Name: 透射电镜 hFOB 1.19 和 Saos-2 细胞产生的能量色散 X 射线显微分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: 了解透射电镜结合能量色散X射线显微分析技术，用于比较hFOB 1.19和Saos-2两种人骨细胞系的矿化特征差异。该方法为骨组织工程研究提供重要参考。

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MK 和 ASK 进行了实验操作，LB 绘制了图示并制作了视频。ASK 撰写了手稿，LB 撰写了脚本，MK 制作了表格。SM、RB 和 SP 对表格、脚本和手稿进行了批判性审阅。作者感谢 Hanna Chomontowska 在超薄切片技术方面的出色协助，以及 Szymon Suski 和 Henryk Bilski 在透射电子显微镜-能谱分析（TEM-EDX）方面的出色协助。作者感谢 Patrick Groves 博士在英文语言润色方面的专业帮助，以及 Barbara Sobiak 对操作指令的录音工作。
本工作获得了波兰科学与高等教育部授予 ASK 的 N N401 140639 号资助、波兰国家科学中心授予 LB 的 2016/23/N/NZ4/03313 号资助和授予 MK 的 2016/23/N/NZ1/02449 号资助、欧盟第七框架计划项目 BIOIMAGINE：研究创新与教育中的生物成像（BIO-IMAGing in research INnovation and Education），项目编号 GA No. 264173，以及波兰科学院涅恩科夫实验生物学研究所法定资金的支持。

