一种简便、快速、定量的测定 DNA 蛋白 Crosslinks 在转染哺乳动物细胞中的研究

本协议的目的是量化在质粒 dna 上对定义的 dna 蛋白 crosslinks 的修复。损伤质粒被转染成受体哺乳动物细胞系和低分子量, 在多时间点后再染。DNA 修复动力学的量化使用链特定引伸后, qPCR。

这篇跨太平洋引物延伸 QPCR 论文的总体目标是定量评估转染到哺乳动物细胞后与质粒 DNA 交联的加合物的修复。这种方法可以帮助回答 DNA 修复领域的关键问题。比如 DNA 蛋白交联的修复涉及哪些途径。

这项技术有可能更好地了解 DNA 损伤反应。因为它允许人们选择性地研究 DNA 蛋白交联的修复和不存在其他类型的 DNA 损伤。虽然这种方法可以提供对 DNA 蛋白交联修复的见解，但它也可以应用于其他类型的 DNA 损伤。

如无碱基位点和其他聚合酶阻断加合物。该技术的主要优点是它可以在最早两小时的时间点检测含加合物质粒的修复。我们最初打算使用室内细胞再激活来研究修复，但这些检测并不直接测量修复或可能高估修复效率。

特别是如果 RNA 聚合酶可以读取不完整的修复产物。该方法的可视化演示至关重要，因为纯化和链特异性引物延伸步骤很难可视化。将 20 微升含有 80 皮摩尔的含 8 氧鸟嘌呤的寡核苷酸的溶液与 5 微升 10x 连接酶缓冲液混合。

并加入 1 微升含有 10 单位 T4 多核苷酸激酶的溶液。将最终体积调整至 50 μL，并将试管在 37 摄氏度的水浴中孵育 30 分钟。接下来在冰上构成引物延伸反应。

在热循环仪上设置程序并开始运行。孵育后，通过添加不同的试剂、酶和缓冲液将总体积调节至 375 μL。然后将反应在 37 摄氏度的水浴中孵育过夜。

要以 50：50 的比例制备苯基-氯仿混合物，请添加等体积的苯酚和氯仿。然后混合两种组分，并在台式离心机中以 21 G 和 130 G 离心 5 分钟。离心结束后，向引物延伸反应中加入 375 μL 有机层。混合。

然后再次以 21、130 G 离心 5 分钟。离心后，小心地移液顶层。并与乙酸铵混合至终浓度为 0.3 摩尔。

然后向其中加入两体积的 100% 乙醇。将混合物在零下 20 摄氏度下储存至少 30 分钟至过夜。孵育期结束后，将样品以 15， 000 RPM 的速度在 4 摄氏度下离心 10 分钟。

然后弃去上清液，用 70% 乙醇洗涤沉淀。在台式离心机中以 15， 000 RPM 的速度在 4 摄氏度下再次旋转样品 5 分钟。离心后，弃去上清液，将沉淀溶解在 100 微升水中。

将 50 μL DNA 与 34 μL 水和 16 μL 6x 凝胶上样染料混合。在 1x TAE 缓冲液中，将样品放在 10 厘米、0.8% 低熔点琼脂糖凝胶上，其中含有 0.5 微克/毫升溴化乙锭，每厘米 2 伏特，持续 6 小时。然后使用剃须刀片切除超螺旋 DNA。

并称量凝胶片。接下来，每 10 毫克凝胶切片加入 1 微升 β-琼脂酶反应缓冲液以消化。然后将切片在 65 摄氏度下孵育 10 分钟，然后在热循环仪中以 42 摄氏度冷却。

凝胶切片溶解并冷却至 42 摄氏度后，加入 10 单位的 β-琼脂酶，并在 42 摄氏度下在热循环仪中放置 1 小时。1 小时后，测量溶解凝胶切片的体积，加入乙酸铵至终浓度为 0.3 摩尔，并在冰上孵育 15 分钟。孵育后，在室温下以 15， 000 G 离心混合物 15 分钟。

