Name: 一种简便、快速、定量的测定 DNA 蛋白 Crosslinks 在转染哺乳动物细胞中的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学习使用链特异性引物延伸和qPCR技术定量分析哺乳动物细胞中转染质粒DNA的DNA-蛋白质交联修复动力学。该方法可在转染后两小时内检测修复效率，为DNA损伤应答机制研究提供可靠工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（ES023350）资助。Lisa Chesner 由培训项目 5T32HL007741 支持。我们感谢明尼苏达大学的 Natalia Tretyakova 和康涅狄格大学的 Ashis Basu 及其实验室成员在本研究早期和中期阶段提供的支持与技术指导。

1. 含DPC质粒的构建
<ol>
	<li>将含有 8-氧代鸟嘌呤残基的 80 pmol 寡核苷酸（20 µL）与 10 单位的 T4 多核苷酸激酶（1 µL）在 10x 连接酶缓冲液（5 µL）中混合。加水至总体积为 50 µL，并在 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。
	<ol>
		<li>将磷酸化的寡核苷酸（50 µL）、80 pmol 单链 DNA（80 μL）、100 单位 Taq 聚合酶（20 µL）在 10x Taq 反应缓冲液（25 µL）、100 mM ATP（20 µL）、10 mM dNTPs（20 µL）、NEB buffer 2（25 µL）和 8 µg BSA（20 µL）中混合，总体积为 260 µL。将样品置于设定为 75 °C 的热循环仪中孵育 15 分钟，随后在 37 °C 孵育 5 分钟。接着加入 60 U T4 聚合酶（20 µL）、8,000 U T4 连接酶（20 µL）、100 mM ATP（20 µL）、10 mM dNTPs（20 µL）、NEB buffer 2（15 µL）和 8 µg BSA（20 µL），总体积达 375 µL。在 37 °C 下过夜孵育该反应（图 1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备体积比为 50:50 的缓冲液饱和酚与氯仿混合液。取等体积的两种组分混合后，在台式离心机中以 21,130 × g 离心 5 分钟。氯仿促使缓冲液饱和酚中的水析出，形成两层：上层为水相，下层为有机相。取 375 µL 下层有机相加入引物延伸反应中，混匀后在台式离心机中以 21,130 × g 离心 5 分钟。 
	注意：酚和氯仿为危险物质，应采取预防措施避免接触眼睛或皮肤。
	<ol>
		<li>离心后，小心吸取上层水相，加入乙酸铵至终浓度为 0.3 M，再加入 2 倍体积的 100% 乙醇。将溶液在 -20 °C 至少放置 30 分钟或过夜。</li>
		<li>在 4 °C 下以 15,000 × rpm 在台式离心机中离心 10 分钟。弃去上清液，用 1 mL 70% 乙醇洗涤沉淀。在 4 °C 下以 15,000 × rpm 在台式离心机中离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 100 µL 水中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取前一步所得 DNA 50 µL，加入 16 µL 6x 上样缓冲液和 34 µL 水，进行电泳分析，使用含 0.5 µg/mL 溴化乙锭的 0.8% 低熔点琼脂糖凝胶。在 10 cm 凝胶上以 2 V/cm 的电压在 1x TAE 缓冲液中电泳 6 小时。用刀片切下超螺旋条带并称量凝胶切片（图 1A）。运行阳性对照作为共价闭合超螺旋 DNA 迁移位置的标记。 
	注意：溴化乙锭为诱变剂，应避免接触皮肤。此外，应尽量减少质粒样品暴露于紫外光下的时间，以降低紫外线光产物的形成。
	<ol>
		<li>根据凝胶重量，每毫克加入 10% β-琼脂糖酶反应缓冲液，消化凝胶切片。在 65 °C 孵育 10 分钟后冷却至 42 °C。加入 10 U β-琼脂糖酶，在 42 °C 孵育 1 小时。</li>
		<li>孵育结束后，测量体积并加入乙酸铵至终浓度为 0.3 M，冰上放置 15 分钟。室温下以 15,000 × g 离心 15 分钟，收集上清液并加入 2 倍体积的异丙醇。在 -20 °C 冰冻过夜。</li>
		<li>将纯化的超螺旋 DNA 在 4 °C 下以 15,000 × rpm 在台式离心机中离心 10 分钟，将沉淀重悬于 40 µL 水中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 12 pmol（15 µL）DNA 与 36 pmol 8-氧代鸟嘌呤糖苷酶（1 µL）在含 100 mM NaCl（3 µL）、1 mM MgCl2 （3 µL）、20 mM Tris-HCl pH 7.0（6 µL）和 10 mM 氰基硼氢化钠（2 µL）的缓冲液中混合，总体积为 30 µL，在 37 °C 下交联 30 分钟26。取 1 µL 交联样品，稀释于 500 µL 水中作为 0 小时时间点，并在第 3 步中通过 PCR 分析。</li>
</ol>
2. KCl/SDS 沉淀
<ol>
	<li>为观察交联效率，将1 µg交联质粒在10倍缓冲液中用1 μL BspDI于37 °C条件下酶切1小时，以产生两条不同大小的DNA片段。 
	注意：其中一条片段将与蛋白质交联（4.4 kb），另一条则无交联（2.8 kb）（图1B）。