1. 细胞培养与处理
<ol>
	<li>将所有必需材料放入超净工作台内，并在紫外灯下进行灭菌处理。培养基成分如下：用于人胎成骨细胞hFOB 1.19（SV40大T抗原转染）的培养基为Ham's F12与DMEM培养基1:1混合液，其中添加2.5 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、0.3 mg/mL G418以及10%胎牛血清（FBS，v/v）；用于人骨肉瘤Saos-2细胞的培养基为McCoy's 5A培养基，其中添加1.5 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素以及15%胎牛血清（FBS，v/v）。</li>
	<li>将hFOB 1.19细胞置于含5% CO2的环境中，于34 °C培养；将Saos-2细胞置于含5% CO2的环境中，于37 °C培养。将细胞培养物（hFOB 1.19或Saos-2细胞）从培养箱转移至超净工作台，更换为10 mL含胎牛血清的新鲜培养基。</li>
	<li>对细胞进行无刺激培养（静息状态）或加入刺激物诱导：先加入50 µg/mL抗坏血酸（AA），再加入7.5 mM β-甘油磷酸钠（β-GP），上述溶液需预先用超纯水配制并经0.22 µm注射器滤器过滤。将刺激物从塑料微量离心管中直接加至培养基表面，轻轻晃动培养皿混匀，随后继续培养7天。</li>
</ol>
2. 钙矿物的检测
<ol>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS：125 mM NaCl，5 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1 mM KH2PO4，pH 7.0）洗涤细胞培养物。</li>
	<li>加入 5 mL 的 2%（g:100 mL）AR-S 溶液（溶于 PBS，pH 5.0），孵育 30 分钟以染色矿物质。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 3 次。沿培养皿壁小心加入 PBS，尽量避免破坏矿物质。</li>
	<li>在倒置光学显微镜下观察钙盐矿物质，并拍摄图像。</li>
</ol>
3. 在紫外光下观察探针
<ol>
	<li>对于细胞裂解物，按照胶原酶消化方案24处理静息或刺激培养7天的细胞培养物。</li>
	<li>收集细胞培养液，并用PBS洗涤细胞。</li>
	<li>在37 °C条件下，使用3 mL含500 U/mL胶原酶的消化液（0.25 M蔗糖、0.12 M NaCl、0.01 M KCl和0.02 M Tris-HCl缓冲液，pH 7.45）消化细胞3小时。</li>
	<li>机械刮取细胞，转移至塑料微量离心管中，并用0.5 × 16针头的1 mL 40 U注射器反复吹打10次。</li>
	<li>将样品在500 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 µL合成软骨淋巴液（SCL，100 mM NaCl、12.7 mM KCl、0.57 mM MgCl2、1.83 mM NaHCO3、0.57 mM NaH2PO4、5.5 mM D-葡萄糖、63 mM蔗糖、16.5 mM Hepes，pH 7.4）中。</li>
	<li>用刮勺将紫外透射仪上的羟基磷灰石（HA）、氟磷灰石（FA）和氯磷灰石（CA）粉末转移至实验容器中，作为对照使用。</li>
	<li>用塑料吸头将塑料管中的细胞裂解物转移，并小心放置于紫外透射仪上。</li>
	<li>在可见光和紫外光下拍摄图像。</li>
</ol>
4. 透射电子显微镜-能量色散X射线光谱（TEM-EDX）探针的制备
<ol>
	<li>负染色法用矿物的制备
	<ol>
		<li>将2.5 mg人工合成的HA、CA和FA矿物悬浮于溶液中25 在500 µL去离子水中溶解，并于5% CO₂气氛中37 °C孵育2 1小时。</li>
		<li>使用防静电镊子从盒子中取出Formvar/Carbon 300目镍网，置于瓷质多孔板上，分别向网格上滴加10 µL的HA、CA和FA悬浮液。</li>
		<li>在室温下干燥样品30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>静息与刺激状态下细胞的包埋制备 26
	<ol>
		<li>从细胞培养物中收集培养基，并用生理脱敏（PD）培养基（125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM NaHCO₃, 1.25 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 25 mM glucose, 0.1% BSA, pH 7.4）洗涤细胞。3，1 mM KH2PO4，10 mM 葡萄糖，20 mM HEPES，pH 7.4）。</li>
		<li>在通风橱中，室温下用 5 mL 含 3% (g:100 mL) 多聚甲醛和 1% (g:100 mL) 戊二醛的 100 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）固定细胞，孵育 1 小时。</li>
