Name: 斑马鱼脑幼虫神经元、巨噬细胞和小胶质的分离和 RNA 提取 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习从斑马鱼幼虫脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞并提取高质量RNA的技术，用于qPCR和转录组学等下游分析，以研究中枢神经系统细胞在生理和病理条件下的基因表达特征。

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我们感谢克劳尔·戴维斯博士和维罗妮克·米龙博士（爱丁堡女王医学研究所，英国）在实验方法以及QMRI流式细胞术与细胞分选平台方面提供的初期帮助和讨论。本工作获得了英国癌症研究基金会授予德克·西格尔博士的职业发展奖的支持。

1. 样品与培养基的制备
<ol>
	<li>通过将 6.4 mM KCl、0.22 mM NaCl、0.33 mM CaCl2·2H2O 和 0.33 mM MgSO4·7H2O 溶解于 H2O 中，制备胚胎培养基（E3）。</li>
	<li>在受精后立即收集斑马鱼胚胎（0 dpf）。
	<ol>
		<li>将斑马鱼胚胎按每 90 mm 培养皿 50 枚分装。自发育第一天结束时（0 dpf）起，将胚胎置于含 200 µM 1-苯基-2-硫脲（PTU）的 50 mL 胚胎培养基（E3）中，在 28.5 °C 下培养，实验期间持续处理以抑制色素形成。</li>
		<li>实验期间每天更换 E3 + PTU 培养基。</li>
		<li>在 2 dpf 时，使用荧光体视显微镜筛选 mpeg1:eGFP 和 NBT:DsRed 幼鱼，检测阳性转基因表达，即 GFP+ 巨噬细胞/小胶质细胞和 DsRed+ 神经元。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有培养基于实验前一天在组织培养超净台内配制，以防污染，随后于 4 °C 保存。
	<ol>
		<li>通过将 15 mM Hepes 和 25 mM D-葡萄糖溶解于 HBSS 1x 中，制备培养基 A。</li>
		<li>通过将 9 份密度梯度培养基与 1 份 HBSS 10x 混合，制备密度梯度培养基（100%）。</li>
		<li>通过将 22 mL 密度梯度培养基（100%）稀释于 88 mL DPBS 1x 中，制备密度梯度培养基（22%）。</li>
		<li>制备 DPBS 1x。</li>
		<li>通过将 E3 培养基与 450 μM Tricaine 混合，制备含 Tricaine 的 E3 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 匀浆化
注意：所有步骤均在 4 °C 下进行。
<ol>
	<li>在含有50条幼鱼的90 mm培养皿中加入1.5 mL Tricaine（15 mM），该培养皿中已加入50 mL经200 µM PTU处理的E3胚胎培养基，以实现终末麻醉。
	<ol>
		<li>使用3 mL塑料巴氏吸管从培养皿中吸取10条已麻醉的幼鱼。</li>
		<li>将麻醉后的幼鱼以每10条为一组，转移至盛有冰冻E3胚胎培养基 + Tricaine的55 mm培养皿中。</li>
		<li>在体视显微镜下，将10条幼鱼排列在培养皿中央，然后使用手术显微剪在卵黄囊上方横切幼鱼头部（需排除 swim bladder，以避免头部漂浮）。</li>
		<li>使用3 mL塑料巴氏吸管吸取培养皿中的头部。等待所有头部聚集在吸管尖端后，将其转移至含有1 mL冰冻Media A的玻璃匀浆器中（转移时体积应尽量小，以减少E3 + Tricaine对Media A的稀释）。将玻璃匀浆器置于冰上。每种实验条件使用一个独立的匀浆器。</li>
		<li>每30分钟更换一次含有冰冻E3 + Tricaine的小培养皿，以确保横切操作始终在低温E3 + Tricaine培养基中进行。</li>
		<li>当玻璃匀浆器中的Media A颜色开始变淡时，更换为新的冰冻Media A。 
		注意： Media A被稀释可能因温度变化而影响头部组织。</li>
		<li>当所有头部收集完毕（每组条件600个头部）后，尽可能吸除玻璃匀浆器中的Media A，并替换为1 mL新鲜的冰冻Media A。</li>
