Name: 405 Nm 激光微辐照对 DNA 损伤的蛋白质招募研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 学习使用405纳米激光共聚焦显微镜诱导局部DNA双链断裂的方法，并自动量化DNA修复因子动态。该技术利用U2OS细胞实时监测荧光标记蛋白的招募过程，为研究DNA损伤响应动力学和修复机制提供可靠工具。

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本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会 [A.M. 的发现基金 5026 号] 以及加拿大癌症研究学会的下一代科学家奖学金 [A.M. 的 21531 号] 资助。我们感谢 Jean-François Lucier 在 Fiji Python 脚本的质量控制以及统计分析建议方面提供的帮助。我们感谢 Stephanie A. Yazinski 博士提供免疫荧光固定液配方。我们感谢 Paul-Ludovic Karsenti 在激光功率测量方面的协助。

1. 细胞预致敏
<ol>
	<li>在微辐照实验前24小时，将40,000个U2OS细胞接种至含10%胎牛血清（FBS）的1×DMEM培养基中，每孔接种于8孔培养载玻片，该载玻片底部为170 µm厚的类盖玻片玻璃/聚合物材质，以确保405 nm激光的透射率最大化，并在激光扫描倒置共聚焦显微镜下获得优良成像效果。若使用8孔微载玻片，则在本方案后续所有处理及洗涤步骤中，每孔使用500 µL培养基或溶液。 
	注意：由于U2OS细胞具有扁平形态、良好的贴壁性以及较大的细胞核，有利于检测蛋白质在微辐照位点的募集，但也可根据需要使用其他贴壁细胞类型。理想情况下，微辐照时细胞汇合度应约为80%，以增加每次实验中被辐照的细胞数量。过高的汇合度可能导致细胞周期改变，从而干扰特定修复通路（如同源重组修复），后者发生在细胞周期的S期和G2期9。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜，随后用（步骤1.3）BrdU或（步骤1.4）BBET（Hoechst 33342）对细胞进行预致敏处理。 
	注意：为观察目的蛋白（POI）在DNA损伤位点的实时募集，可在细胞接种后24小时转染或转导携带荧光蛋白与目的蛋白融合基因的质粒DNA。转染/转导后24小时，对细胞进行预致敏处理并实施微辐照，以实时监测目的蛋白在DNA损伤位点的募集情况。</li>
	<li>为增加暴露于405 nm激光后产生的双链断裂（DSB）数量，在微辐照前24小时向培养基中加入10 µM BrdU。微辐照前，使用微量移液器以无酚红培养基冲洗细胞两次，以确保细胞对405 nm激光的暴露最大化。</li>
	<li>或者，在37 °C细胞培养孵箱中，用适量培养基配制10 µg/mL的BBET处理细胞15分钟。处理结束后，在微辐照前用无酚红培养基冲洗两次。</li>
</ol>
2. 细胞的微照射
<ol>
	<li>选择合适的激光扫描共聚焦显微镜。 
	注意：本文所述实验在配备50 mW 405 nm激光器和63倍油镜（数值孔径1.4）的显微镜系统上进行。为诱导DNA双链断裂（DSBs），细胞在1倍扫描缩放、每场图像分辨率为1,024 × 1,024像素的条件下接受显微照射0.21 µm/pixe63倍放大倍数下）以及单向模式中 8 µs/pixel. BBET预致敏细胞和BrdU预致敏细胞所用的激光功率分别为25%和80%。为帮助用户配置系统，根据制造商说明，使用功率计测量了本系统中物镜后的激光功率。测得BBET预致敏细胞和BrdU预致敏细胞对应的功率分别为2.6 mW和7.0 mW。</li>
	<li>打开显微镜和环境培养箱。
	<ol>
		<li>将培养箱设置为 37 °C 含5% CO2 在将样品放入载物台培养箱之前进行操作，以避免对细胞造成不必要的应激，并确保各实验间DNA损伤反应（DDR）动力学的一致性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择细胞分布均匀的视野，调节焦距，并记录其位置，以便在免疫荧光实验流程后进行图像采集。至少采集一张作为损伤前参考的图像，用于监测微辐照后蛋白招募的动力学过程。 
	注意：也可使用带网格的培养容器，以利于在后续步骤中定位经微辐照的细胞。
	<ol>
		<li>对于使用 BBET 标记细胞的免疫荧光实验，应使用 405 nm 激光在足以观察到细胞的最低激光功率下调节焦距，以避免不必要的 DNA 损伤。
		<ol>
			<li>避免使用宽场荧光调焦BBET染色的细胞，因为光源发出的紫外光会在照射位点诱导DNA损伤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>若使用BrdU标记的细胞，可通过观察核仁等核内结构，利用微分干涉差（DIC）或相差成像调节焦距。</li>
		<li>若使用表达荧光标记的感兴趣蛋白（POI）的细胞，应选择具有代表性荧光强度的焦平面。 