		<li>用5 mL 100 mM磷酸钠缓冲液洗涤细胞，洗涤后轻轻吸去缓冲液。</li>
		<li>在暗室中，于通风橱内，室温下用 2 mL 1% (g:100 mL) 四氧化锇溶于 100 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）固定样品，后固定时间为 20 分钟。</li>
		<li>去除四氧化锇并加以利用。</li>
		<li>用5 mL 100 mM磷酸钠缓冲液洗涤细胞。</li>
		<li>然后，在室温下使用5 mL等份的梯度乙醇溶液对样品进行脱水处理：25%（体积分数）乙醇中孵育5分钟，50%（体积分数）乙醇中孵育10分钟，75%（体积分数）乙醇中孵育15分钟，90%（体积分数）乙醇中孵育20分钟。最后使用无水乙醇两次，分别孵育30分钟和12小时。</li>
		<li>用塑料细胞刮刀从塑料培养皿上刮取细胞，收集至塑料微量离心管中，于130 × g离心1分钟。</li>
		<li>移除上清液，将细胞重悬于1 mL LR White树脂与无水乙醇按体积比1:2配制的混合液中。</li>
		<li>使用前将玻璃管中的内容物充分混匀，并在室温下孵育30分钟。</li>
		<li>以 130 × g 离心样品 1 分钟。</li>
		<li>移去上清液，加入1 mL LR White树脂与无水乙醇按1:1比例配制的混合液，重复上一步骤。</li>
		<li>充分混匀，室温孵育30分钟。</li>
		<li>以 130 × g 离心样品 1 分钟。</li>
		<li>移除上清液。</li>
		<li>最后，在塑料管中向样品加入1 mL纯LR White树脂，室温孵育1 h，重复一次。</li>
		<li>将每种样品各 500 µL 加入明胶胶囊中。 
		注意：样品使用小张纸和铅笔标记，以防止树脂破坏标签。</li>
		<li>盖上明胶胶囊，放入塑料微量离心管中，于摆动转子离心机中以130 × g离心1分钟。</li>
		<li>使用真空泵从塑料管中取出胶囊。</li>
		<li>将样品转移至烘箱中，在 56 °C 下聚合 48 小时。</li>
		<li>将样本块安装到持样器中，并修整成金字塔形状。</li>
		<li>将样品台放入超薄切片机中，安装钻石超薄45°刀具，并注入去离子水；注意清除刀刃上附着的气泡。</li>
		<li>然后使用金刚石刀在去离子水浴中切取700 Å的切片。</li>
		<li>使用牛睫毛固定碎屑，并将其置于Formvar/Carbon 300目镍网的光滑面，晾干。</li>
		<li>在通风橱内避光条件下，将乙酸铀酰配制成体积分数为2.5%的无水乙醇溶液。乙酸铀酰应存放于铅容器中，且切勿取用沉淀物。</li>
		<li>在暗室中，于通风橱内，用含2.5%（体积分数）醋酸铀酰的乙醇溶液对合成羟基磷灰石和细胞样品载网进行复染，室温下孵育20分钟。</li>
		<li>将载网在50%乙醇（体积分数）中清洗，然后用去离子水清洗，在室温下干燥24 h。最后将载网放入盒中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 透射电子显微镜-能量色散X射线分析
<ol>
	<li>使用配备全范围能量色散X射线微区分析（EDX）系统和11兆像素相机的透射电子显微镜（TEM）进行成像
	<ol>
		<li>准备用于矿物和细胞观察的铍制样品台。使用防静电工具。</li>
		<li>卸下一对螺丝，将铍板和铍垫圈从其余夹持部件上取下。</li>
		<li>将载网正面朝上安装在样品台上。</li>
		<li>小心放置铍垫圈和铍板，并拧紧固定螺丝。</li>
		<li>将样品台放入真空腔室，并开启真空泵。</li>
		<li>达到真空状态后，轻柔地将样品台插入成像腔室，并开启电子束。</li>
		<li>在荧光显示屏上设置显微镜的光阑参数。进行图像像散校正；调节放大倍数、焦距和画面帧率；以50,000倍的放大倍数采集透射电子显微镜（TEM）图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描透射电子显微成像（STEM）及X射线微区分析用于光谱与成分分析
	<ol>
		<li>将能量色散X射线（EDX）探测器插入扫描透射电子显微镜（STEM）成像腔室。</li>
		<li>在聚焦模式下调节图像清晰度。</li>
		<li>以15,000倍的放大倍数采集STEM图像。</li>
		<li>在样品中选择一个点进行X射线微区分析，并采集光谱数据。</li>
		<li>通过将样品中元素周期表上所有元素的原子量总和归一化为100%，获得各元素含量数据（以原子百分比表示），并标示所选元素Ca、F、Cl和P的含量（原子%）。然后计算每个样品中Ca、F或Cl与P的原子比值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离子分布图绘制
	<ol>
		<li>选择钙、氟、氯和磷等元素进行离子分布图绘制，并对样品中选定元素进行EDX元素分布成像。</li>
		<li>通过标示分析元素Ca、F、Cl和P的定位情况（以原子%表示），获得数据，并计算每个样品中Ca、F或Cl与P的共定位率（%）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