		<li>在冰上使用紧密贴合的玻璃匀浆器破碎脑组织。对于3-5 dpf的幼鱼进行40次碾磨和旋转操作，对于7和8 dpf的幼鱼进行50次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向细胞悬液（1 mL Media A / 200个头部）中加入2 mL Media A，以稀释细胞并减少其与髓鞘的聚集，从而有利于在密度梯度介质中离心时实现分离。
	<ol>
		<li>为消除细胞聚集，将细胞悬液通过置于冰上预冷的50 mL离心管顶部的40 µm细胞筛网过滤，重复此操作3次。</li>
		<li>将1 mL细胞悬液转移至预冷的1.5 mL离心管中，在4 °C下以300 g离心10分钟。</li>
		<li>使用10 mL注射器 + 23G × 1''针头吸除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞沉淀用1 mL冰冻的22%密度梯度介质重悬，并在其上方轻柔地覆盖0.5 mL冰冻的DPBS 1x（不要混合，两种溶液之间将形成明显的界面）。
	<ol>
		<li>在4 °C下以950 g离心30分钟，不启用刹车并采用缓慢加速。 
		注意： 此步骤通过将髓鞘截留在DPBS 1x与22%密度梯度介质之间的界面处，而细胞则沉淀至管底，从而实现髓鞘与其他细胞的分离。当细胞浓度不过高时，髓鞘去除效率更高。</li>
		<li>使用10 mL注射器 + 23G × 1''针头尽可能去除DPBS、密度梯度介质以及滞留在界面处的髓鞘。</li>
		<li>用0.5 mL Media A + 2%正常山羊血清（NGS）洗涤细胞，然后在4 °C下以300 g离心10分钟。</li>
		<li>尽可能弃去上清液，然后将同一实验条件下所有细胞沉淀合并至1 mL Media A + 2% NGS中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若目标细胞表达荧光蛋白，例如来自mpeg1:eGFP转基因鱼的巨噬细胞/小胶质细胞，或来自NBT:DsRed转基因鱼的神经元（转基因鱼筛选参见1.1.3），则将细胞悬液通过带有35 µm滤网帽的细胞筛网，并转移至置于冰上、避光保存的5 mL FACS管中。 
	注意： 也可选择对小胶质细胞进行免疫染色。</li>
</ol>
3. 小胶质细胞免疫染色
注意：所有步骤均在 4 °C 下进行。
<ol>
	<li>用 0.3 mL 的 A 培养基 + 2% NGS 重悬细胞沉淀。将其分装至 3 个 1.5 mL 离心管中：一管用于未染色细胞，以检测目标细胞的自发荧光；第二管用于二抗（1/200），以检测二抗与小胶质细胞的非特异性结合；第三管作为实验组（4C4 小鼠单克隆抗体（小胶质细胞特异性）（1/20）+ 二抗（1/200））。
	<ol>
		<li>向所有离心管中的细胞加入 1% 的低内毒素无叠氮化物（LEAF）试剂，以阻断 CD16/CD32 与免疫球蛋白 Fc 结构域的相互作用。轻轻振荡混匀，每 5 分钟轻摇一次，共孵育 10 分钟。</li>
		<li>向第 3 管细胞中加入 4C4 抗体（1/20），轻轻振荡混匀，每 10 分钟轻摇一次，共孵育 30 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 300 g 离心 10 分钟，弃上清液。</li>
		<li>用 0.5 mL 的 A 培养基 + 2% NGS 洗涤一次，然后在 4 °C 条件下以 300 g 离心 10 分钟。</li>
		<li>用 0.5 mL 的 A 培养基 + 2% NGS 重悬细胞沉淀，加入 1% LEAF 试剂，每 5 分钟轻摇一次，共孵育 10 分钟。</li>
		<li>向第 2 和第 3 管细胞中加入二抗（1/200），避光孵育 30 分钟，每 10 分钟轻摇一次。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 300 g 离心 10 分钟，弃上清液。</li>
		<li>用 0.5 mL 的 A 培养基 + 2% NGS 洗涤两次，然后用 1 mL 的 A 培养基 + 2% NGS 重悬细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞悬液通过 35 µm 细胞筛帽过滤，转移至预冷的 5 mL FACS 管中，置于冰上并避光保存。</li>
</ol>
4. 细胞分选（FACS）