	<ol>
		<li>将样品均分为两份，向两份中均加入SDS至终浓度为0.5%，于65 °C孵育10分钟。</li>
		<li>向其中一份样品中加入KCl（终浓度100 mM），并在冰上孵育5分钟。</li>
		<li>将两份样品于4 °C以12,000 × g离心5分钟，取上清液进行琼脂糖凝胶电泳，以估算蛋白质与DNA的交联百分比12。 
		注意：KCl/SDS沉淀用于质量控制，而非底物制备。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 转染哺乳动物细胞
<ol>
	<li>转染前1天，将0.5 × 106 个细胞/孔接种于6孔板中。次日，取含DPC的质粒（来自步骤1.6）1.5 µg（30 µL）与300 µL无血清培养基混合。另取一管，加入12 µL转染试剂与300 µL无血清培养基。将300 µL稀释后的DNA溶液与300 µL稀释后的转染试剂混合，室温孵育5分钟。取250 µL混合物加入两个孔中，37 °C孵育至少1小时。</li>
	<li>孵育结束后，吸除培养基，加入1 mL 0.6% SDS/0.01 M EDTA溶液，室温孵育10–15分钟。用橡胶刮棒刮下细胞，转移至1.5 mL离心管中。加入200 µL 5 M NaCl（终浓度为1 M），轻柔颠倒混匀5次，4 °C过夜孵育27。</li>
	<li>将样品在台式离心机中以21,130 × g、4 °C离心30分钟，收集上清，按前述方法进行乙醇沉淀，并溶于50 µL水中。</li>
</ol>
4. SSPE-qPCR
<ol>
	<li>将每个时间点（包括 0 h）回收的 DNA 各取 1 µL、2× SYBR Green PCR 主混合液（30 µL）、27 µL 水以及 1 µL（100 pMol）与质粒损伤链互补的引物（引物 R，图 2）混合。PCR 反应条件如下：90 °C 预变性 10 分钟，随后进行 8 个循环：90 °C 15 秒，65 °C 1 分钟。第 8 个循环结束后，加入 1 µL（100 pMol）第二条引物，使总体积达到 60 µL（引物 L，图 2）28（试剂详情见材料表）。</li>
	<li>将每个时间点（包括 0 h）未扩增的回收 DNA 各取 1 µL、2× 主混合液（30 µL）、27 µL 水以及每条引物各 1 µL（100 pMol），混合至总体积为 60 µL。</li>
	<li>将步骤 4.1 和 4.2 的样品加入 96 孔 PCR 板中（每孔 20 µL，设三个重复），按照上述条件进行 30 个循环的定量 PCR（qPCR）。</li>
	<li>计算每组三个重复样品的 CT 值平均值。用步骤 4.2 得到的 CT 值减去步骤 4.1 的 CT 值，得到每个样品的 ΔCT 值。再从 ΔCT 值中减去 0 h 时间点的值，以消除背景信号（详见代表性结果部分）。</li>
	<li>使用以下公式将 ΔCT 值转换为修复百分比： 
	<img alt="修复百分比公式，2^ΔCT/2^3 × 100，用于计算 DNA 修复效率" src="/files/ftp_upload/57413/57413eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式"></li>
</ol>

<ol><li>Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Protein+Cross-links%3A+Formation%2C+Structural+Identities%2C+and+Biological+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+chemical+research%22%5BJournal%5D)">DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes.</a> Accounts of chemical research. 48 (6), 1631-1644 (2015).</li>
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<li>Lopez-Mosqueda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPRTN+is+a+mammalian+DNA-binding+metalloprotease+that+resolves+DNA-protein+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks.</a> eLife. 5, e21491(2016).</li>
<li>Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-dependent+protease+involved+in+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair.</a> Cell. 158 (2), 327-338 (2014).</li>