		注意：避免选择表达目的蛋白（POI）水平过高的细胞，因为强烈过表达可能导致人为的定位假象。此外，应选择POI表达水平相近的细胞（强烈建议筛选稳定克隆，以最大程度减少POI表达水平和招募水平的差异）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用系统的荧光漂白后恢复（FRAP）模块，将显微镜配置为微辐照步骤。 
	注意：进行显微照射实验时，设置显微镜系统需考虑的最重要参数包括：405 nm 激光的输出功率、迭代次数即， 激光在同一坐标点扫描的次数），每视野像素数（在63倍放大倍数和1,024 × 1,024分辨率下，1像素 = 0.21 µm），以及每个像素的停留时间。所有这些因素都会影响细胞所承受的能量，从而影响所产生的DNA损伤的数量和类型（参见 讨论 有关进一步的剂量优化信息）。</li>
	<li>使用显微镜系统的FRAP模块对细胞进行微辐照。 
	注意：在大多数系统中，可在同一视野内对多个细胞进行微照射，照射形式可为点状或线状/矩形（通常为1-2 µm 宽）。在损伤后立即对荧光标记蛋白进行活细胞成像时，应将微辐照范围限制在每个视野中的少数细胞，因为逐个细胞进行微辐照所需的时间将导致DNA损伤应答（DDR）的诱导延迟。当监测那些被迅速招募至DNA损伤位点的蛋白质时，这一点尤为重要。</li>
	<li>显微照射后，将多孔玻片或培养板放回培养箱中 37 °C 含5% CO2 在处理样本进行免疫荧光（第5节）之前，需维持所需时间，或立即进行活体成像（第3节）。
	<ol>
		<li>作为第一步，在照射后数分钟至数小时内，对细胞进行固定以用于免疫荧光（IF）实验。根据目的蛋白（POI）的不同，其招募动力学会有所差异。通常，与DNA双链断裂（DSBs）和单链断裂（SSBs）相关的染色质蛋白会迅速定位于损伤位点，有时在5分钟内即被清除。而某些因子（例如在单链DNA上组装的蛋白）则会在DNA末端切除机制启动后的较晚时间点被招募，并可在此类位点持续存在数小时（参见 图1 和对照4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 荧光标记蛋白的活体成像
<ol>
	<li>对显微照射后的细胞进行延时成像。对于迅速被招募至损伤位点的蛋白质，每帧数秒的间隔较为理想；而对于较晚定位于损伤区域的蛋白质，例如，切除因子），可每隔1–2分钟采集一次数据，直至达到平台期。 
	注意：为尽量减少光漂白，并确保损伤位点处的蛋白募集未达到饱和（否则将影响信号定量及后续分析，参见第4节数据分析部分），在图像采集时应尽量降低激光功率。在所展示的系统中，成像采用63X/1.4油镜物镜进行 8 µs/pixe停留时间 l，分辨率 1,024 × 1,024，放大倍数 1×，平均次数为 2。请注意，这些参数可能需要根据其他系统和/或不同的实验进行优化。</li>
	<li>在额外的视野中对细胞进行微辐照，直至获得15–30个细胞的动力学数据。以至少3次生物学重复实验重复该过程，以确保招募动力学的准确性和可重复性。 
	注意：在将本方案适配于特定共聚焦系统时，可先监测已知荧光标记的基因组维持因子的招募动力学，这可能有助于优化实验条件例如53BP1-GFP、RPA32-GFP 等等。利用活细胞成像优化微辐照条件，可使用户快速测试多种参数。</li>
</ol>
4. 召集动力学分析
<ol>
	<li>在 Fiji 图像分析软件11中安装 Microirradiation Analysis 插件10。</li>
	<li>在 Fiji 中打开获取的图像。从 Microirradiation Analysis 套件的下拉插件菜单中选择“The Damage Analyzer”。根据提示，在每个微辐照细胞中定义一个背景感兴趣区域（ROI）（通常为 3 × 3 µm），以及非辐照和辐照的 ROI。
	<ol>
		<li>使用相同大小的 ROI，以尽量减少平均信号强度中的潜在偏差。对于获取的图像，还需包含至少一个辐照前的帧，该帧将用作基线，以监测微辐照位点的蛋白招募情况。</li>
		<li>在完整的时间序列中收集所有 ROI 数据后，将插件生成的结果文件保存为 csv（逗号分隔文件）或 txt 文件（制表符分隔文件）。该文件包含每个时间点及每个 ROI 的平均强度测量值（背景平均强度、非辐照平均强度和辐照平均强度）。 
		注意：插件会自动从辐照 ROI 的强度（Is）和非辐照 ROI 的强度（In）中减去背景强度（Ib）。同时计算这两个值之间的比值（见下式），以校正光漂白效应（辐照/非辐照）。 
		<img alt="使用强度符号进行光谱数据分析的吸收比方程示意图" src="/files/ftp_upload/57410/57410eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