注意：所有步骤均在 4 °C 下进行。
<ol>
	<li>使用流式细胞分选仪（FACS）对神经元、巨噬细胞/小胶质细胞以及小胶质细胞进行分选。 
	注意：此步骤通常由流式细胞仪平台的技术人员操作，具体设置取决于所使用的仪器类型。
	<ol>
		<li>在每根FACS管中加入终浓度为1 µg/mL的DAPI，用于标记死细胞。</li>
		<li>设置流式细胞仪，从所有脑细胞中分选出神经元、巨噬细胞/小胶质细胞或小胶质细胞。根据细胞大小和颗粒度将细胞与碎片分离，通过前向散射光和侧向散射光圈选单细胞。利用DAPI染色排除死细胞，保留活细胞。根据各细胞类型特异性的阳性染色来鉴定神经元、巨噬细胞/小胶质细胞或小胶质细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将分选出的细胞收集至预冷的1.5 mL离心管中，每管含1 mL冰上预冷的Media A + 2% NGS。不同细胞类型使用不同的离心管。
	<ol>
		<li>在4 °C下以300 g离心10分钟，随后弃去上清液。</li>
		<li>用0.5 mL Media A洗涤一次，尽可能弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. RNA 提取
<ol>
	<li>通过流式细胞术分离不同类型的细胞，并从中提取RNA。使用特定试剂盒进行RNA提取，并遵循制造商提供的操作指南。确保在无RNase的环境中操作，使用RNase去污染试剂清洁工作区和移液器，并使用带滤芯的吸头。
	<ol>
		<li>新鲜配制1 mL裂解缓冲液，加入50 µM β-mercaptoethanol。 
		注意： 此处添加β-mercaptoethanol以减少RNA降解。</li>
		<li>使用无RNase的水配制70%和80%乙醇溶液。</li>
		<li>用75 µL含有50 µM β-mercaptoethanol的裂解缓冲液裂解细胞，随后使用匀浆器以增强细胞破碎效果。</li>
		<li>按照试剂盒说明书继续进行RNA提取。</li>
		<li>在实验步骤结束时，用14 µL无RNase的水洗脱RNA，以获得足够的RNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述实验方案是一种从3至8天龄斑马鱼幼鱼中分离脑细胞的可靠且高效的方法。尤为重要的是，这是首个能够从斑马鱼幼鱼脑组织中特异性分离小胶质细胞的方案。该方案旨在保持细胞膜完整性，并最大限度地减少处理过程中可能发生的基因表达改变。最后这一点对于基于分离细胞基因组谱分析所得结果的相关性至关重要。事实上，小胶质细胞和巨噬细胞的极化状态受其微环境的强烈影响。在37 °C条件下，这些细胞会因实验条件（如损伤（横断）反应）而改变其基因表达谱。因此，在RNA提取前于4 °C环境下进行实验至关重要，以减缓细胞过程和代谢活性。此外，选择在4 °C下进行机械性脑组织匀浆，而非在37 °C下进行酶消化，以避免对基因表达谱产生任何影响。
需要强调的是，该方法非常快速；在一天之内，可以从至少两种不同的实验条件下分离出多种脑细胞群体，并提取其RNA。整个实验流程的时长取决于每种条件下所使用的幼鱼数量，因为幼鱼头部的横切是限制性步骤。&#8764; 350 个头/小时）。通常，建议对 3、5 和 7 日龄的幼鱼小胶质细胞进行横切处理 &#8764; 每次实验需 600 个头样以获取足量 RNA 进行提取（表1由于小胶质细胞是得率最低的细胞类型（在7 dpf时每头约112个细胞），因此对于包括巨噬细胞（在7 dpf时每头约170个细胞）在内的其他细胞类型，可减少使用头数。
该方案的另一个优势在于，一旦确定了流式细胞分选仪的设置参数，这些参数便可用于不同的实验。已观察到，使用先前设计的门控策略，细胞群在不同实验之间具有极好的一致性，表明采用该方法的实验具有良好的可重复性。
该方法的一个轻微缺点是所获得的RNA量相对较少。然而，这一限制更多是生物学问题而非技术问题，因为在脑发育的早期阶段，小胶质细胞的数量非常少（表1）。由于所收集的RNA量较少，因此在进行全基因组范围的基因表达分析时需要考虑扩增步骤。幸运的是，这些扩增步骤能够产生足量的高质量cDNA，从而可以研究分离细胞中基因表达谱的全局变化。
总之，本方案提供了一种从幼年斑马鱼脑中分离和研究各种中枢神经系统细胞类型的可靠方法。该方法可用于深入理解这些细胞在发育过程中的作用，以及研究其在疾病中的功能。