然后收集超级清净液，吸取两倍体积的异丙醇并混合。然后将混合物在零下 20 摄氏度下储存过夜。第二天，将纯化的超螺旋 DNA 放入台式离心机中，在 4 摄氏度下以 15， 000 RPM 离心 10 分钟。

取出超级清脱液，将沉淀重悬于 40 μL 水中。然后将 15 微升含有 12 皮摩尔 DNA 的溶液与 1 微升含有 36 皮摩尔氧鸟嘌呤糖基化酶的溶液混合在缓冲液中，并将最终体积调节至 30 微升。然后将混合物在 37 摄氏度下在水浴中孵育 30 分钟。

转染前一天，将细胞接种在 6 孔培养板中。第二天，将 1.5 μg 交联质粒与 300 μL 无血清培养基混合在一个试管中，确保保存 1 μL DNA 作为零小时标志点。在另一支试管中，将 12 μL 转染试剂与 300 μL 无血清培养基混合。

然后将 300 μL 交联 DNA 与等体积的稀释转染试剂混合。并在室温下在层流罩中孵育 5 分钟。孵育后，向两个孔中各加入 250 微升复合物，并在 37 摄氏度下孵育。

至少 1 小时后，取出培养基，加入 1 毫升含 0.1 摩尔 EDTA 的 0.6% 十二烷基硫酸钠溶液，并在室温下孵育 10 至 15 分钟。然后用橡胶警察刮擦分离细胞，并转移到 1.5 毫升微量离心管中。接下来，加入 200 微升 5 摩尔氯化钠溶液至终浓度为 1 摩尔，并将试管倒置 5 次。

然后在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，将样品在 21， 130 G 下在 4 摄氏度下离心 30 分钟。离心后，收集超级清净液。

并加入乙酸铵至终浓度为 0.3 摩尔，混合并加入两倍体积的 100% 乙醇以沉淀 DNA。将混合物在零下 20 摄氏度下储存至少 30 分钟。在 50 μL 水中乙醇沉淀并重悬回收的 DNA 样品后，用 500 μL 水稀释零小时样品，并使用未转染和转染的样品进行 PCR 反应。

然后在热循环仪上设置程序并开始运行。这个反式特异性引物延伸步骤至关重要，因为它为我们购买了受损链的扩增。如果不使用，delta CT 值将小于 1，因此难以检测低水平的 DPC 修复。

完成 8 个循环后，加入 100 皮摩尔的第二个引物。然后将来自未转染和转染样品的 1 微升未扩增 DNA 与 2x 预混液、水和 100 皮摩尔两种引物混合，最终体积为 60 微升。将样品一式三份加载到 96 孔 PCR 板上。

进行 30 个循环的定量 PCR，并平均每个一式三份样品的循环阈值。在本研究中，QPCR 在有和没有链特异性引物延伸的情况下进行，以计算已修复的质粒 DNA 的百分比。引物扩展样品和非引物延伸样品之间循环阈值的差异称为 delta CT.As 此处看到，经 SSPE-QPCR 的修复样品比未修复样品具有更大的 delta CT。

根据 delta CT 值计算的修复百分比的代表性数据显示，转染 3 小时后回收的样品修复率为 66%，而转染 8 小时后回收的样品修复率为 93%。此处显示了从两个分别具有高和低蛋白质交联效率的对照样品计算的背景百分比值。对照中存在的低百分比背景表明为什么只使用高效交联的底物进行转染。

一旦掌握了这项技术，可以在两到三个小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要采用零时间样品以从该分析中减去任何背景。按照此程序，可以执行其他方法（如序列分析）来回答其他问题，例如：DPC 修复错误容易发生吗？

观看此视频后，您应该对哺乳动物细胞中含加合物质粒的制备、转染和定量修复有很好的了解。不要忘记，使用苯酚、氯仿和溴化乙锭可能是危险的。应始终采取预防措施，例如戴手套和在通风橱中工作。