在本文中，我们描述了AR-S染色、紫外光下氟磷灰石的鉴定以及透射电镜-能谱分析的实验方案 体外 矿化细胞释放的基质小泡及其矿化产物的成像. 可通过遵循一些常见的故障排除步骤来解决上述所有方法中的问题。为了获得最佳结果，需仔细执行以下几个关键步骤。首先，应先加入酸性的抗坏血酸（AA），再加入碱性的β-甘油磷酸酯（β-GP），以维持培养基的pH值为7.4。其次，经过茜素红S（AR-S）染色后，染色的钙沉积物非常脆弱，在加入磷酸盐缓冲液（PBS）时应小心清洗细胞，以防晶体被破坏。第三，醋酸铀酰应始终保存在铅容器中，且不可取用沉淀部分，仅应使用稀释后的上清液进行固定。第四，需注意抗坏血酸和醋酸铀酰对光敏感，应在暗室中操作。第五，LR White树脂与无水乙醇的混合液在加入样品前应充分混匀。第六，明胶胶囊中的样品应使用小片纸和铅笔进行标记，以避免树脂破坏标签。第七，金刚石刀刃应仔细清除所有气泡。第八，应小心将样品置于载网的光亮面，即涂有Formvar/碳膜的一面。第九，在透射电子显微镜（TEM）图像中进行X射线微分析和离子定位时，应准确定位分析点，以减少羟基磷灰石识别可能出现的问题。
<p class=...