自首次对小鼠脑转录组进行定量分析以来的十年间，人们对大脑发育和脑部疾病的认知取得了显著进展1。事实上，全基因组基因表达分析使我们能够获取有关脑组织和细胞的详细遗传信息，这些信息可与其他技术与工具所获得的观察结果相互补充并加以完善。
斑马鱼是一种强大的生物学模型，易于繁殖和进行遗传改造；其在幼体阶段具有光学透明性，便于进行活体成像观察2。然而，与人类和小鼠相比，可用于免疫染色的抗体数量相对较少。为弥补这一不足，可通过遗传改造构建转基因斑马鱼品系，使其在特定细胞类型的启动子驱动下表达荧光蛋白。过去，转基因斑马鱼品系已被用于研究巨噬细胞和小胶质细胞在中枢神经系统（CNS）发育和疾病中的作用3,4,5,6。然而，要深入理解这些过程，我们需要了解相应细胞类型中基因表达的变化。为此，我们开发了一种实验方法，可从受精后3至8天（dpf）的斑马鱼幼体脑组织中特异性分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞。在建立该实验方案时，我们使用了两种转基因鱼系：一种在巨噬细胞表达基因启动子（mpeg1:eGFP）驱动下于巨噬细胞/小胶质细胞中表达绿色荧光蛋白（GFP）；另一种在神经元β-微管蛋白启动子（NBT:DsRed）驱动下于神经元中表达DsRed7,8,9。此外，我们还使用4C4抗体对小胶质细胞进行免疫染色，4C4是一种可特异性标记斑马鱼小胶质细胞的小鼠单克隆抗体10,11。随后，从这些细胞中提取核糖核酸（RNA），用于后续的定量聚合酶链式反应（qPCR）或转录组分析。本方案旨在高效均质化斑马鱼幼体的脑组织；在不破坏细胞质膜完整性的前提下收集神经元、巨噬细胞/小胶质细胞以及小胶质细胞；最终获得高质量（RIN &#62; 7）和高产量的RNA，以用于基因组分析。与以往研究中采用37 °C胰蛋白酶消化脑组织的方法不同12,13，本方案建议在整个操作过程中直至RNA提取步骤均在4 °C下进行，以减少基因表达谱的改变。这一步骤至关重要，因为小胶质细胞和巨噬细胞是高度敏感的细胞，会立即响应微环境变化，从而改变其基因表达谱和极化状态14,15,16。
本方案详细描述了从斑马鱼幼体脑组织中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞的方法，但该方法实际上可适用于脑内几乎所有其他类型的细胞——可通过使用转基因鱼系或特异性抗体标记来实现。该技术将有助于通过全基因组范围的基因表达分析，更深入地表征中枢神经系统细胞，并促进理解这些细胞在发育过程及脑部疾病中的作用。