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<li>Stingele, J., Habermann, B., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-protein+crosslink+repair%3A+proteases+as+DNA+repair+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">DNA-protein crosslink repair: proteases as DNA repair enzymes.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (2), 67-71 (2015).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

SSPE-qPCR 方法通过检测含有单一、明确 DPC 损伤的同质群体的修复情况，相较于其他方法具有多种优势。值得注意的是，除了能够控制蛋白质的种类以及用于连接蛋白质与 DNA 的化学交联类型外，还可以轻松调控 DPC 损伤所引入的序列环境。我们已探究了将 DPC 损伤引入质粒中活性启动子位点下游的模板链或编码链时，对 DPC 修复的影响。类似地，我们正在研究利用含有 SV40 复制起始位点的 M13 质粒转染 HEK293T 细胞后，复制过程对 DPC 修复的影响。本文所述的检测方法可直接测量 DPC 修复，而不同于宿主细胞复活等间接评估修复活性的策略24,25。此外，该系统具有稳健性高、灵敏度高和可定量的优点。与其他仅测量 DPC 去除的方法不同，本检测仅识别完整的修复事件，i.e.，不仅要求 DPC 损伤被清除，还要求双链 DNA 的完整性完全恢复17。这是因为磷酸二酯骨架上的无碱基位点、切口或断裂会像原始 DPC 损伤一样有效阻断该检测29。
尽管本报告主要关注一种特定类型的DNA-蛋白质交联（DPC），该交联是通过硼氢化物捕获酶反应中间体而形成的，但我们目前正在开发研究其他类型DPC修复的方法，这些DPC涉及通过核苷碱基而非核糖位置与DNA发生共价连接的蛋白质和其他损伤。利用还原胺化反应，我们构建了与DNA引物的鸟嘌呤或胞嘧啶碱基相连的蛋白质和多肽交联物30。这些寡核苷酸被纯化至均一，并用于生成含有DNA-蛋白质和DNA-多肽交联的超螺旋质粒。尽管这些反应的效率相较于上述详细描述的氧代鸟嘌呤糖基化酶交联方法有所降低，但仍成功实现了目标，并允许在野生型和核苷酸切除修复缺陷型哺乳动物细胞系中检测这些底物的修复情况。我们还利用SSPE-qPCR检测法研究了氧代鸟嘌呤损伤以及一种合成的核糖-胆固醇偶联物的修复，后者此前已被证明可通过细胞核苷酸切除修复机制进行修复31。正如图2所示，原则上，任何能够阻断Taq DNA聚合酶引物延伸的损伤均可通过SSPE-qPCR检测法进行定量分析。
目前关于DPC修复的模型表明，较大的DPC（&#62;10 kDa）在被清除之前会先通过蛋白水解作用被降解为较小的肽段损伤32,33,34。最有可能介导这一蛋白水解过程的候选因子是蛋白酶体，或人类细胞中一种名为Spartan的特异性蛋白酶20,21,35,36,37,38。可利用SSPE-qPCR检测方法进一步研究这些蛋白酶的作用。在转染含有DPC的底物之前，可使用蛋白酶体抑制剂对细胞进行预处理。或者，可将受损质粒转染至Spartan敲低的细胞系中，以阐明其在较大DPC蛋白水解过程中的作用。
无论采用何种方法形成交联，或DNA损伤的性质如何，都必须强调，SSPE-qPCR方法的关键在于能够生成大量均一的DPC-质粒底物。该分析的关键步骤包括：在引物延伸后纯化共价闭合环状质粒，以去除任何切口或线性质粒分子。必须清除这些污染物，以确保后续观察到的任何DPC修复都不是由切口导向或双链断裂导向的修复过程所致。若在引物延伸反应后未能获得足量的超螺旋DNA，可通过调整寡核苷酸与单链DNA的比例来克服。SSPE-qPCR方法的另一个重要步骤是蛋白质与质粒之间的交联效率。在本研究中，采用了一种高效的酶促反应，将8-氧代鸟嘌呤糖苷酶蛋白交联至8-氧代鸟嘌呤损伤位点。通过调整反应中添加的蛋白量，可改善次优的交联效率。
尽管本报告所述结果依赖脂质体转染法将DPC修复底物导入受体细胞，但并无理由表明 先验的，其他转染方法无法使用。我们已开展初步研究，并观察到电穿孔39 也可使用电穿孔转染。然而需要注意的是，根据我们的经验，与脂质体转染相比，电穿孔的转染效率较低，因此我们发现除使用1.5 µg DPC底物外，还需添加载体DNA（最多5 µg）才能获得修复数据。总体而言，上述描述的SSPE-qPCR方法提供了一种创新手段，可特异性地研究质粒DNA上的DPC修复，从而为DNA损伤应答机制带来新的认识。

本文描述了一种基于PCR的检测方法，称为SSPE-qPCR。该方法的目的是定量转染至DNA修复缺陷型和修复 proficient 哺乳动物细胞中的质粒DNA上的DNA-蛋白质交联（DPC）修复情况。该检测方法快速、定量、极为灵活，并可直接测量修复活性。尽管本报告重点介绍该方法在DPC修复研究中的应用，但下文展示的结果表明，任何能够阻断Taq DNA聚合酶的DNA损伤的修复过程均可利用此方法进行研究。
开发该方法的目的是深入了解哺乳动物细胞修复DNA-蛋白质交联物（DPCs）的机制。与其他类型的DNA损伤不同，DPC具有高度的化学多样性1,2。研究表明，数百种细胞蛋白质可与DNA发生交联，且每种蛋白质原则上都有多种氨基酸侧链可能共价结合到细胞DNA上3。此外，蛋白质可通过DNA骨架上的多个化学位点与DNA连接，包括核苷酸碱基上的多个位置以及核糖糖环上的位点4,5。这种化学多样性提示，不同类型DPC的修复可能依赖于不同的生化通路。正是基于这一考虑，开发了SSPE-qPCR检测方法。