骨是一种结缔组织，由两部分组成：有机成分（细胞和胶原纤维）和无机矿物成分（钙和磷酸盐化合物）。骨骼中的主要矿物成分为磷灰石1。骨组织中具有矿化能力的细胞（成骨细胞）、牙齿中的细胞（成牙本质细胞）以及软骨中的细胞（软骨细胞）通过合成细胞外基质（ECM）蛋白并释放基质小泡（MVs）来调控矿化的初始阶段（图1）。基质小泡是直径为100–300 nm的囊泡，能够富集钙和磷酸盐，促进磷灰石成核，随后与胶原结合2,3。随后，基质小泡破裂，将磷灰石释放到细胞外环境中。磷灰石在与胶原纤维接触的过程中持续生长，最终形成骨基质。细胞外环境中持续供应的Pi和Ca2+维持了矿化过程。一些最近发表的数据支持我们的模型4,5。在生理条件下，软组织不会发生矿化。然而，在病理状态下可能发生异位钙化，例如血管钙化3。获得成骨细胞表型的血管细胞可产生基质小泡，诱导磷灰石成核，并在血管壁的中膜和内膜层启动矿化过程。由于异位钙化与正常的软骨内矿化过程相似3，因此理解成骨细胞和软骨细胞矿化的分子机制，将有助于揭示软组织异位钙化形成的潜在机制。
骨骼组织的发育受到多种酶、生长因子以及矿化促进剂或抑制剂的调控。组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）（图1）与外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶I（NPP1）以及ankyrin（ANK）之间存在拮抗作用，共同调控无机焦磷酸盐（PPi）的浓度6。PPi是羟基磷灰石（HA）形成的强效抑制剂，可被TNAP水解；NPP1通过水解核苷三磷酸生成PPi，而ANK则将PPi从细胞内转运至细胞外基质（ECM）。Pi/PPi的比值可能调控磷灰石的形成7,8，并可能导致病理后果9。
基质小泡（MV）膜富含离子转运蛋白，可在矿化成核过程中促进钙和磷酸盐在基质小泡内部的初始沉淀（图1）。磷酸盐转运蛋白1（PiT）有助于磷的摄取i 在周囊泡空间内生成并进入膜囊泡（MVs）10,11. 膜联蛋白可能参与Ca²⁺的结合与转运2+ 以及在微囊腔内启动矿化的生物物理过程中12,13我们倾向于此前提出的假说，即矿物质在基质小泡（MV）内胞质内囊泡中先发生羟基磷灰石的内部成核，随后再向细胞外基质（ECM）中扩展。14,15. 体外 建模证实了Ca的诱导2+/Pi PS和AnxA5制备的蛋白脂质体中复合物的形成16。这可能表明 Ca 的积累2+，Pi，微绒毛样膜脂筏中的AnxA5与PS复合物代表了M中磷灰石的成核核心（NC）与 Annexins 和 TNAP 也具有结合胶原的能力，可能有助于将基质小泡（MVs）定位在胶原纤维上，并促进细胞外基质（ECM）中矿化的扩展。胎球蛋白 A 和骨桥蛋白（OPN）17，被称为羟基磷灰石形成的抑制剂，可能减缓矿物质在胶原支架上的传播。成核与传播是两个不同的事件，前者先于后者，二者均可能与病理性矿化过程相关。
为了揭示磷酸钙复合物的化学性质如何影响生理性矿化和异位钙化，有必要鉴定细胞产生的矿物质。磷灰石是一类含有钙和磷酸盐的矿物质，其通用晶胞化学式为 Ca10(PO4)6X2，其中 X = Cl、F、OH。它们按以下分类18：氟磷灰石（FA）Ca10(PO4)6F2、氯磷灰石（CA）Ca10(PO4)6Cl2 和羟基磷灰石（HA）Ca10(PO4)6(OH)2。
选择成骨细胞系以诱导矿化形成至关重要，因为不同细胞系表现出各异的矿化特征。本研究中，我们比较了两种选定的人源性矿化细胞模型——成骨样hFOB 1.19细胞和成骨肉瘤Saos-2细胞——在矿物成核方面的能力。成骨肉瘤来源的细胞常被用作成骨细胞模型，其中Saos-2细胞保留了最接近成熟成骨细胞的特性。19 而未分化的正常人胎骨细胞hFOB被广泛用作成骨细胞分化的研究模型20通过不同方法分析其矿化特征：茜素红S（AR-S）染色、紫外光（UV）下观察、透射电子显微镜（TEM）成像、能量色散X射线微区分析（EDX）定量检测以及离子定位成像。相较于以往研究中采用的其他技术，TEM-EDX的优势在于能够提供羟基磷灰石晶体中离子置换的定性与定量结果。4,5,21使用透射电子显微镜-能量色散X射线谱（TEM-EDX）的总体目标是建立一种简单的方法，用于成像并定量分析在矿化过程不同阶段来自各类细胞的多种矿物中Ca、F和Cl离子的分布情况。该方法已成功应用于例如监测锌纳米颗粒与共存化学物质的相互作用及其对水生生物的联合效应。22在另一项研究中，通过电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-OES）、N₂物理吸附（BET）、X射线衍射（XRD）、紫外-可见漫反射光谱（UV-vis DRS）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、拉曼光谱、透射电子显微镜-能量色散X射线光谱（TEM-EDX）以及光电化学测量，对水溶液中钛基材料上的铜光催化剂进行了系统表征。23我们的目标是比较两种细胞系中囊泡和矿物质的来源及其特性，以阐明在成骨分化过程中调控矿化的机制。
<img alt="细胞外基质示意图；磷酸盐转运、annexins、Ca²⁺结合、有机磷酸盐、TNAP。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57423/57423fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1．骨细胞矿化初始步骤示意图，涉及细胞外基质（ECM）蛋白的合成及基质小泡（MVs）从细胞膜释放。MVs通过钙结合蛋白annexins的作用积累钙，通过无机磷酸盐转运蛋白（PiT）的作用积累磷酸盐，随后组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）将焦磷酸盐（PPi）去磷酸化为正磷酸盐（Pi），从而促进羟基磷灰石成核。随后，MVs破裂并将羟基磷灰石释放到细胞外环境。细胞外环境中持续供应的Pi和Ca2+维持了矿化过程4,5。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57423/57423fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本</a>。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ham&amp;rsquo;s DMEM/F12 培养基混合液</td><td>PAA</td><td>E15-813</td><td>1:1，用于人胎成骨细胞 hFOB 1.19 SV40 大 T 抗原转染细胞（ATCC CRL-11372）</td></tr><tr><td>McCoy&amp;rsquo;s 5A 培养基</td><td>PAA</td><td>E82312-0025</td><td>用于人骨肉瘤 Saos-2 细胞（ATCC HTB-85）</td></tr><tr><td>抗生素混合液（青霉素/链霉素）</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td>各 100 U/mL</td></tr><tr><td>G-418</td><td>Sigma</td><td>68168</td><td>0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>hFOB 1.19 使用 10%，Saos-2 使用 15%</td></tr><tr><td>AA</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>50 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>&amp;szlig;-GP</td><td>Sigma</td><td>G9422-100G</td><td>7.5 mM</td></tr><tr><td>Bio-Gel HTP 凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>130-0420</td><td>用于 HA</td></tr><tr><td>FA</td><td></td><td></td><td>由我们合成</td></tr><tr><td>CA</td><td></td><td></td><td>由我们合成</td></tr><tr><td>磷酸钠缓冲液 Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 混合液</td><td>Sigma</td><td>S7907/S8282</td><td>0.1 M，pH 7.2</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7.0，由我们配制</td></tr><tr><td>AR-S 溶于 PBS</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>0.5 g/100 mL，pH 5.0</td></tr><tr><td>I 型胶原酶 IA</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>500 U/mL</td></tr><tr><td>SCL 缓冲液</td><td></td><td></td><td>由我们配制</td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td></td><td>由我们制备</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>POCh</td><td>BA6480111</td><td>绝对纯度 99.8%，以及 25%、50%、75%、90% 溶液</td></tr><tr><td>50% 乙醇中的醋酸铀</td><td>Polysciences Inc.