<table><tbody><tr><td>1-苯基-2-硫脲（PTU）</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Gibco</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>三卡因（MS222）</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin 标准 90 mm 培养皿</td><td>ThermoFisher</td><td>101VIRR</td><td></td></tr><tr><td>外科显微剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 巴斯德塑料批量移液管</td><td>SLS</td><td>PIP4206</td><td></td></tr><tr><td>玻璃匀浆器</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin 标准 55 mm 培养皿</td><td>ThermoFisher</td><td>P55V</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 聚丙烯圆锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>23G × 1'' 针头</td><td>BD</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清（NGS）</td><td>Cell Signalling</td><td>5425S</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;mu;m 细胞筛盖</td><td>BD</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>低内毒素、无叠氮化钠（LEAF）</td><td>Biolegend</td><td>101321</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 山羊抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-4C4</td><td>由爱丁堡大学 Catherina Becker 提供</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS 分选仪 FACSAria II</td><td>BD</td><td>QMRI，FACS 设施</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;31350-010</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 第一链合成系统</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 96 实时荧光定量 PCR 系统&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq 系统 V2</td><td>NuGEN</td><td>7102-32</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico 试剂</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

从幼年斑马鱼大脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞及其rna提取

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

为了深入了解不同中枢神经系统细胞在发育过程中，或在脑部病理发生与进展中的作用，重要的是在不改变其基因表达谱的情况下分离这些细胞。斑马鱼模型提供了大量转基因鱼系，可在其中对特定细胞类型进行标记；例如 NBT:DsRed 鱼系中标记的神经元，或 mpeg1:eGFP 鱼系中标记的巨噬细胞/小胶质细胞。此外，已有针对特定细胞的抗体被开发出来，例如使用 4C4 抗体标记小胶质细胞。
本文描述了从斑马鱼幼体脑组织中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞的方法。该方案的关键在于避免在37 °C下进行酶消化处理，因为这可能会改变细胞的特性。取而代之的是在4 °C下采用机械法进行组织匀浆。本方案包括将脑组织匀浆制成单细胞悬液，进行免疫染色，随后通过流式细胞术（FACS）分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞。随后，我们从这些细胞中提取RNA，并评估其质量与数量。我们成功获得了高质量的RNA（RNA完整性数值（RIN）&#62; 7），可用于对巨噬细胞/小胶质细胞和神经元进行qPCR分析，以及对小胶质细胞进行转录组分析。该方法有助于更准确地表征这些细胞，并更清晰地理解其在发育和疾病中的作用。