		插件还会计算每个细胞核中第一个时间点（设定为 1）与所有其他时间点之间的归一化比值（相对于第一个时间点的比值）。更多详细信息可参见插件官网10。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对所有微辐照细胞（至少 15–30 个细胞）使用该插件进行分析，并绘制微辐照区域随时间变化的平均相对富集曲线。计算每个数据点的平均值标准误，并在图中表示。
	<ol>
		<li>通过在每个数据点进行 Student's t-检验，确认两种实验条件下招募动力学的差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 免疫荧光实验方案
<ol>
	<li>配制免疫荧光溶液。在锥形聚丙烯管中配制预/后提取液（含0.25% Triton X-100的冰浴1×PBS）、洗涤液（含0.05% Tween-20的1×PBS）、封闭液（含3% BSA和0.05% Tween-20的1×PBS）以及固定液（含3% 甲醛和2% 蔗糖的1×PBS）。 
	注意：单个8孔微型载玻片需要10 mL预/后提取液、50 mL洗涤液、10 mL封闭液和5 mL固定液。
	<ol>
		<li>制备固定液。
		<ol>
			<li>在化学通风橱中，将400 mL双蒸水（ddH₂O）与600 mL异丙醇混合。2O）加入15 g多聚甲醛并 30 µL 1 L 锥形瓶中的 10 N NaOH</li>
			<li>关闭容器并在指定温度下加热 65 °C 在磁力搅拌器加热板上边搅拌边溶解，直至完全溶解多聚甲醛。</li>
			<li>使用25 mL移液管加入50 mL 10X PBS，搅拌，并用以下方法过滤 0.45 µm 过滤器</li>
			<li>加入10 g蔗糖，用ddH₂O定容至500 mL2O.</li>
			<li>将溶液分装至15 mL锥形管中；于-20 °C 直至使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过将1 mg/mL的4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）储存液用1×PBS按1:1,000比例稀释，制备细胞核染色液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用微量移液器小心吸出多孔显微镜载片或培养板各孔中的培养基，立即用 500 µL 用洗涤液更换两次，无需等待，完成IF洗涤。 
	注意：此处展示的免疫荧光（IF）数据来自生长于8孔显微镜载片中的细胞，细胞经洗涤后进行孵育 500 µL 所有溶液的体积应根据实验人员使用的细胞培养容器进行调整。此外，进行免疫荧光（IF）实验时需格外小心，因为细胞容易从玻璃或聚合物底部脱落。所有溶液更换均应使用微量移液器操作，以尽量减少细胞损失。</li>
	<li>冰上孵育5分钟 500 µL 加入冰冷的IF预/后提取溶液，用手轻轻涡旋15–30秒，以进行预提取步骤，去除大部分细胞质和核质蛋白，从而最大化染色质/DNA相关因子的信号。</li>
	<li>用……洗涤两次 500 µL IF洗涤液</li>
	<li>室温孵育15分钟 500 µL 使用IF固定液。或者，在固定步骤中使用市售的多聚甲醛溶液（3–4%）。</li>
	<li>用……洗涤两次 500 µL IF洗涤液</li>
	<li>冰上孵育5分钟 500 µL 加入冰冷的IF预/后提取液，用手轻轻晃动载玻片以完成透化步骤。</li>
	<li>用……洗涤两次 500 µL IF洗涤液</li>
	<li>在室温下孵育至少30分钟 500 µL 的IF封闭液。</li>
	<li>使用微量移液器移除封闭液，并在湿盒中于4°C孵育过夜 4 °C 与 250 µL 用封闭液稀释一抗。 
	注意：建议依次孵育一抗，以避免共定位可能出现的假象。在完成适当的对照实验后，可同时孵育一抗以加快实验进程。</li>
	<li>洗涤4次，每次5分钟 500 µL 用温和振荡（旋转器上60 rpm）的IF洗涤液洗涤。</li>
	<li>37 °C孵育1小时 37 °C 与 250 µL 在湿盒中用封闭液稀释二抗。 
	注意：加入荧光标记的二抗后，需避免样品暴露于光线下。</li>
	<li>每次5分钟，共洗涤四次 500 µL 用温和振荡的IF洗涤液进行洗涤。</li>
	<li>室温孵育5分钟 500 µL 含1x PBS的 1 µg/mL DAPI 染色细胞核。</li>
	<li>用……洗涤两次 500 µL 1×PBS 中，并将细胞置于其中 500 µL 用于成像的1× PBS溶液</li>
	<li>使用带网格的载玻片或定位的载物台位置，利用一种特征明确的DNA损伤标志物来识别微辐照的细胞（例如γ-H2A.X，RPA32 等等。).</li>
	<li>使用激光扫描共聚焦显微镜，在适当的设置下对多孔培养板或培养滑片进行所有相关通道的成像。 
	注意：在所示系统中，成像使用63X/1.4油镜物镜进行 8 µs/pixe停留时间 l，分辨率 1,024 × 1,024，放大倍数 1X，平均次数为 2。请注意，这些参数可能需要根据其他系统和/或不同的实验进行优化。</li>
</ol>