</td><td>21447-25</td><td>0.25 g/10 mL</td></tr><tr><td>PD 培养基</td><td></td><td></td><td>pH 7.4，由我们配制</td></tr><tr><td>固定液（多聚甲醛/戊二醛）</td><td>Sigma</td><td>158127/G-6257</td><td>3%:1%</td></tr><tr><td>后固定 OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>75633</td><td>1%</td></tr><tr><td>乙醇中的 LR White 树脂</td><td>Polysciences Inc.</td><td>17411-MUNC 500g</td><td>1:2、1:1、100%</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>CHEMPUR</td><td>111024800</td><td>纯品</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Corning Inc.</td><td>430487</td><td>1.2 mL</td></tr><tr><td>塑料培养皿</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>塑料离心管</td><td>Falcon</td><td>352096 和 352070</td><td>15 和 50 mL</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Falcon 和 VWR</td><td>357521 和 612-3700</td><td>1 和 10 mL</td></tr><tr><td>塑料微量离心管</td><td>Sigma</td><td>Z688312 和 Z628034</td><td>1.5 mL 黑色和 2 mL 透明</td></tr><tr><td>塑料吸头</td><td>VWR</td><td>613-0364、613-0239 和 613-1050</td><td>0.1–10 &amp;micro;L 透明、1–200 &amp;micro;L 黄色、200–1000 &amp;micro;L 蓝色</td></tr><tr><td>塑料架</td><td>Light Labs</td><td>A-7055-Z、A-7053-C</td><td>绿色用于离心管，橙色用于微量管，蓝色用于透射电镜样品</td></tr><tr><td>层流超净台 Hera Save</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>KS12</td><td>HEPA 滤器（DIN EN 1822 标准 H14）</td></tr><tr><td>培养箱 Hera Cell</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>150</td><td>hFOB 1.19 使用 34&amp;deg;C，Saos-2 使用 37&amp;deg;C</td></tr><tr><td>通风橱</td><td>POLON</td><td>WCS-2</td><td>用于透射电镜染色</td></tr><tr><td>玻璃瓶</td><td>SIMAX</td><td>1632414501050 和 1632414501100</td><td>50 和 100 mL</td></tr><tr><td>石英玻璃管</td><td>SIMAX</td><td>638422010100</td><td>&amp;Oslash; 10 mm，L 100 mm</td></tr><tr><td>泵</td><td>IBS Integra Biosciences</td><td>VACUSAFE comfort</td><td>用于抽真空</td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Memmert</td><td>UNE 400</td><td>56&amp;deg;C</td></tr><tr><td>瓷质多孔板</td><td>Rosenthal technik</td><td>229/12</td><td>12 孔</td></tr><tr><td>玻璃烧杯</td><td>SIMAX</td><td>632417010025</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>玻璃瓶</td><td>Pocord</td><td>DIN22</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>塑料盒</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td></td><td>用于避光</td></tr><tr><td>明胶胶囊（Snap Fit）</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>G3741</td><td>1 号尺寸</td></tr><tr><td>带 Formvar/碳膜的 300 目镍网（置于盒中）</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>S162N3</td><td>膜面朝亮面</td></tr><tr><td>硅胶细胞刮刀</td><td>Sigma</td><td>SIAL0010-100EA</td><td>尺寸 1.8/25 cm</td></tr><tr><td>带针头的注射器</td><td>BogMark</td><td>007</td><td>1 mL 注射器 40 U，针头 0.5 × 16</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Chirana</td><td>CH005L</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>离心机</td><td>MPW Medical Instruments</td><td>MPW-350R</td><td>130 × g 和 500 × g</td></tr><tr><td>紫外透射仪</td><td>UVP</td><td>M-20</td><td>用于可见光和紫外光</td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>LKB</td><td>NOVA</td><td>700&amp;Aring; 切片</td></tr><tr><td>样品块夹持器</td><td>LKB</td><td>E6711</td><td>圆形</td></tr><tr><td>金刚石刀</td><td>DiATOME</td><td>Ultra 45&amp;deg;</td><td>3 号尺寸</td></tr><tr><td>睫毛夹持器</td><td></td><td></td><td>牛源，由我们制备</td></tr><tr><td>镊子</td><td>ROTH</td><td>2855.1</td><td>防静电，用于载网</td></tr><tr><td>刮刀套装</td><td>ROTH</td><td>E286.1</td><td>防静电，用于粉末</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;成像&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置光学显微镜</td><td>Zeiss 配 Canon</td><td>AxioObserver Z1 配备 PowerShot G9</td><td>相差、透射光、20× 物镜、RGB 滤光片</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>TEM Jeol 公司配 Oxford Instruments 和 SiS-Olympus</td><td>JEM-1400 TEM 配备全范围 INCA 能谱分析系统（EDX）及 1100 万像素 MORADA G2 相机</td><td>透射电镜放大倍数 50,000X，STEM 和 EDX 为 15,000X</td></tr><tr><td>相机机身与镜头</td><td>Nikon</td><td>Nikon D7100&lt;br/&gt; Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D&lt;br/&gt; Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G&lt;br/&gt; Nikkor AF 28 mm f/2.8D </td><td>用于视频录制</td></tr><tr><td>麦克风</td><td>MXL Mics</td><td>Tempo</td><td>用于语音录制</td></tr></tbody></table>