本方案是一种从斑马鱼幼体脑组织中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞的简便方法。从这些分离的细胞中可提取到大量高质量（RIN &gt; 7）的RNA。该方案的目的是从中枢神经系统（CNS）中分离不同类型的细胞，同时尽可能减少其基因表达谱的改变，以便分析和表征细胞的特性与功能。因此，整个操作过程均在4 °C下进行，并采用机械法对脑组织进行匀浆。本方法已在实验室的两项研究中成功应用。在第一项研究中，从8 dpf的mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+幼鱼中分离出神经元以及巨噬细胞/小胶质细胞（图1）。通过FACS可根据细胞大小（FSC-A）和颗粒度（SSC-A）将细胞与碎片分离（图1A）。随后将单细胞与双联体或细胞聚集体区分开来（图1B）。在单细胞群体中设定门控以排除死细胞（DAPI+）。相应的点图显示，该实验方案能较好地保持细胞质膜完整性，死细胞比例仅为26.7%（图1C）。最后，神经元（DsRed+）和巨噬细胞/小胶质细胞（GFP+）可从活细胞门控中被清晰分选出来。在脑组织中，神经元群体（23.1%）的比例明显高于巨噬细胞/小胶质细胞群体（1.56%）（图1D）。该方案可用于从上述细胞中提取RNA，进而进行qPCR分析，以比较神经元与巨噬细胞/小胶质细胞之间特定基因的表达水平。图2以β-actin持家基因为对照，展示了神经元和巨噬细胞/小胶质细胞中增殖细胞核抗原（pcna）的基因表达水平示例。
第二项研究采用该方法从3、5和7 dpf幼鱼脑组织中分离小胶质细胞。与上述实验不同，细胞通过免疫染色法分离，使用特异性标记小胶质细胞的抗体4C4（图3 A-D）。如前所述，从小胶质细胞（4C4+）中筛选活细胞并进行收集（图3D）。斑马鱼幼鱼脑组织中小胶质细胞的数量存在差异（表1），在3 dpf时数量极低（每尾鱼约25个）。采用基于微毛细管电泳的系统检测这些细胞提取RNA的质量和数量。所提供的5 dpf斑马鱼幼鱼脑组织小胶质细胞提取RNA结果用于展示RNA分析的示例（表1（5 dpf；实验4））。图4显示了该样本的电泳图谱及其图形表示，可清晰观察到核糖体RNA（28s和18s）。这些数据用于计算样本的RIN值并确定RNA浓度。表1总结了在3、5和7 dpf不同实验中每尾鱼分离的小胶质细胞数量、每个小胶质细胞的RNA含量以及获得的RIN评分。采用该方法从小胶质细胞中提取的RNA在数量和质量上均足以使用试剂盒将其扩增为cDNA。爱丁堡基因组学中心提供的质量和数量检测结果证实，扩增所得的cDNA质量足够高，可用于文库构建及后续测序。图5显示了通过电泳系统测定的cDNA片段大小分布及其含量。在此样本中，cDNA平均长度为299 bp，浓度为36100 pmol/L。表2分别列出了对RNA样本扩增后的cDNA进行的质量和数量检测结果（表1（5 dpf；实验4））。扩增后的cDNA已成功用于测序。
实验室中开展的多项研究证实，从神经元、巨噬细胞和小胶质细胞中提取的RNA在质量和数量上均适用于后续的qPCR及全基因组范围的基因表达分析。因此，该实验方案可用于可靠地分离不同类型的中枢神经系统细胞，同时保持其膜完整性，并最大限度减少对其基因表达谱的改变。
<img alt="分析细胞群体的流式细胞术散点图，FSC/SSC 和荧光数据示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：从 mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 8 日龄斑马鱼幼鱼中通过 FACS 分选神经元和巨噬细胞/小胶质细胞。 （A–C）连续设门显示逐步筛选全部脑细胞（A）、通过前向散射和侧向散射筛选单细胞（B）。（C）通过 DAPI 标记排除死细胞。（D）神经元和巨噬细胞/小胶质细胞分别通过 DsRed 和 GFP 阳性染色进行鉴定。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元和巨噬细胞中β-actin、PCNA的相对表达量图表，含p值和倍数变化数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：神经元及巨噬细胞/小胶质细胞中pcna与β-actin的基因表达分析。 从分离的神经元和巨噬细胞/小胶质细胞中提取的RNA可反转录为cDNA，用于定量PCR分析。通过qPCR测定分离的神经元和巨噬细胞/小胶质细胞中以持家基因β-actin为参照的pcna mRNA表达水平（N = 3）。采用比较法（ΔΔCT法）计算倍数变化。误差线表示均值 ± 标准误（SEM）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞分选的流式细胞术图谱；A-D 图显示 FSC、SSC、DAPI、4C4 单细胞数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：从 3 dpf 斑马鱼幼鱼中进行 FACS 分选小胶质细胞。 （A-C）连续设门显示所有脑细胞（A）、通过前向散射和侧向散射筛选单细胞（B）的逐步选择过程。（C）通过 DAPI 标记排除死细胞。（D）通过 4C4 阳性染色鉴定小胶质细胞。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RNA色谱结果；电泳图，RNA完整性（RIN）分析；样品浓度，峰形。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：从5天龄斑马鱼小胶质细胞中提取的RNA的微毛细管电泳结果。 两个较高的峰分别为18S和28S核糖体RNA。RNA完整性数值（RIN）由生物分析仪软件根据18S与28S核糖体亚基的比值以及整个电泳图谱的分析自动计算得出。小胶质细胞RNA的RIN为8.6。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电泳图谱；DNA浓度分析；峰表数据；片段大小鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：来自5天斑马鱼小胶质细胞RNA样本扩增的cDNA的质量和数量检测。 图像显示了分析样本的cDNA片段大小分布，平均大小为299 bp。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>条件</td>
			<td>实验</td>
			<td>鱼数量</td>
			<td>细胞数量</td>
			<td>每条鱼的细胞数</td>
			<td>RNA浓度 (pg/μL)</td>
			<td>总RNA (pg)</td>
			<td>每个细胞的RNA量 (pg)</td>
			<td>RIN评分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17.03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37.55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31.15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0.16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18.54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0.10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19.94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0.26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0.07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54.18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0.09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84.59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0.06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99.87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0.08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092</td>
			<td>0.06</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：来自3、5和7天斑马鱼幼鱼的小胶质细胞分离与RNA提取数据汇总。
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>内部样本编号</td>
			<td>外部样本编号</td>
			<td>Qubit (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(ng/ul)</td>
			<td>平均浓度 (ng/ul)</td>
			<td>体积 (ul)</td>
			<td>收到的微克数 (ug)</td>
			<td>最低浓度通过/未通过</td>
			<td>最低数量通过/未通过</td>
			<td>推荐数量通过/未通过</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10907SD0010</td>
			<td>5 dpf  (实验 4)</td>
			<td>58.8</td>
			<td>58.4</td>
			<td>58.6</td>
			<td>30</td>
			<td>1.76</td>
			<td>通过</td>
			<td>通过</td>
			<td>通过</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">文库构建样本要求：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>文库构建</td>
			<td>最低数量 (ng)</td>
			<td>推荐数量 (ng)</td>
			<td>最低浓度 ng/uL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Nano 无凝胶 350 bp 插入片段 cDNA 文库</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：来自5天斑马鱼小胶质细胞RNA样本扩增cDNA的定量检测。