为了深入了解细胞DPC修复的分子生物学机制，已开发出多种技术。以下概述了已建立的主要研究方法，并总结了每种方法的主要优势与局限性。需要强调的是，尽管本综述重点讨论哺乳动物细胞培养系统中DPC修复的研究，但目前DPC修复模型的建立也得益于微生物系统和无细胞系统的重要贡献，而这些内容未在本文中进行讨论。
研究DPC修复遗传机制的最简单策略之一，是评估野生型细胞与突变型细胞在暴露于可诱导DPC的试剂后，其对细胞死亡的相对敏感性6,7。该策略相对快速、成本低廉，且仅需掌握基本的细胞培养技术，无需特殊的专业技能。然而，这一方法也存在诸多局限性，需权衡考虑。首先，该实验并未直接测量DNA修复过程。该策略的基本假设是：编码相关DNA修复蛋白的基因若发生失活突变，将导致DNA损伤累积，从而触发程序性细胞死亡。但原则上，编码非DNA修复蛋白的基因突变也可能增强（或减弱）细胞对异源物质诱导死亡的敏感性。其次，产生DPC的试剂 invariably 会同时引发其他类型的DNA损伤（唯一的例外是5-aza-2'-deoxycytidine，但该试剂还会耗竭细胞内的甲基转移酶水平8）。因此，细胞对该试剂的高敏感性增强，可能反映的是对链间交联或其他损伤修复缺陷所致。第三，如上所述，DPC是一类高度异质性的损伤，包含不同化学性质的交联方式，并涉及多种不同的蛋白质伙伴。有可能在特定遗传背景下，某一类或几类DPC亚型的修复能力发生改变，但这种差异未必足以显著影响细胞对该试剂诱导死亡的整体敏感性。综上所述，尽管该策略是一个有吸引力的起点，但上述局限性凸显了采用其他更为直接的方法来研究DPC修复动力学的重要性。
已开发出多种相关方法以实现这一目标。例如，研究人员已建立方法用于区分“游离”DNA与“蛋白质结合”DNA9,10,11利用这些方法，可以在不同遗传背景下比较稳态水平的DNA-蛋白质交联物（DPC），或在暴露于可诱导DPC的试剂后检测其水平。目前应用最广泛的两种策略分别是：使用硝酸纤维素膜结合法或KCl/SDS沉淀法，将含有DPC的DNA与游离DNA分离。12,13在前一种方法中，细胞被裂解后通过硝酸纤维素滤膜。由于硝酸纤维素可结合蛋白质，滤膜会保留与蛋白质结合的DNA，而游离DNA则可通过滤膜。在后一种策略中，利用SDS可结合蛋白质但不结合DNA的特性，通过加入KCl使SDS-蛋白质复合物沉淀，从而将与蛋白质结合的DNA与游离DNA分离。因此，与蛋白质结合的DNA变为不溶性，而未结合的DNA则保留在溶液中。随后可通过放射性标记的胸苷（若细胞先前经过代谢标记）或Hoechst 33258等DNA选择性荧光染料对含DNA-蛋白质交联（DPC）的DNA进行定量。这些方法具有良好的可重复性，且操作步骤较少。然而，它们无法提供有关蛋白质与DNA之间化学交联性质的信息。此外，需要注意的是，这些检测方法可能因将未完成的修复过程误判为已完成，从而高估DPC的修复水平。 即，可能不易被捕获或沉淀的较小DNA-肽交联物的蛋白水解加工，与真正的DNA修复不同。
彗星实验可用于在细胞中可视化检测DNA-蛋白质交联（DPC）的形成14。在这些实验中，DPC的存在会减少DNA的迁移，而该现象可通过蛋白酶K预处理得以逆转。因此，可通过尾部长度来估算DPC的形成量。然而，如上所述，能够诱导DPC形成的药物也会引发其他类型的DNA损伤，从而可能影响尾部长度。此外，该实验方案技术要求较高，需要具备共聚焦成像方面的专业知识和培训。
质谱法可用于研究使用交联剂处理后DNA-蛋白质交联（DPC）修复的动力学过程15,16,17。这些实验通过使用可形成DPC的试剂处理细胞，并利用生物素捕获或苯酚:氯仿（1:1）抽提法分离DPC。随后可采用质谱法鉴定交联的蛋白质，或定量随时间形成的DPC数量。该方法的主要优势在于所产生的数据性质，能够精确地记录在接触外源性物质后发生交联的蛋白质种类。然而，该方案成本较高、耗时较长，且其检测能力受限于可识别的交联类型。
Maizels 等 开发了一种灵敏的“RADAR”（快速回收DNA加合物，rapid approach to DNA adduct recovery）检测方法，用于定量免疫检测DNA-蛋白质交联物，以及基于ELISA的RADAR检测法18,19。这些检测方法特别适用于捕获在细胞中短暂形成的DNA-蛋白质中间体，并生成适用于质谱分析的样品，以鉴定新的蛋白质加合物。该免疫检测方法依赖于抗体来捕获DNA-蛋白质交联物，因此可能无法检测在修复过程中形成的降解DNA-肽段加合物。最近发现了一种与DNA复制相关的特异性DNA-蛋白质交联物（DPC）修复通路，该通路由DNA依赖性金属蛋白酶Spartan介导，在修复过程中将DPC蛋白水解为较小的肽段20,21。该基因的遗传性突变与人类的Ruijs-Aalfs综合征相关，这是一种以基因组不稳定、早衰和肝癌为特征的疾病22。基因工程构建的Spartan基因缺陷小鼠表现出类似的表型23。
宿主细胞对转录活性的修复已被用于研究转染质粒DNA底物上特定损伤的修复情况24,25。在这些实验中，含有DNA-蛋白质交联（DPC）或其他类型DNA损伤的质粒被转染入细胞，这些损伤会阻断报告基因（如荧光素酶）的转录。转染后24至72小时进行发光检测，其信号强度与DPC修复程度相关。然而，这类间接修复检测方法无法检测转染后24小时内的早期修复事件，也无法区分RNA聚合酶对部分修复底物的通读与完全修复之间的差异。