利用透射电子显微镜结合能量色散x射线微区分析对hfob 1.19和saos-2细胞产生的矿物质进行分析

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

本视频介绍了利用透射电子显微镜结合能量色散X射线微区分析（TEM-EDX）技术，比较两种人源成骨细胞系hFOB 1.19和Saos-2所释放囊泡中矿物质的存在状态。这两种细胞系在经抗坏血酸（AA）和β-甘油磷酸钠（β-GP）处理后，会经历从增殖到矿化的完整成骨转分化过程，并产生基质囊泡（MVs），从而在细胞外基质（ECM）中引发磷灰石的成核作用。
根据茜素红-S（AR-S）染色以及采用紫外光（UV）对细胞裂解液中的矿物质成分进行分析，或通过透射电子显微镜（TEM）成像观察囊泡中的矿化情况，再结合EDX定量分析和离子定位图谱，可以推断出骨肉瘤Saos-2细胞和成骨样hFOB 1.19细胞具有不同的矿化特征。Saos-2细胞的矿化效率高于hFOB 1.19细胞，并形成更大的矿化沉积物；这些沉积物在紫外光下不可见，但其特性类似于羟基磷灰石（HA），含有更多的钙（Ca）和氟（F）取代成分。
利用这些技术获得的结果使我们能够得出结论：矿化过程因细胞类型的不同而有所差异。我们提出，在细胞水平上，囊泡的来源及其特性决定了矿物的类型。