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<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li>
<li>Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-regulated+poly%28ADP-ribosyl%29ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li>
<li>Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+proteomics+reveals+a+%CE%B3H2AX-53BP1+interaction+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).</li>
<li>Soultanakis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+of+8-oxoguanine+in+nuclear+and+mitochondrial+DNA+of+cultured+cells+using+a+recombinant+Fab+and+confocal+scanning+laser+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

采用上述方法，对经BBET或BrdU预致敏的贴壁人细胞进行405 nm激光微辐照，可在细胞核内实现包括DNA双链断裂（DSB）在内的局部DNA损伤。这些DSB处的DNA损伤应答（DDR）动力学特征与其他方法在真核细胞中诱导的DSB相似9,18,19。微辐照位点处的DSB切除可产生单链DNA（ssDNA），可通过靶向RPA32的抗体或RPA32-GFP融合蛋白进行示踪。另一方面，染色质相关因子的定位可借助γ-H2A.X作为参照标志。某些染色质相关因子从初始DSB位点扩散的程度可能不及γ-H2A.X，因而呈现为点状焦点，且可能与结合ssDNA的蛋白质焦点在位置上相互分离。
一旦双链断裂（DSBs）形成，即可通过固定细胞的免疫荧光（IF）检测损伤位点处蛋白质的招募与清除情况。开展此类实验仅需针对目标蛋白（POI）的合适IF抗体。若缺乏适用于IF的抗体，可构建携带目的基因与特定表位标签同框融合的质粒<em...