上述每种方法都有其优势，并为当前的DNA-蛋白质交联（DPC）修复模型提供了贡献。然而，SSPE-qPCR检测方法规避了其他方法所存在的一些局限性，因此能够更特异性地揭示DPC修复机制。例如，SSPE-qPCR检测可在完整的哺乳动物细胞中直接测量DNA上位点特异性DPC的修复情况。该方法具有良好的通用性，已在仓鼠和人类细胞系转染后成功用于获取DPC修复结果。在培养的哺乳动物细胞系中，可通过脂质体转染或电穿孔方式将质粒导入细胞。该方法还可确保仅检测定义明确的DPC修复，而不会受到大多数DPC形成剂所诱导的其他类型DNA损伤的干扰。SSPE-qPCR操作简便、成本低廉且快速高效。使用该检测方法，可在转染后2小时即检测到修复事件。利用该方法，可以以高灵敏度和高效率的方式研究可能影响DPC修复结果的各种变量。例如，转录在DPC修复中的作用迄今尚未得到系统评估。由于SSPE-qPCR检测具有高度灵活性，可通过调整DPC的交联位点来回答这一问题。此外，还可将复制起始位点引入携带DPC的质粒中，以研究DNA复制对DPC修复的影响。同时，也可在质粒上构建多个交联位点，用于比较单个DPC与多个交联的修复差异。这些问题若使用染色体DNA进行研究将十分困难，而采用SSPE-qPCR检测则可轻松解决。总体而言，SSPE-qPCR检测需要微克量级的、含有已知位置损伤位点的纯化质粒DNA。除DPC外，其他类型的加合物也可用于该检测，但该损伤必须能够阻断Taq DNA聚合酶的延伸反应。

<table><tbody><tr><td>8-氧代鸟嘌呤修饰的寡核苷酸</td><td>Midland Certified Reagent Company</td><td>NA</td><td>序列：5&amp;rsquo;AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>单链 M13</td><td>NEB</td><td>N4040S</td><td></td></tr><tr><td>Taq 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>ATP，100 mM</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合物，各 10 mM</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>T4 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-琼脂糖酶</td><td>NEB</td><td>M0392S</td><td></td></tr><tr><td>8-氧代鸟嘌呤糖基化酶 1</td><td>NEB</td><td>M0241S</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR 主混合液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4309155</td><td>绿色 PCR 主混合液</td></tr><tr><td>引物 R</td><td>UMN 基因组中心</td><td>NA</td><td>5&amp;rsquo;CGGCTCGTATGTTGTGTG 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>引物 L</td><td>UMN 基因组中心</td><td>NA</td><td>5&amp;rsquo; GCTGCAAGGCGATTAAGT 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>18324-012</td><td>转染试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BspD1</td><td>NEB</td><td>R0557S</td><td></td></tr><tr><td>NEB buffer 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus 实时 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 缓冲饱和酚</td><td>Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td></tr><tr><td>氯仿，试剂级 ACS，光谱纯</td><td>ACROS</td><td>40463-5000</td><td></td></tr></tbody></table>

一种简单、快速且可定量检测转染至哺乳动物细胞质粒上dna-蛋白质交联修复的实验方法

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

本方法旨在提供一种灵活、快速且定量的技术，用于检测哺乳动物细胞系中DNA-蛋白质交联（DPC）修复的动力学过程。该检测方法并非广泛地分析外源性诱导或自发性染色体DPC的清除情况，而是专注于研究一种均一的、化学定义明确的损伤——该损伤被特异性地引入质粒DNA底物的单一位置，并对其修复过程进行检测。重要的是，该方法无需使用放射性物质，也不依赖昂贵或高度专业化的技术设备，而是基于标准的重组DNA操作流程以及广泛可用的实时定量聚合酶链式反应（qPCR）仪器。由于所采用策略具有内在灵活性，因此可通过改变交联蛋白的大小、化学连接的性质以及连接位点的精确DNA序列环境，来分别评估这些参数对DPC修复整体效率的影响。使用该方法时，将含有位点特异性DPC的质粒转染入细胞，并在转染后的不同时间点回收低分子量DNA。随后，利用与质粒损伤链互补的引物对回收的DNA进行链特异性引物延伸（SSPE）。由于DPC损伤会阻断Taq DNA聚合酶的延伸，因此可通过qPCR定量评估已修复与未修复DNA的比例。通过循环阈值（CT）值，可计算出各细胞系在不同时间点的修复百分比。该SSPE-qPCR方法亦可用于定量评估任何能够阻断Taq聚合酶的DNA加合物的修复动力学。