TEM-EDX 可实现 体外 矿化细胞释放的基质小泡（MVs）及其矿化产物的成像与 采用该技术获得的结果表明，不同类型的细胞中矿化过程可能以不同的方式进行。两种细胞系接受了相同的成骨转分化处理，但经刺激后，Saos-2 细胞的矿化效率高于 hFOB 1.19 成骨细胞，这一点通过茜素红染色（AR-S 染色）得以证实图2）。这可能是由于Saos-2细胞具有更为成熟的成骨细胞表型19 与 hFOB 1.19 细胞相比20使用紫外透射仪对样品进行观察，结果表明仅氟磷灰石可在紫外光下被观察到图3）。透射电子显微镜图像显示，与刺激的hFOB细胞或静息状态的Saos-2细胞相比，受刺激的Saos-2细胞产生更多含有矿物质的囊泡（图4，左图和中图）。合成磷灰石具有不同形态的矿物（...

我们提出了一种用于比较两种人源成骨细胞系hFOB 1.19和Saos-2释放的囊泡中矿物质状态的实验方案。通过茜素红-S（AR-S）染色、紫外（UV）光观察、透射电子显微镜（TEM）成像以及能量色散X射线微区分析（EDX）对它们的矿化特征进行了分析。

利用透射电子显微镜结合能量色散X射线微区分析对hFOB 1.19和Saos-2细胞产生的矿物质进行分析

本视频展示了如何利用透射电子显微镜结合能量色散X射线微区分析（TEM-EDX）来比较矿物在……中的存在状态

在矿化的初始阶段，细胞产生细胞外基质蛋白并释放基质小泡，后者积累钙和磷酸盐以促进磷灰石成核。在本报告中，我们比较了两种选定的人类细胞模型——成骨样细胞hFOB 1.19和成骨肉瘤Saos-2细胞——在矿物成核方面的差异。通过多种方法分析了它们的矿化特征。将所有材料置于超净台内，并在紫外线下灭菌。更换培养基为含胎牛血清的 10 毫升新鲜培养基。静息细胞在无刺激物条件下培养，而刺激细胞则同时用抗坏血酸和β-甘油磷酸钠处理。首先，将抗坏血酸轻轻加入培养基表面，使其终浓度为 50 微克/毫升，以刺激细胞。接着，在培养基中加入 β-甘油磷酸钠，使其终浓度为 7.5 毫摩尔/升，以进一步刺激细胞。轻轻搅拌培养皿，然后将其放入培养箱中培养七天。孵育七天后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞培养物。加入5毫升2%茜素红溶液，孵育30分钟以染色矿物质。用PBS洗涤三次。小心地将 PBS 沿培养皿壁加入，避免破坏矿物质。在倒置光学显微镜下观察矿物质。收集细胞培养的培养基，并用 PBS 洗涤细胞。将静息状态或经七天刺激的细胞用 500 单位/毫升胶原酶溶液在 37 摄氏度消化三小时。随后，通过机械方法刮取细胞。将它们转移至塑料微量离心管中。用注射器吹打10次。在500 ×g下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500微升合成软骨淋巴液中。用刮勺从紫外透射仪上的瓶子中转移羟基磷灰石、氟磷灰石和氯磷灰石粉末，作为对照。用塑料吸头从塑料管中转移细胞裂解物，并小心放置在紫外透射仪上。将2.5毫克的羟基磷灰石、氟磷灰石和氯磷灰石粉末悬浮于500微升去离子水中。在37摄氏度下孵育1小时。使用防静电镊子从包装中取出Formvar/碳支持膜镍网，置于瓷质多孔板上。在载网上滴加10微升羟基磷灰石悬浮液。对氯磷灰石和氟磷灰石进行相同操作。将样品在室温下干燥30分钟。为包埋准备静息和刺激后的细胞。收集细胞培养基中的培养液。用生理脱敏培养基洗涤细胞。在通风橱中，于室温下用 5 毫升含有 3% 多聚甲醛和 1% 戊二醛的 100 毫摩尔磷酸钠缓冲液固定细胞 1 小时。用 5 毫升 100 毫摩尔磷酸钠缓冲液洗涤细胞。洗涤后轻轻吸去缓冲液。在暗室中，将样品与两毫升 1% 四氧化锇（溶于 100 毫摩尔/升磷酸钠缓冲液）进行后固定。在通风橱中室温孵育 20 分钟。去除四氧化锇，并妥善使用。用5毫升100毫摩尔的磷酸钠缓冲液洗涤细胞。然后，在室温下用5毫升梯度乙醇溶液系列对样品进行脱水处理，乙醇浓度分别为25%、50%、75%和90%。最后，使用无水乙醇两次，分别孵育30分钟和12小时。用机械方法从培养皿上刮下细胞，将细胞收集到塑料微量离心管中。以130 g离心1分钟。弃去上清液。将细胞重悬于LR White树脂与无水乙醇按1:2体积比混合的溶液中。充分混匀，在室温下孵育30分钟。将样品在130 g条件下离心1分钟。弃去上清液。使用LR White树脂与无水乙醇1:1的混合液重复上一步骤。充分混匀，室温孵育30分钟。将样品在130 g下离心1分钟。弃去上清液。向样品中加入纯LR White树脂，在塑料管中室温孵育1小时。将样品以130 ×g离心1分钟。弃去上清液。再次加入纯LR White树脂。将每个样品的500微升加入明胶胶囊中。注意，样品使用一小张纸和铅笔进行标记，以避免树脂破坏标签。封闭明胶胶囊。将胶囊放入塑料微量离心管中。在摆动转子中以130 ×g离心1分钟。使用真空泵从塑料管中取出胶囊。将样品转移至烘箱中，在56摄氏度下聚合48小时。通过将样品块安装到持样架中以制备样品块。将样品台放入超薄切片机中。安装金刚石刀。用去离子水填充。请注意，清除刀片上附着的偶然产生的气泡。然后，使用金刚石刀在去离子水浴中切片。用牛睫毛将切下的片屑移至载网栅栏上。然后，将样品置于 Formvar/碳支持膜镍网上光面一侧，并使其干燥。在暗室中，于通风橱内用2.5%醋酸铀酰乙醇溶液在室温下对合成羟基磷灰石和细胞样品的载网进行20分钟的复染。用50%乙醇冲洗载网，再用去离子水清洗，随后在室温下干燥24小时。最后，将网格放入盒中。为矿物和细胞的观察准备铍制载物台。使用防静电工具。卸下这对螺丝。将铍片和铍垫圈从卡环其余部分取下。将网格有光泽的一面朝上安装到支架上。小心放置铍垫圈和铍片，拧紧紧固螺钉。将样品架放入真空腔室，并开启真空泵。达到真空后，轻柔地将样品台插入成像室并开启电子束。在荧光监视器上设置显微镜的光阑参数。进行图像像散校正。设置放大倍数、焦距、画面，并拍摄透射电子显微镜图像。将探测器移入成像室。在聚焦模式下调节图像的清晰度。选择样品中的一个点进行X射线微区分析，并采集谱图。选择钙、氟、氯和磷等元素进行离子定位成像，并生成所选元素的分布图。与hFOB成骨细胞相比，刺激后的Saos细胞矿化效率更高。只有氟磷灰石在紫外光激发下可被观察到。HFOB细胞裂解液的荧光强度高于Saos细胞，表明这些细胞中氟磷灰石含量更高。与hFOB细胞和静息状态的Saos细胞相比，受刺激的Saos细胞产生更多含有矿物质的囊泡。合成羟基磷灰石具有不同的矿物形态。上述方法显示了在静息和刺激条件下hFOB和Saos细胞中囊泡的存在。红色点表示钙的分布，绿色表示磷的分布，蓝色表示氟的分布。在刺激条件下，Saos细胞产生的囊泡中钙与磷的分布存在显著重叠，而hFOB细胞产生的囊泡中氟与磷的分布也表现出明显重叠。综上所述，我们的研究结果表明，这些囊泡是矿物质成核的关键决定因素，尤其是在细胞水平上。对矿化效率更高的Saos-2细胞释放的囊泡与hFOB 1.19细胞释放的囊泡进行比较，支持了基质囊泡是富含矿物质的囊泡这一假说。这留下了一个尚未解决的问题：基质小泡的存在是否是诱导磷灰石成核所必需的，以及这一过程可能如何改变生理性的矿化向病理性矿化的转变。

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科研

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Chemistry

化学

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