细胞 constantly 暴露于威胁其基因组完整性的内源性和外源性 DNA 损伤因素中。DNA 损伤应答（DDR）是一组信号通路，能够识别、传递信号并修复 DNA 损伤，以维持基因组稳定性。在 DNA 双链断裂（DSBs）处，DDR 主要发生在两个互补的平台上：γ-H2A.X 标记的染色质和一段通常被单链 DNA 结合复合物 RPA 包被的单链 DNA（ssDNA）区域1,2。
预先用胸腺嘧啶类似物5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）或双苯并咪唑乙氧三盐酸盐（BBET，Hoechst 33342）DNA染料致敏的细胞，经紫外激光微辐照后，会产生包括单链断裂（SSBs）和双链断裂（DSBs）在内的多种DNA损伤，从而在染色质和单链DNA（ssDNA）两个平台上引发局部的DNA损伤应答（DDR）3,4。先前的研究表明，利用高能量紫外A波段激光（335–365 nm）结合免疫荧光技术（IF），可区分基因组维持因子在DSB处这两个不同平台上的招募过程2,5。配备此类激光器的显微镜成本较高，因其需要高能量激光源以及专用的紫外A透射物镜，因此在学术机构和制药环境中远不如配备405 nm激光线的激光扫描共聚焦显微镜普遍。此外，由于描述基因组维持因子动态行为需要繁琐的手动图像分析，限制了对微辐照位点蛋白质招募与交换过程的研究。
本文展示了通过 BrdU 或 BBET 核酸染料对细胞进行预致敏，随后在普通共聚焦显微镜上使用 405 nm 激光进行微辐照，可实现对 DNA 损伤位点处基因组维持因子动态的实时监测。结合使用 γ-H2A.X 或 RPA 复合物亚基作为平台标记物，辅以 z 轴层扫以获得更大的景深，并通过去卷积技术提高分辨率，实验者能够区分被局部招募至 DNA 双链断裂（DSB）位点的因子与扩散至初始损伤周围大范围染色质区域的因子。根据不同的核内区域进行此类亚分类，有助于进一步明确被招募至微辐照位点但功能尚未明确的蛋白质的潜在作用。此外，我们提供了便捷的实验方案和优化的分析流程，可利用开源软件 Fiji（ImageJ 的一个发行版本）快速分析基因组维持因子的动态行为6,7,8。这些对现有微辐照技术的改进使得 DNA 损伤应答（DDR）研究几乎可在任何实验室条件下开展。