为了利用SSPE-qPCR检测法评估细胞DPC修复，需要有足够的数量（µg 必须制备足量的高质量DPC修复底物。为获得该产物，将含有8-氧代鸟嘌呤残基的寡核苷酸与互补的单链DNA退火，进行引物延伸，并通过凝胶纯化，以确保仅使用共价闭合环状产物进行转染图1A）。本报告重点介绍利用硼氢化物捕获法在重组人8-氧代鸟嘌呤糖苷酶与双链环状质粒分子上的核糖单元之间形成共价交联的底物，尽管类似方法也可用于获得化学性质多样的DNA-蛋白质交联（DPC）底物。由于交联反应效率极高，8-氧代鸟嘌呤糖苷酶/硼氢化物捕获策略尤为理想。如图所示 图1BKCl/SDS 沉淀法作用于经消化后产生两个片段的 DPC 底物，选择性且近乎完全地去除了含有 DPC 的 DNA 片段。这些结果表明，几乎所有质粒底物分子均含有蛋白质交联。
本实验方案部分所述的 SSPE-qPCR 检测利用 qPCR 生成的 CT 值，计算转染后哺乳动物细胞中 DNA-蛋白质交联（DPC）修复的百分比。如图 2所示，蛋白质交联会阻碍 Taq DNA 聚合酶对结合于含 DPC 链上的“R”引物进行延伸。该检测的第二个关键特征是在进行 qPCR 检测前，先进行八轮 SSPE 反应（使用 R 引物）。在这些 SSPE 反应中，未受损（或已修复）的 DNA 可被延伸，从而为下游的“L”引物创造结合位点，而受损 DNA（或未完全修复的 DNA）则无法延伸。因此，SSPE 可使每条未受损（或已修复）DNA 链的丰度增加八倍。这意味着，在 qPCR 前进行了 SSPE 步骤的已修复样品，其 CT 值将比未进行 SSPE 步骤的相同样品低三个单位（图 2）。两种处理之间观察到的 CT 值相差三个单位，称为 ΔCT，反映了 8 = 23 的关系。该 ΔCT 值可用于计算细胞 DNA 修复活性，计算公式为：DNA 修复百分比 = (2ΔCT/23) × 100。对照实验确认，当未受损的底物质粒进行 SSPE-qPCR 检测时， consistently 观察到 ΔCT 值约为 3（数据未显示）。
表1 显示了从转染后3小时和8小时的中国仓鼠肺成纤维细胞中回收的含DPC质粒底物所产生的CT值示例（Table 1A），以及零时间点样品中的 即，按照方案部分所述方法制备但未转染入细胞的样品（Table1B）。该表格还提供了ΔCT值和修复百分比（使用公式2Δ计算得出）CT/23 x 100）从这些样本中获得。如图所示 表 1A转染后3小时和8小时收集的样本计算出的修复率分别为66%和93%。将这些数值从0小时样本分析所得数值中减去，以确定修复百分比。 表1B 显示了两个不同的0 h样本的CT值，这两个样本在转染前是否实现有效交联的情况不同。有效交联的样本产生的ΔCT值为0.8，而交联效果差的样本产生的ΔCT值为2.5。迄今为止，尚无法精确定位在有效交联的0 h样本中ΔCT值0.8这一背景信号的来源。该背景信号不太可能反映的是DPC自发去除的低水平，或Taq DNA聚合酶在DPC损伤位点发生“穿越”合成的低水平活性：在高度纯化的单链M13底物上进行的大量实验始终一致地产生约0.8的ΔCT值。 即，与含DPC底物中观察到的这种“背景”延伸基本相同。因此，在SSPE过程中，“R”引物可能发生少量错配引发，导致产生少量产物，当加入“L”引物并进行qPCR时，这些产物可被进一步扩增。迄今为止，通过调整PCR条件来消除该背景的努力均未能解决这一缺陷。然而，上述减法策略可实现对DPC修复活性的准确估算。值得注意的是，若蛋白质在质粒上的交联效率低下，将导致背景值升高。这一点在所提供的示例数据中有所体现 表1B 由于蛋白质-DNA 交联效率低下，导致 0 时间点的 ΔCT 值较高。因此，在开始转染实验前必须始终进行对照实验，若底物的 ΔCT 值超过 0.8 的阈值，则予以弃用。如 qPCR 方案中所述，每个样本分为 3 个孔，以确保移液的一致性。这些重复样本的 CT 值取平均值作为该样本的最终 CT 值。若任一重复样本的偏差超过 ±0.1，则将其从数据集中剔除。若三个重复样本之间的偏差均超过 ±0.1，则需重新进行 SSPE-qPCR 检测，直至获得一致的结果。经验表明，必须至少进行 3 次独立的转染实验，才能获得可靠的平均值，进而进行统计学分析，以确定不同参数对 DPC 修复效率的影响。
<img alt="基因编辑示意图；质粒修饰、电泳结果、DNA分析、实验设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57413/57413fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 含DNA-蛋白质交联（DPC）质粒的构建。（A）含有8-氧代鸟嘌呤残基（红色）的寡核苷酸与单链DNA（加粗黑色圆圈）退火，并进行延伸反应生成双链质粒（引物延伸产物以虚线表示）。经溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳后，切下对应于超螺旋DNA的条带（红色框），并用β-琼脂糖酶消化。泳道：（1）分子量标记物，（2）单链DNA，（3）双链DNA，（4）引物延伸样品。（B）氧化鸟嘌呤糖苷酶（缩写为hOGG1，以橙色圆圈表示）通过氰基硼氢化钠与8-氧代鸟嘌呤残基交联，随后将生成的DPC底物进行消化，产生一个2,800碱基对的游离DNA片段和一个与蛋白质相连的4,400碱基对片段。向样品中加入SDS后分为两份，其中一份加入KCl并离心，使含DPC的DNA沉淀（图示为橙色沉淀）。