记的 goat anti-hamster IgG (H+L) 检测 PECAM-1，Alexa 488 标记的 goat anti-rabbit IgG (H+L) 检测 MBP，以及 Alexa 594 标记的 rat IgG (H+L) 检测 CD11b，稀释比例均为 1:250，最终浓度为 8 µg/mL。皮肤与 Cy3 标记的 αSMA 抗体（1:500 稀释，最终浓度 2–3 µg/mL）与上述二抗共同孵育。</li>
	<li>以 13,000 x g 离心 10 分钟，从封闭缓冲液中去除二抗的聚集颗粒。 
	注：可同时混合来自不同物种的不同荧光标记二抗。</li>
	<li>将后侧和前侧皮肤转移至含 150 µL 二抗溶液的孔&#160;中。用铝箔包裹 24 孔板以避光，在室温下轻轻混匀孵育 1 小时。</li>
	<li>将后侧和前侧皮肤转移至 24 孔板中的新孔，或用移液器完全吸除二抗溶液。每孔加入 1 mL 2% HIGS 洗涤缓冲液或 2% DS 洗涤缓冲液。</li>
	<li>用铝箔包裹 24 孔板，在室温下轻轻混匀，每隔 15 分钟更换一次洗涤缓冲液，共洗涤 3 次。</li>
</ol>
3. 将耳部皮肤切片固定在载玻片上
<ol>
	<li>将皮肤放置在35 × 10 mm2 培养皿底部。在体视显微镜下使用精细弯头镊子，在低光照条件下小心去除皮肤内侧的毛发、脂肪组织、结缔组织、灰尘和纤维，以尽量减少过度的光漂白。用PBS保持皮肤湿润。</li>
	<li>用镊子将皮肤转移至载玻片上。将皮肤的后端和前端内侧朝上放置在载玻片上，并用镊子将其展平。</li>
	<li>将皮肤封片于液体抗荧光淬灭封片剂中，以防止光漂白并保存荧光信号。确保皮肤表面及周围无气泡。</li>
	<li>小心地在皮肤样本上加盖盖玻片，并将封片后的皮肤样本载玻片于室温避光过夜，使封片介质充分固化。用指甲油将盖玻片密封固定于载玻片上，长期保存时置于4 °C环境中。</li>
</ol>
4. 共聚焦显微镜
<ol>
	<li>为荧光染料设置适当的激光器。本实验使用配备三种激光源（氩离子激光器 488 nm、DPSS 激光器 561 nm 和 HeNe 激光器 633 nm）的共聚焦显微镜。</li>
	<li>使用顺序扫描工具同时激发三重染色样本，以避免和减少信号重叠。 
	注意：图像将采用顺序扫描模式依次采集。</li>
	<li>使用 10X 物镜进行成像。利用拼图扫描工具捕获整个耳部皮肤，设置 Z 轴层扫，并确保 Z 轴位置覆盖耳部皮肤的完整厚度。</li>
</ol>

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li>
<li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature%3A+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li>
<li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons%3A+looking+for+innervation+in+all+the+right+places%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749(2014).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Whole+Mount%3A+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick%2C+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540(2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li>
<li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li>
<li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li>
<li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoriasis%3A+what+we+have+learned+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li>
<li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+challenges+of+chronic+wounds%3A+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li>
<li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24615439">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了用于分析神经血管结构和免疫细胞分布的成年小鼠耳部皮肤全组织免疫组织化学成像方法。我们认为，该方法在研究分支形态发生、外周神经和血管的模式形成，以及包括免疫细胞和毛囊在内的皮肤组分的三维分布方面，具有多种实验优势。成像结果可通过图像分析软件进行量化，以进一步开展定量分析。
正确制备耳部皮肤对该实验方案的成功至关重要。首先，应在小鼠安乐死后尽快仔细解剖耳部皮肤。需将耳部皮肤的后侧从软骨上剥离。随后，在染色前应将软骨从前侧皮肤上完全剥离。其次，在封片前应轻柔而彻底地去除结缔组织、脂肪组织和毛发。由于皮肤表面存在外周神经，因此需小心操作以避免损伤神经。第三，应通过去除部分较厚的组织使耳部皮肤充分展开。最后，耳部皮肤应平整封片，避免产生气泡。
该方案的一个局限性在于，带有耳标穿孔的耳部皮肤不适合用于分析，因为耳标会造成孔洞或疤痕。因此，当需要分析多只小鼠时，必须采用除耳标以外的其他方法对小鼠进行识别，例如在尾部进行标记。
虽然已有文献报道可以使用高分辨率对感兴趣区域进行...

