成人耳皮肤全安装共焦显微术: 一种研究神经血管分支形态发生和免疫细胞分布的模型系统

该程序的总体目标是可视化周围神经和血管的分支形态发生和模式，以及免疫细胞分布。这种方法可以通过阐明周围神经和血管的形态异常以及炎症来帮助回答神经生物学、血管生物学和免疫学领域的关键问题。这项技术的主要优势在于，我们可以在整个深度上可视化皮肤中周围神经、血管和免疫细胞的细胞成分，并且可以比较神经和血管系统的三维结构。

该方法可以深入了解正常和病理条件下幼年至成年小鼠的神经脉管系统结构和免疫细胞分布。根据文本方案对成年小鼠实施安乐死后，从基部解剖耳朵，并将其放入含有 2 毫升 HBSS 的 35 x 10 毫米培养皿中。然后，用剪刀短暂修剪毛发。

后部和前部皮肤从中间的软骨上剥离。将每个皮肤切片分别转移到 24 孔板中，每孔含有 1 毫升冰冷的新鲜 4% PFA PBS 溶液。然后，将 PFA 中的皮肤弄平。

接下来，用 4 摄氏度的软骨固定后皮肤和前皮肤 1 小时。然后，用 1 毫升 PBS 清洗皮肤 3 次，每次 5 分钟，并在室温下轻轻混合。将带有软骨的皮肤转移到 35 x 10 毫米培养皿的底部。

使用细弯曲的镊子从前皮肤上剥下软骨。然后，切掉折叠并具有脂肪和结缔组织的基部区域。使用相同的镊子，小心地从后皮肤内部去除毛发、脂肪组织和结缔组织。

使用 PBS 保持皮肤湿润。要进行整体免疫组织化学染色，请将后部和前部皮肤转移到每孔含有 1 毫升 10% 热灭活血清封闭缓冲液的 24 孔板中。在室温下轻轻混合孵育皮肤 30 分钟。

如文本方案中所述，在封闭缓冲液中稀释一抗，并在封闭缓冲液中加入 150 μL 一抗。然后，将后部和前部皮肤转移到含有一抗的新孔中。在 4 摄氏度下轻轻混合孵育皮肤过夜。

第二天，将皮肤转移到新孔或吸出一抗后，加入 1 毫升 2% 血清的含 0.2%Triton X-100 的 PBS 溶液。在室温下轻轻混合洗涤样品 15 分钟。再重复洗涤两次。

同时，在 10% 封闭缓冲液中制备二抗，并通过连接到 1 毫升注射器的 0.22 微米 PVDF 膜注射器过滤器过滤抗体溶液。将溶液以 13， 000 倍重力离心 10 分钟，以去除封闭缓冲液中二抗的聚集颗粒，将封闭缓冲液中的 150 μL 二抗添加到新孔中。将皮肤转移到含有二抗的孔中。

24 孔板包裹在铝箔中以保护其避光，并在室温下轻轻混合孵育皮肤 1 小时。加入 1 毫升 2% 血清洗涤缓冲液。然后，将后部和前部皮肤转移到含有洗涤缓冲液的孔中。

包裹板，在室温下轻轻混合洗涤样品 15 分钟。再重复洗涤两次。将皮肤放在 35 x 10 毫米培养皿的底部。

然后，在低照度的体视显微镜下，为了尽量减少光漂白，使用细弯曲的镊子小心地去除皮肤内部的毛发、脂肪组织、结缔组织、灰尘和纤维。使用 PBS 保持皮肤湿润。用镊子将后部和前部皮肤移植到粘性显微镜载玻片上，内侧朝上。

使用镊子将皮肤弄平。将皮肤封片在液体抗褪色封片剂中，以避免光漂白并保留荧光信号。确保皮肤上或周围没有气泡。

将染色的皮肤样品载玻片在室温下避光存放过夜，以使封固剂变硬。然后，使用指甲油将盖玻片密封到载玻片上，并在 4 摄氏度下储存以长期储存。要进行共聚焦显微镜检查，请为荧光团设置适当的激光器。

本实验中使用了具有三个激光源的共聚焦显微镜。在 10 倍物镜下对样品进行成像，并使用顺序扫描工具，该工具可同时激发三重染色样品，以避免和减少任何重叠。在本实验中，用 α-SMA 、 Tuj1 和 PECAM-1 抗体对成年小鼠后耳皮肤和前耳皮肤进行免疫染色。

使用 CD11b 和 MBP 抗体以及 Tuj1 对后皮肤进行免疫染色以研究神经免疫分布。最后，如图所示，在单细胞分辨率下检测到 CD11b 阳性炎症细胞（包括巨噬细胞）的分布。在尝试此程序时，重要的是要记住小心处理您的皮肤，并在安装前轻柔缓慢地去除耳皮肤内部的毛发、脂肪组织和结缔组织。

这项技术将为研究人员研究周围神经和血管的分支形态发生和模式，以及皮肤成分的三维分布铺平道路，包括幼年到成年小鼠模型中的免疫细胞。感谢观看。祝你的实验好运。