将该样品的上清液（图示为离心管中的蓝色液体）以及未加KCl的样品进行凝胶电泳分析。泳道：（1）分子量标记物，（2）未加KCl，（3）加KCl。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57413/57413fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示循环CT分析的DNA损伤与修复过程示意图及扩增图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57413/57413fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：通过SSPE-qPCR定量检测损伤质粒。 质粒DNA经变性后，与损伤链互补的引物（R）退火并延伸。此过程共重复8个循环。在含有损伤底物的情况下（上方），Taq DNA聚合酶因受到DNA-蛋白质交联（DPC）损伤阻滞，无法产生全长扩增产物；而在修复后的底物中（下方），Taq聚合酶可合成包含引物L结合位点的全长产物。经过8个循环后，加入引物L，并通过qPCR测定循环阈值（cycle threshold）。右侧图示为损伤与未损伤底物的扩增结果示例，其中红线代表在qPCR前进行了引物延伸的DNA，蓝线代表在qPCR前未进行引物延伸的DNA。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57413/57413fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">表 1A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">时间</td>
			<td rowspan="2">- 引物延伸</td>
			<td rowspan="2">+ 引物延伸</td>
			<td rowspan="2">ΔCT</td>
			<td>修复百分比</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2ΔCT/23 × 100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 h</td>
			<td>23.5</td>
			<td>21.1</td>
			<td>2.4</td>
			<td>66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 h</td>
			<td>29.4</td>
			<td>26.5</td>
			<td>2.9</td>
			<td>93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">表 1B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">时间</td>
			<td rowspan="2">- 引物延伸</td>
			<td rowspan="2">+ 引物延伸</td>
			<td rowspan="2">ΔCT</td>
			<td>背景百分比</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2ΔCT/23 × 100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 h</td>
			<td>15.4</td>
			<td>14.6</td>
			<td>0.8</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 h</td>
			<td>15.4</td>
			<td>12.9</td>
			<td>2.5</td>
			<td>71</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：利用SSPE-qPCR产生的CT值计算修复百分比。 （A）转染至V79中国仓鼠肺成纤维细胞后3小时和8小时的含DPC底物的修复情况。（B）未转染入细胞的0小时样品的SSPE-qPCR结果。其中一个样品中DNA与氧鸟嘌呤糖基化酶之间的交联反应效率较高（该样品产生较低的ΔCT值），而另一个样品中蛋白质交联效率较低（该样品产生相对较高的ΔCT值）。详见代表性结果部分文本。

本实验方案的目的是定量分析质粒DNA上特定DNA-蛋白质交联的修复情况。将含有损伤的质粒转染至受体哺乳动物细胞系中，并在转染后的多个时间点提取低分子量DNA。通过链特异性引物延伸结合qPCR方法，定量检测DNA修复动力学。

一种简单、快速且可定量检测转染至哺乳动物细胞质粒上DNA-蛋白质交联修复的实验方法

本方法旨在提供一种灵活、快速且定量的技术，用于检测DNA-蛋白质交联（DPC）修复的动力学过程……