皮肤由三层组成：表皮、真皮和皮下组织。皮肤已被用作研究干细胞在发育过程中的维持、分化和形态发生，以及成体中的再生、肿瘤发生和炎症的模型系统。皮肤富含血管和神经支配，使得周围神经系统和血管系统的发育能够高度协调。
我们此前已展示了一种用于研究完整外周神经和血管（包括其细胞成分）的多重标记整体胚胎皮肤成像技术1,2,3,4：感觉轴突、交感轴突、神经中的施万细胞、血管中的内皮细胞、周细胞以及血管平滑肌细胞（VSMCs）。在血管生成过程中，初级毛细血管网络经历强烈的血管重塑，进而发育形成具有层级结构的血管分支网络。在发育中的真皮/皮下组织中，动脉沿外周感觉神经分支，而静脉则在动脉旁侧形成。当层级血管网络被VSMCs充分包绕后，交感神经随之沿大直径血管延伸并实现神经支配1,5,6。尽管发育中的神经系统与血管系统之间存在密切关联具有重要意义，但一个关键的科学问题仍是：在成人各种病理状态下，神经-血管网络会发生怎样的变化？要深入理解其发病机制，必须借助三维高分辨率成像技术，结合在解剖学上可识别的分支形态发生过程与模式特征进行分析。
成年小鼠皮肤中的神经和血管形态发生通常通过组织切片染色进行分析。其他研究则采用皮肤全层成像技术，以观察外周神经和血管，以及毛囊、皮脂腺和立毛肌7,8,9。然而，由于成年皮肤较厚，难以对其全层深度进行完整分析。
在本研究中，我们开发了一种新型的高分辨率全组织成像方法，用于成年小鼠耳部皮肤，以克服上述挑战。耳部皮肤易于解剖，并可对其全层进行完整的全组织成像。因此，该方法简便且具有高度可重复性，可用于比较皮肤中周围神经和血管系统的三维结构，并实现全面的定量分析。我们证实，在成年皮肤中，周围感觉神经和交感神经与大直径血管的排列关系得以保留。本实验方案的目标是在不同条件下（如炎症和再生），于细胞水平上可视化成年小鼠模型中周围神经和血管的分支形态发生、分布模式以及免疫细胞的分布情况。