<table><tbody><tr><td>奥林巴斯 FLUOVIEW FV3000 共振激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV3000 软件（版本 2.1）</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>405 nm 激光器</td><td>相干</td><td></td><td>辐射源</td></tr><tr><td>显微镜培养箱 AIO-UNO-OLYUS-1</td><td>Okolab</td><td>OKO-UNO-1</td><td></td></tr><tr><td>60倍/1.4 物镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>油浸物镜</td></tr><tr><td>载玻片式八孔培养板（X-well）</td><td>Sarstedt</td><td>94.6190.802</td><td></td></tr><tr><td>人骨肉瘤U2OS细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>稳定细胞系&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>注意：有毒</td></tr><tr><td>5-溴-2&amp;prime;-脱氧尿苷&amp;nbsp;(BrdU)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59-14-3</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>注意：有毒</td></tr><tr><td>双苯并咪唑 H 33342 (Hoechst 33342)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 胰蛋白酶 EDTA&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>TRX777.100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME 转染试剂&amp;nbsp;</td><td>Polyplus</td><td>114-07</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的ProLong Diamond抗荧光淬灭封片剂&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X，含酚红</td><td>维森特&amp;nbsp;</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X，不含酚红</td><td>Wisent</td><td>319-051-CL</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Wisent&amp;nbsp;</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗RPA32抗体</td><td>Abcam</td><td>ab2175</td><td>1:500 用于免疫荧光</td></tr><tr><td>兔抗-&amp;gamma;- H2A.X 抗体</td><td>细胞信号传导&amp;nbsp;</td><td>9718S</td><td>免疫荧光实验中按1:500稀释</td></tr><tr><td>兔抗53BP1抗体</td><td>细胞信号传导&amp;nbsp;</td><td>4937S</td><td>免疫荧光实验中按1:500稀释</td></tr><tr><td>兔抗PRP19抗体</td><td>Abcam</td><td>ab27692</td><td>免疫荧光实验中1:500稀释比例</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG Alexa Fluor 647</td><td>细胞信号传导&amp;nbsp;</td><td>4414S</td><td>1:250 用于免疫荧光</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠&amp;nbsp; IgG Alexa Fluor 488&amp;nbsp;</td><td>细胞信号传导&amp;nbsp;</td><td>4408S</td><td>1:250，用于免疫荧光</td></tr><tr><td>Fiji 图像分析开源软件&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc</td></tr><tr><td>1918-K 功率计&amp;nbsp; 使用918D-SL-0D3传感器</td><td>纽波特</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用405 nm激光显微照射技术研究蛋白质向dna损伤位点的招募

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

DNA损伤应答（DDR）利用大量蛋白质来检测、传递信号并修复DNA损伤。阐明这一应答过程对于理解基因组维持机制至关重要。由于蛋白质在损伤位点的招募和交换具有高度动态性，对其研究需要能够快速且在空间上精确地诱导DNA损伤的方法。本文描述了利用常见的配备405 nm激光线的激光扫描共聚焦显微镜，在人类细胞中局部诱导DNA损伤的实验步骤。可通过免疫荧光（IF）或使用荧光标记蛋白进行实时观察，来评估基因组维持因子在激光划痕区域的富集情况。以磷酸化组蛋白H2A.X（γ-H2A.X）和复制蛋白A（RPA）作为标志物，该方法具有足够的分辨率，可区分在损伤局部招募的因子与扩散至邻近染色质的因子。此外，我们还提供了基于ImageJ的脚本，用于高效监测蛋白质在DNA损伤位点重定位的动力学过程。这些优化显著简化了对DDR动态过程的研究。

显微照射后，根据基因组维持蛋白的性质，让细胞恢复特定的一段时间1,12双链断裂（DSBs）将被核酸酶加工处理，这一过程在细胞周期的S期和G2期尤为显著，从而产生有限长度的单链DNA区域，该区域会迅速被RPA及其他基因组维持因子所结合。9该单链DNA区域周围是染色质，其在DNA损伤应答（DDR）过程中发生广泛修饰，以调控其他DDR因子的招募与交换。13. 可通过免疫荧光（IF）监测蛋白质向微辐照区域的募集图1A）。通常，染色质相关因子（例如γ-H2A.X，53BP1 等等。可在较早时间点（1–5 分钟）检测到，而单链 DNA 结合蛋白的出现则较晚（≥10 分钟），因为需要核酸酶介导的双链断裂末端切除以生成 RPA-单链 DNA 平台。为便于图像分析与发表，我们开发了一个...