本跨太平洋引物延伸定量PCR实验的总体目标是，通过将加合物交联的质粒DNA转染至哺乳动物细胞后，对这些加合物的修复情况进行定量评估。该方法有助于回答DNA修复领域中的关键科学问题，例如：哪些修复通路参与了DNA-蛋白质交联物的修复过程。该技术有望加深对DNA损伤应答的理解，因为它允许人们选择性地研究DNA-蛋白质交联的修复过程，而不受其他类型DNA损伤的干扰。尽管该方法可用于探究DNA-蛋白质交联的修复机制，但也可应用于其他类型的DNA损伤研究。例如无碱基位点以及其他阻碍聚合酶的加合物。该技术的主要优势在于，它能够检测含有加合物的质粒在短至两小时时间点的修复情况。我们最初计划使用细胞内源性修复活性检测法（house cell reactivation）来研究修复过程，然而这些检测方法无法直接测量修复，或可能高估修复效率。特别是当RNA聚合酶能够读取未完成修复的产物时。该方法的可视化演示至关重要，因为纯化和链特异性引物延伸步骤本身难以直观理解。将20微升含有80皮摩尔含8-氧代鸟嘌呤寡核苷酸的溶液与5微升10倍连接酶缓冲液混合。加入1微升含有10单位T4多核苷酸激酶的溶液，将终体积调至50微升，于37摄氏度水浴中孵育30分钟。接下来在冰上配制引物延伸反应体系。设置热循环仪程序并开始运行。孵育后，通过加入不同的试剂、酶和缓冲液，将总体积调整至 375 微升。然后将反应体系置于 37 摄氏度水浴中过夜孵育。按50:50的比例配制苯酚-氯仿混合液时，取等体积的苯酚和氯仿，混合两种组分后，在台式离心机中以21,130 G离心5分钟。离心结束后，取375 µL有机层加入引物延伸反应中，混匀。再次在21,130 ×g条件下离心5分钟。离心后，小心吸取上层液体，并与乙酸铵混合，使其终浓度为0.3摩尔。然后向其中加入两倍体积的100%乙醇。将混合物于-20摄氏度保存至少30分钟至过夜。孵育结束后，在4摄氏度条件下以15,000 RPM离心10分钟。然后弃去上清液，并用70%乙醇洗涤沉淀。将样品再次在台式离心机中以15,000 RPM于4°C离心五分钟。离心后，弃去上清液，并将沉淀溶解于100 µL水中。将50微升DNA与34微升水和16微升6x上样缓冲液混合。在含有0.5微克/毫升溴化乙锭的10厘米、0.8%低熔点琼脂糖凝胶中，用1x TAE缓冲液以2伏/厘米的电压电泳6小时。然后使用刀片切下超螺旋DNA条带。称取凝胶切片。接下来，每10毫克凝胶切片加入1微升β-琼脂糖酶反应缓冲液以进行消化。然后将切片在65摄氏度孵育10分钟，随后在热循环仪中于42摄氏度冷却。待凝胶块完全溶解并冷却至42摄氏度后，加入10单位的β-琼脂糖酶，在热循环仪中42摄氏度孵育1小时。孵育1小时后，测定溶解凝胶块的体积，并加入乙酸铵至终浓度为0.3摩尔，冰上孵育15分钟。孵育结束后，在室温下以15,000 ×g离心15分钟。然后收集上清液，加入两倍体积的异丙醇，混匀。随后将混合物于负20摄氏度过夜保存。次日，在台式离心机中以4摄氏度、15,000 RPM离心纯化的超螺旋DNA 10分钟。去除上清液，并将沉淀重悬于40 µL水中。然后取15 µL含有12 pmol DNA的溶液与1 µL含有36 pmol 8-氧代鸟嘌呤糖苷酶的缓冲液混合，调整终体积至30 µL。随后将混合物置于37°C水浴中孵育30分钟。转染前一天，将细胞接种于六孔培养板中。次日，取1.5微克交联质粒与300微升无血清培养基在一支试管中混合，注意保留1微升DNA作为零小时时间点对照。在另一支试管中，将12微升转染试剂与300微升无血清培养基混合。然后将300 µL交联的DNA与等体积的稀释转染试剂混合，并在室温下的超净工作台中孵育5分钟。孵育结束后，将250 µL复合物加入两个孔中，于37°C孵育。至少一小时后，移除培养基，加入1毫升含0.1摩尔EDTA的0.6%十二烷基硫酸钠溶液，室温孵育10至15分钟。然后用橡胶刮棒刮下细胞，转移至1.5毫升微量离心管中。随后加入200微升5摩尔氯化钠溶液，使终浓度为1摩尔，倒置混匀5次。然后在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天在 4 摄氏度下以 21,130 ×g 离心 30 分钟。离心后，收集上清液。加入乙酸铵至终浓度为 0.3 摩尔，混匀后加入两倍体积的 100% 乙醇以沉淀 DNA。将混合物于 -20 摄氏度保存至少 30 分钟。乙醇沉淀后，将回收的 DNA 样品重悬于 50 微升水中，将零小时样品用 500 微升水稀释，并使用未转染和转染的样品配制 PCR 反应。然后在热循环仪上设置程序并开始运行。这一跨特异性引物延伸步骤至关重要，因为它能够实现对损伤链的扩增。如果不使用该步骤，ΔCT 值将小于 1，从而难以检测到低水平的 DNA-蛋白质交联（DPC）修复。完成八个循环后，加入100皮摩尔的第二引物。然后将未转染和转染样品的1微升未扩增DNA与2倍主混合液、水以及各100皮摩尔的两种引物混合，最终体积为60微升。将样品以每组三个重复的形式加样至96孔PCR板中。进行30个循环的定量PCR，并计算每个三复孔样品的循环阈值（CT值）的平均值。本研究中，定量PCR在有或无链特异性引物延伸的情况下进行，以计算已修复质粒DNA的百分比。引物延伸样品与非引物延伸样品之间的循环阈值差异称为ΔCT。如图所示，经过SSPE-QPCR处理的已修复样品的ΔCT大于未修复样品。根据ΔCT值计算出的修复百分比代表性数据显示，转染后3小时回收的样本修复率为66%，而转染后8小时回收的样本修复率为93%。图中还展示了分别来自蛋白质交联效率高和低的两个对照样本的背景百分比值。对照样本中较低的背景百分比表明，为何只有交联效率高的底物才用于转染实验。一旦掌握，该技术可在两到三小时内完成。在进行此操作时，重要的是要采集时间零点的样品，以扣除本实验中的任何背景信号。在此步骤之后，可进行其他方法，如序列分析，以回答更多问题：例如，DPC修复是否容易出错？观看本视频后，您应能够充分掌握如何在哺乳动物细胞中制备、转染并定量含有加合物的质粒修复情况。请务必注意，使用苯酚、氯仿和溴化乙锭可能存在危险，因此应始终采取预防措施，例如佩戴手套并在通风橱中操作。

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