<table><tbody><tr><td>10 倍磷酸盐缓冲液</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS，不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS，含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA，固定剂，用 PBS 稀释</td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>封闭/洗涤缓冲液组分</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>封闭/洗涤缓冲液组分</td></tr><tr><td>弯头精细镊子</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>滤器单元 0.45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>用于过滤</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>用于过滤</td></tr><tr><td>注射器滤器单元 0.22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>用于过滤</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td><td>抗荧光淬灭封片剂</td></tr><tr><td>指甲油</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td>用于封固</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>图像编辑软件</td></tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>图像编辑软件</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>图像处理软件</td></tr><tr><td>抗 PECAM-1 (CD31) 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>仓鼠 IgG，血管内皮细胞标志物，1:300</td></tr><tr><td>抗 PECAM-1 (CD31) 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>大鼠 IgG2a κ，血管内皮细胞标志物，1:300</td></tr><tr><td>与 Cy-3 偶联的抗-&amp;#945;SMA 抗体</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>小鼠 IgG2a，血管平滑肌细胞标志物，1:500</td></tr><tr><td>抗 EphB1 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>山羊多克隆，静脉内皮细胞标志物，1:100</td></tr><tr><td>抗神经元特异性 III 类 &amp;#946;-微管蛋白 (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1，兔多克隆 IgG，全轴突标志物，1:500</td></tr><tr><td>抗 Tuj1 抗体</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>小鼠 IgG2a，全轴突标志物，1:500</td></tr><tr><td>抗 MBP 抗体</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>兔多克隆 IgG，髓鞘形成标志物，1:200</td></tr><tr><td>抗酪氨酸羟化酶抗体</td><td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>兔多克隆，交感神经元标志物，1:500</td></tr><tr><td>抗周围蛋白抗体</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>兔多克隆，外周神经元标志物，1:1000</td></tr><tr><td>抗 CD11b 抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>大鼠 IgG2b，炎症细胞标志物（巨噬细胞），1:50</td></tr><tr><td>抗 CD45 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>大鼠 IgG2b κ，全造血细胞标志物，1:500</td></tr><tr><td>抗 CD3 抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>大鼠 IgG1，免疫细胞标志物，1:100</td></tr><tr><td>抗 CD45R (B220) 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>大鼠 IgG2a κ，炎症细胞标志物，1:200</td></tr><tr><td>抗 GFP 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>兔多克隆，1:300</td></tr><tr><td>抗 GFP 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>鸡多克隆，1:500</td></tr><tr><td>抗-&amp;#946;-半乳糖苷酶抗体</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>兔多克隆，1:5000</td></tr><tr><td>抗 RFP 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>兔多克隆，1:300</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG (H+L) Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>兔多克隆二抗，1:250</td></tr><tr><td>驴抗仓鼠 IgG (H+L) Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>仓鼠多克隆二抗，1:250</td></tr><tr><td>驴抗大鼠 IgG (H+L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno research</td><td>112-585-167</td><td>大鼠多克隆二抗，1:250</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG2a Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>小鼠 IgG2a 二抗，1:250</td></tr></tbody></table>

成年耳部皮肤全组织共聚焦显微镜观察：研究神经-血管分支形态发生及免疫细胞分布的模型系统

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

本文介绍了一种用于研究成年小鼠耳部皮肤全组织三维神经-血管分支形态发生与模式形成以及免疫细胞在细胞水平上分布情况的全组织成像技术方案。对成年组织中周围神经和血管解剖结构的分析，有助于深入理解伤口愈合等病理条件下功能性神经-血管连接及神经-血管退行性变化的机制。作为一种信息丰富的模型系统，我们选择易于解剖获取的成年耳部皮肤作为研究对象。本方案操作简便且可重复，能够精确呈现整个皮肤组织中的各类细胞成分，包括周围神经（感觉轴突、交感轴突和施万细胞）、血管（内皮细胞和血管平滑肌细胞）以及炎性细胞。我们相信，该技术方案将为研究不同病理条件下成年耳部皮肤中周围神经与血管的形态学异常以及炎症反应提供重要途径。

对成年小鼠耳后皮肤（图1A）和耳前皮肤（图1B）进行免疫染色，所用抗体包括αSMA（红色）、Tuj1（绿色）和PECAM-1（蓝色）。耳后皮肤使用CD11b（红色）和MBP（绿色）抗体，联合Tuj1（蓝色）进行免疫染色，以研究神经-免疫分布情况（图2A）。在单细胞分辨率下检测到CD11b+炎症细胞（包括巨噬细胞）的分布（图2B）。
<img alt="耳后和耳前皮肤血管结构；荧光显微镜图像；αSMA、TuJ1、PECAM-1。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57406/57406fig1.jpg" data-altupdatedat="17882...