我们介绍一种从幼年斑马鱼大脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞的方案，适用于生理和病理条件。分离后，从这些细胞中提取RNA，以分析其基因表达谱。该方案可获得高质量的RNA，用于后续的qPCR和转录组学等分析。

从幼年斑马鱼大脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞及其RNA提取

为了深入了解不同中枢神经系统细胞在发育过程中，或在脑部病理发生与进展过程中的作用，有必要……

本实验方案的总体目标是从幼年斑马鱼脑组织中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞，并提取高质量RNA，用于后续分析，如qPCR和转录组学研究。转基因幼年斑马鱼是活体成像的有力工具，使我们能够在活体环境中长期观察小胶质细胞等单个细胞的行为。然而，为了深入理解这些细胞的功能，我们需要了解其基因表达谱，而本方案所描述的细胞分离与分选流程正是为此目的而设计的。该技术的主要优势在于，能够以最小程度改变中枢神经系统细胞的基因表达谱为前提，分离出不同类型的细胞，从而实现对细胞功能和特性的表征。本方案的效率体现在其高效性上。采用该方案，可在较短时间内获得足量的RNA，用于多种下游应用。根据文本方案，在含有PTU的E3培养基中培养斑马鱼胚胎后，使用荧光体视显微镜在受精后2天（dpf）筛选DsRED阳性神经元中GFP阳性的巨噬细胞和小胶质细胞。为使胚胎在某一时间点均一化，按每50个幼鱼加入含1.5 ml 15毫摩尔Tricaine的50 ml培养基进行麻醉处理。随后，使用3 ml巴斯德吸管每次转移10个幼鱼至盛有冰冷E3培养基（含Tricaine）的55 mm培养皿中，以进行终末麻醉。在体视显微镜下，将10条幼虫排列于培养皿中央，然后使用手术显微剪在卵黄囊上方横切幼虫头部。用一支3 ml的巴斯德吸管吸取所有头部组织，并尽量减少液体量，将其转移至含有1 ml预冷的A培养基的玻璃匀浆器中，该匀浆器需置于冰上。每30分钟更换一次盛有预冷E3溶液加三卡因的小培养皿，以确保横切操作始终在低温的E3加三卡因溶液中进行。当玻璃匀浆器中的预冷A培养基颜色开始变淡时，及时更换新的预冷A培养基。收集完全部脑组织后，将玻璃匀浆器中的所有A培养基移除，并替换为1 ml新鲜的预冷A培养基。保持匀浆器处于冰上，使用贴壁的研杵对脑组织进行破碎：对于3至5天的幼鱼，进行40次碾磨和旋转；对于7至8天的幼鱼，则进行50次。随后，向细胞悬液中加入2 ml A培养基，以稀释细胞并减少其与髓鞘的聚集。通过将细胞悬液经40微米细胞滤网过滤至冰上预冷的50 ml离心管中，以消除细胞聚集现象。重复此步骤三次。将1 ml细胞悬液分装至预冷的1.5 ml离心管中，在4°C、300 ×g条件下离心10分钟。然后，使用带23号一英寸针头的10 ml注射器小心吸除上清液。加入1 ml预冷的22%密度梯度介质，轻柔地覆盖0.5 ml预冷的1×DBPS，轻柔重悬细胞沉淀。在4°C条件下，以950 × g离心30分钟，离心过程中采用慢速加速且不设刹车。离心结束后，弃去DBPS密度梯度介质以及位于两相界面处的髓鞘残留物。然后用0.5 ml含2% NGS的培养基A洗涤细胞，在4°C条件下以300 × g离心10分钟。尽可能吸除上清液，随后将相同实验条件下收集的细胞沉淀合并于1 ml含2% NGS的培养基A中。若目标细胞表达荧光蛋白，则将细胞悬液通过35 µm细胞滤网帽，转移至预冷的5 ml流式管中，置于冰上并避光保存。为了对小胶质细胞进行免疫染色，使用 0.3 ml 的 A 培养基加入 2% NGS 重悬细胞沉淀，然后将细胞分装到三个 1.5 ml 离心管中，其中一管用于未染色细胞以检测自发荧光，一管用于检测二抗对小胶质细胞的非特异性结合，第三管作为实验组。