研究DNA损伤修复动力学需要一种能够在细胞核内特定区域诱导损伤的系统。本文介绍一种利用配备405 nm激光器的激光扫描共聚焦显微镜在局部产生双链断裂的方法，并提供自动化流程，用于定量分析修复因子在这些损伤位点的动力学行为。

利用405 nm激光显微照射技术研究蛋白质向DNA损伤位点的招募

DNA损伤应答（DDR）利用大量蛋白质来检测、传递信号并修复DNA损伤。阐明这一应答机制对于理解……至关重要

本实验的总体目标是利用广泛可用的405纳米激光扫描共聚焦显微镜产生局部DNA双链断裂，并提供自动化方法以定量分析DNA修复因子在这些损伤位点的动态行为。该方法可用于确定特定蛋白质是否被招募至DNA双链断裂位点，并阐明调控其在DNA损伤部位富集的信号通路。该技术利用常见的共聚焦显微镜系统在局部诱导DNA损伤。这使得几乎所有实验室都能研究DNA损伤反应的动力学。若需监测荧光标记蛋白的实时招募情况，请进行瞬时转染，或筛选稳定表达目标蛋白与荧光报告蛋白融合体的细胞系。在进行显微照射实验前24小时，将每孔40,000个U2OS细胞接种于含10% FBS的DMEM 1X培养基中，接种至八孔培养载玻片，其底部为170微米厚、类似盖玻片的玻璃聚合物材质。在37摄氏度、5% CO2条件下将细胞孵育过夜。为增加405纳米激光照射诱导的双链断裂数量，向细胞中加入BBET，使其在适当培养基中的终浓度为10微克/毫升。在37摄氏度的细胞培养孵箱中处理细胞15分钟。显微照射前，使用微量移液器用不含酚红的培养基冲洗细胞两次，以确保细胞充分暴露于405纳米激光下。任何配备405纳米激光器的共聚焦显微镜均可用于该方法。使用者需仔细校准系统，以达到生理水平的DNA损伤。我们将在详细方案中介绍如何进行此操作。选择配备405纳米激光器的合适激光扫描共聚焦显微镜。开启显微镜和环境培养箱。选择细胞分布均匀的视野，调节焦距，并记录其位置，以便在免疫荧光实验后进行图像采集。如果使用荧光标记蛋白进行活细胞成像，需至少采集一张图像作为损伤前的参考点，以监测微辐照后蛋白的招募动力学。对于使用BBET标记细胞的免疫荧光实验，应使用405纳米激光在足以观察到细胞的最低激光功率下调节细胞焦距，以避免不必要的DNA损伤。若使用表达荧光标记目标蛋白的细胞，请选择一个具有代表性荧光强度的焦平面。利用系统的光漂白后荧光恢复模块，配置显微镜以进行微辐照步骤。使用显微镜系统的FRAP模块，选定将要进行微辐照的感兴趣区域。完成此步骤后，对细胞进行微辐照。通常情况下，染色质相关因子会在两分钟内被招募至双链断裂位点。核酸酶对断裂位点的切割将产生单链DNA，并促进同源重组因子的招募，这些因子在微辐照后10分钟即可被检测到。显微照射后，将多孔载玻片放回37摄氏度、含5%CO2的培养箱中，孵育所需时间，然后进行免疫荧光样品处理。或者，按照文本方案中的说明立即进行活细胞延时成像。开始分析时，在Fiji中打开获取的图像。从微辐照分析套件的下拉插件菜单中选择损伤分析器。定义时间单位以及各帧之间的时间间隔，然后使用 StackReg 算法对图像序列进行配准。根据提示，在每个微辐照细胞中定义一个背景感兴趣区域（ROI）。同时，在每个微辐照细胞中定义未辐照和已辐照的感兴趣区域（ROI）。在完成整个延时序列的所有 ROI 数据采集后，将插件生成的结果文件

investigation-protein-recruitment-to-dna-lesions-using-405-nm-laser

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

405 Nm 激光微辐照对 DNA 损伤的蛋白质招募研究

激光常用于研究细胞对DNA损伤的响应。然而，激光产生的损伤位点之间的间距、发生频率及其与复制叉的碰撞情况很少被表征。本文中，我们描述了一种利用激光定点诱导链间交联的方法，可实现对这些参数的测定。...