本文介绍了一种针对成年小鼠耳部皮肤全组织的高分辨率整体成像方法，该方法能够实现对外周神经和血管的分支形态发生及模式形成的可视化观察，同时可展示免疫细胞的分布情况。

本文介绍了一种用于研究完整三维神经-血管分支结构的成年小鼠耳部皮肤全组织成像技术方案。

本实验的总体目标是可视化外周神经和血管的分支形态发生及其分布模式，以及免疫细胞的分布情况。该方法有助于解答神经生物学、血管生物学和免疫学领域的关键问题，通过揭示外周神经和血管的形态学异常以及炎症反应。该技术的主要优势在于，我们能够在外周神经、血管和皮肤中完整深度地观察其细胞组分，并可对外周神经系统和血管系统的三维结构进行比较分析。该方法可用于研究从幼年到成年小鼠在正常和病理条件下的神经-血管结构及免疫细胞分布。根据文本方案处死成年小鼠后，从基部解剖取出耳朵，并将其置于含有两毫升 HBSS 的 35 毫米 × 10 毫米培养皿中。随后，用剪刀短暂修剪毛发。小心地将后侧和前侧皮肤从中间的软骨上剥离下来。将每块皮肤分别转移至24孔板中，每孔加入1毫升冰上预冷的新鲜4% PFA（溶于PBS中）。然后，将皮肤在PFA中展平。接下来，在 4 摄氏度条件下，将带有软骨的后侧和前侧皮肤固定 1 小时。然后，在室温下用 1 毫升 PBS 轻柔混悬洗涤皮肤 3 次，每次 5 分钟。将带有软骨的皮肤转移至一个 35 乘 10 毫米的培养皿底部。使用精细的弯头镊子从腹侧皮肤上剥离软骨。然后，切除基部区域，该区域呈折叠状，并含有脂肪组织和结缔组织。用同一把镊子小心地从背侧皮肤内面去除毛发、脂肪组织及结缔组织。使用 PBS 保持皮肤湿润。进行整体免疫组织化学染色时，将后部和前部皮肤转移至 24 孔板中，每孔加入 1 毫升含 10% 热灭活血清的封闭缓冲液。在室温下轻轻混匀孵育 30 分钟。根据文本方案所述，用封闭缓冲液稀释一抗，并向孔中加入150 µL含一抗的封闭缓冲液。然后，将后侧和前侧皮肤转移至含有一抗的新孔中。在4 °C条件下轻轻混匀，孵育过夜。次日，在将皮肤转移至新孔或吸除一抗后，加入1 mL含2%血清和0.2%Triton X-100的PBS溶液。在室温下轻轻混匀孵育15分钟以洗涤样本。重复此洗涤步骤两次。同时，将二抗加入10%封闭缓冲液中，并使用连接1毫升注射器的0.22微米PVDF膜注射器滤器过滤抗体溶液。以13,000 × g离心10分钟，去除二抗在封闭缓冲液中形成的聚集体，随后将150微升含二抗的封闭缓冲液加入新的孔中。将皮肤转移至含有二抗的孔中。用铝箔纸包裹24孔板以避光，并在室温下轻轻混匀孵育皮肤一小时。加入一毫升2%血清洗涤缓冲液。然后，将后侧和前侧皮肤转移至含有洗涤缓冲液的孔中。用封口膜包裹培养板，在室温下轻轻混匀孵育15分钟，洗涤样本。重复洗涤两次。将皮肤置于35 mm × 10 mm的培养皿底部。然后，在体视显微镜下以低光照条件操作，以尽量减少光漂白现象。使用精细的弯镊小心地从皮肤内侧去除毛发、脂肪组织、结缔组织、灰尘和纤维。用 PBS 保持皮肤湿润。用镊子将后侧和前侧皮肤转移至一张粘性载玻片上，使组织内侧朝上。使用镊子将皮肤展平。将皮肤置于液体防淬灭封片

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

成人耳皮肤全安装共焦显微术: 一种研究神经血管分支形态发生和免疫细胞分布的模型系统

我们介绍了一种用于分析小鼠胚胎肢部皮肤中复杂血管网络形成的全胚免疫组织化学结合多重标记激光扫描共聚焦显微镜技术。...