向所有离心管中加入 1% 低内毒素无叠氮化物的 a leaf，以阻断 CD16 和 CD32 与免疫球蛋白 Fc 结构域的相互作用。随后，在轻柔振荡条件下孵育 10 分钟，每 5 分钟轻柔混匀一次。接着，向第三支试管中加入4C4抗体，轻轻振荡，每10分钟轻柔混匀一次，孵育30分钟。然后在4摄氏度条件下以300 × g离心10分钟。弃去上清液后，用0.5 mL含2% NGS的A培养基将沉淀洗涤一次，随后再次离心。用0.5 ml含2% NGS的培养基A重悬细胞沉淀，然后加入1% leaf，每5分钟轻柔振荡一次，孵育10分钟。向第2管和第3管中加入二抗，并将试管置于避光环境中。离心后弃去上清液，用0.5 ml含2% NGS的培养基A洗涤样品两次，然后用1 ml含2% NGS的培养基A重悬细胞沉淀。将细胞悬液通过35微米细胞滤筛帽过滤，并转移至预冷的5 ml FACS管中，置于冰上并避光保存。最后，根据文本方案进行FACS分选和RNA提取。本研究中，从8天龄mpeg1 EGFP阳性、NBT dsRED阳性的幼鱼中分离出神经元以及巨噬细胞和小胶质细胞。采用FACS根据细胞的大小和粒度将其与碎片分离。随后将单个细胞与双联体或细胞聚集体分离开来。从单细胞群体中设门以去除死细胞。相应的点图显示，该实验方案能够保持细胞质膜的完整性，因为死细胞比例仅为26.7%。如图所示，神经元以及巨噬细胞和小胶质细胞可轻松从活细胞群体门控中分离开来。在脑组织中，神经元群体的数量似乎多于巨噬细胞和小胶质细胞群体。在另一项研究中，使用FACS分选技术，通过4C4抗体从幼鱼脑组织中分离出活的微胶质细胞，该抗体可特异性标记微胶质细胞。如本表中微胶质细胞分离与RNA提取数据的总结所示，斑马鱼幼鱼脑组织内的微胶质细胞数量存在差异，且在受精后三天（3 dpf）时数量极低。最后，本电泳图谱展示了一次实验中从受精后五天（5 dpf）斑马鱼幼鱼脑组织微胶质细胞提取RNA的结果，可清晰观察到核糖体RNA的条带。一旦掌握，该技术所需时间约为12小时，具体时长取决于每种条件下需要处理的样本数量。在操作过程中，必须始终注意保持所有材料处于低温环境，并确保操作表面清洁，以避免RNA降解。该技术建立后，为以斑马鱼为模型研究神经系统科学的研究人员提供了探索不同细胞在生理和病理条件下基因表达谱的新途径。观看视频后，您应充分了解如何从幼年斑马鱼脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞，以及如何提取高质量RNA以进行qPCR和转录组学等下游分析。

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斑马鱼脑幼虫神经元、巨噬细胞和小胶质的分离和 RNA 提取

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关键词：小胶质细胞，免疫染色，荧光激活细胞分选，斑马鱼，脑细胞，细胞分离

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向幼年斑马鱼脑室微量注射脂多糖以评估神经炎症与神经毒性

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斑马鱼幼虫肠道分离用于单细胞RNA测序

我们展示了一种利用快速扫描共聚焦显微镜对发育中斑马鱼视顶盖内的小胶质细胞进行活体成像的方法，从而实现对这些细胞动态行为的分析 体内.

活体成像与斑马鱼胚胎小胶质细胞动态的表征

学习从斑马鱼幼虫脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞并提取高质量RNA的技术，用于qPCR和转录组学等下游分析，以研究中枢神经系统细胞在生理和病理条件下的基因表达特征。

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