单分子分析激光定位补骨脂素加合物

激光显微照射是研究活细胞中DNA修复的有用工具。本文展示了利用UVA激光诱导多种DNA损伤的方法学途径。我们优化了一种局部显微照射方法，能够维持正常的细胞周期；因此，经照射的细胞可正常进行有丝分裂。...

利用高级共聚焦显微镜技术研究DNA损伤位点的蛋白质-蛋白质相互作用及动力学

本实验方案的目的是描述如何利用激光显微照射诱导不同类型的DNA损伤，包括相对简单的链断裂和复杂损伤，以研究DNA损伤信号传导及修复因子在损伤位点的聚集。 在体.

激光微辐照技术用于研究 体内 细胞对简单和复杂DNA损伤的反应

共聚焦荧光显微镜与激光显微照射技术可用于在细胞核内特定区域诱导DNA损伤，并监测DNA修复蛋白的响应。该技术极大地推动了我们对损伤识别、信号传导及蛋白募集过程的理解。本文展示了如何利用这些技术研究单链和双链断裂的修复过程。...

激光微照射技术在哺乳动物细胞单链与双链断裂修复研究中的应用

本方案描述了一种非侵入性方法，可高效地鉴定处于S期的细胞，用于后续显微镜研究，例如通过激光微辐照检测DNA修复蛋白的招募情况。...

利用激光显微照射研究S期DNA的招募过程

本文介绍了一种利用热休克蛋白27（HSP27）特异性小干扰RNA评估HSP27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的实验方案。RNA干扰是研究多种细胞类型中蛋白质功能时，有效敲低基因表达的最佳方法。...

基于RNA干扰的热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的研究

通过将DNA损伤剂连接至三链形成寡核苷酸（TFO），可实现靶向的DNA损伤。利用经修饰的TFO，结合本文所述的染色质免疫沉淀分析和DNA超螺旋分析方法，可在人细胞中研究DNA损伤特异性蛋白结合及DNA拓扑结构的改变。...

研究结构蛋白HMGB1在螺旋扭曲、位点特异性DNA链间交联加工中作用的工具

CRISPR相关蛋白Cpf1可通过特别设计的CRISPR...

使用Cpf1进行C-Brick DNA标准组装的实验方案

我们描述了染色质内源性切割联合高通量测序技术（ChEC-seq），这是一种与染色质免疫沉淀（ChIP）正交的方法，利用微球菌核酸酶（MNase）融合蛋白在全基因组范围内定位蛋白质结合位点。...

全基因组范围内利用 ChEC-seq 技术在 Saccharomyces cerevisiae 中绘制蛋白质-DNA 相互作用图谱

该方法可用于测量RNA合成。将5-溴尿苷加入细胞中，并掺入新合成的RNA。通过标记后立即提取RNA，随后对标记的RNA进行针对5-溴尿苷的免疫沉淀，并通过逆转录和定量聚合酶链式反应分析，从而测定RNA合成水平。...

利用5-溴尿苷标记与免疫沉淀法研究RNA合成

学习使用405纳米激光共聚焦显微镜诱导局部DNA双链断裂的方法，并自动量化DNA修复因子动态。该技术利用U2OS细胞实时监测荧光标记蛋白的招募过程，为研究DNA损伤响应动力学和修复机制提供可靠工具。

利用405 nm激光显微照射技术研究蛋白质向DNA损伤位点的招募

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