胚胎肢皮肤血管系统的整体免疫组织化学分析：研究胚胎血管分支形态发生的一种模型系统

在伤口愈合、炎症和肿瘤发生过程中，细胞外基质会发生显著的重塑。本文介绍一种新型的活体免疫荧光显微技术，可利用落射荧光或双光子显微镜，以高空间和时间分辨率可视化纤维状以及网状基质成分的动态变化。...

长期活体免疫荧光成像技术用于观察组织基质成分：基于落射荧光与双光子显微镜的方法

落射荧光显微镜，双光子显微镜，活体成像，免疫荧光，细胞外基质，胶原蛋白，基底膜，组织重塑，肿瘤微环境，炎症，纤维化

哺乳动物的皮肤包含多种结构——如毛囊和神经末梢——这些结构具有独特的空间分布模式。将皮肤作为平铺标本进行分析，可利用该组织的二维几何特性，获得皮肤结构的全层高分辨率图像。...

小鼠皮肤平铺成像及其在毛囊排列模式与感觉轴突形态分析中的应用

我们介绍了一种分离成年耳蜗柯蒂器官的方法，可获得完整的三个耳蜗回（顶回、中回和底回）。同时，我们还展示了使用荧光标记抗体进行免疫染色的操作步骤。结合这些技术，可对耳蜗中的毛细胞、支持细胞及其他细胞类型进行研究。...

成年小鼠耳蜗的全组织解剖与免疫荧光染色

调控效应CD4+ T细胞在炎症部位间质迁移的机制尚不明确。我们提出一种非侵入性方法，用于可视化观察并操控 体外-引发的CD4 T细胞在炎症耳部真皮中的动态行为研究 原位.

成像炎症真皮中CD4 T细胞的间质迁移

本文介绍了一种新型制备方法，用于在使用苯乙烯基吡啶鎓染料进行染色和脱色过程中，对支配小鼠耳部皮肤毛囊的梭形感觉末梢的板状末梢进行活体成像。...

活体毛囊梭形末梢神经末梢标记的光学监测 离体 小鼠耳部皮肤

本方案描述了利用磁夹钳在小鼠耳部皮肤上建立缺血-再灌注（IR）模型的方法。通过使用自行构建的活体成像模型，我们开展研究 体内...

在小鼠耳部皮肤诱导缺血-再灌注损伤以进行活体多光子成像观察免疫反应

无毛SKH1-Hrhr小鼠的耳部模型可在无需预先手术准备受检微血管床的情况下，实现微循环的活体荧光显微观察以及光毒性血栓的诱导。因此，无毛小鼠耳部是研究微血管血栓形成过程中复杂相互作用、血栓演变及溶栓过程的理想体内模型。...

活体显微成像及无毛小鼠耳lobe血栓诱导

活体显微成像，血栓形成，无毛小鼠，耳lobe，血管生物学，血小板聚集，微循环

鸡是一种经济、易得且广泛可用的模式生物，适用于多种研究。本文详细描述了一系列实验方案，旨在揭示禽类内耳发育与再生的分子机制。...

In Ovo 与 Ex Ovo 研究禽类内耳发育的方法

该方案介绍了一种利用倒置共聚焦显微镜简化活体成像的新工具。...

简化的小动物活体成像方法用于倒置共聚焦显微镜下长期监测上皮组织动态变化

本方案面向小鼠内耳组织的初学者，全面详述了针对不同发育阶段的小鼠内耳组织进行切片免疫染色的处理步骤。...

冷冻切片与免疫染色小鼠内耳组织：从胚胎期到成年期

学习全安装共焦显微术用于研究小鼠耳皮肤神经血管分支形态发生和免疫细胞三维分布。该方法可揭示神经血管结构异常与炎症机制，为神经生物学、血管生物学和免疫学研究提供重要工具。

成年耳部皮肤全组织共聚焦显微镜观察：研究神经-血管分支形态发生及免疫细胞分布的模型系统

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