斑马鱼脑幼虫神经元、巨噬细胞和小胶质的分离和 RNA 提取
2018年4月27日
我们提出了一种在生理和病理条件下, 从斑马鱼脑中分离出神经元、巨噬细胞和小胶质的协议。分离后, 从这些细胞中提取 RNA, 分析其基因表达谱。该协议允许收集高质量的 RNA 来执行下游分析, 如 qPCR 和转录组学。
该方案的总体目标是从幼虫斑马鱼大脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞，并提取高质量的 RNA 以进行下游分析，如 qPCR 和转录组学。转基因幼虫斑马鱼是实时成像的强大工具，为我们提供了随着时间的推移观察生活环境中小胶质细胞等单个细胞的机会。然而，为了详细了解它们的功能，我们需要了解它们的基因表达谱，我们的分离和分选方案就是为此目的而设计的。
该技术的主要优点是它可以从中枢神经系统中分离出不同类型的细胞，对其基因表达谱的修改最小，从而可以表征细胞功能和特性。该协议的效率反映在其有效性上。使用该方案，可在短时间内产生足够量的 RNA，用于各种下游应用。
根据文本方案在含有 PTU 的 E3 培养基中培养斑马鱼胚胎后，使用荧光立体显微镜以两个 dpf 筛选幼虫的 GFP 阳性巨噬细胞和 DsRED 阳性神经元中的小胶质细胞。为了在某一点使胚胎匀浆，每 50 ml 培养基中加入 5 ml 15 毫摩尔三卡因，向 50 只幼虫制备麻醉剂。然后使用 3 ml 巴斯德移液管一次将 10 只幼虫转移到装有冰冷的 E3 培养基和三卡因的 55 ml 培养皿中，以最终麻醉它们。
在立体显微镜下，将 10 只幼虫对准培养皿的中心，然后使用手术显微剪刀横切卵黄囊上方的幼虫头部。用 3 ml 巴斯德移液管，吸起所有头部，用尽可能少的液体将它们转移到含有 1 ml 冰冷培养基的冰上玻璃匀浆器中 A.每 30 分钟更换一个含有冰冷的 E3 加三卡因的小培养皿，以确保在冷的 E3 加三卡因培养基中进行横切。当颜色开始褪色时，更换玻璃均质器中的冰冷介质 A。
收集整组头部后，从玻璃匀浆器中取出所有培养基 A，并用 1 毫升新鲜的冰冷培养基 A 代替，在匀浆器仍在冰上的情况下，使用紧密贴合的研杵通过对 3 到 5 只 dpf 幼虫进行 40 轮粉碎和翻动来破坏脑组织，对 7 到 8 只 dpf 幼虫进行 50 轮。然后向细胞悬液中加入 2 ml 培养基 A 以稀释细胞并减少它们与髓鞘的聚集。通过将细胞悬液通过 40 微米细胞过滤器运行到冰上的冷 50 ml 猎鹰管中，消除细胞聚集。
重复此步骤 3 次。将 1 ml 等分试样的细胞悬液转移到 1 点 5 ml 的冷管中，并以 300 倍 g 和 4 摄氏度离心 10 分钟。然后，使用带有 23 号 1 英寸针头的 10 ml 注射器去除上清液。
用 1 ml 冰冷的 22% 密度梯度培养基轻轻覆盖零点 5 ml 冰冷的 1X dbps，轻轻地重悬细胞沉淀。以 950 倍 g 的速度旋转试管，在 4 摄氏度下缓慢加速，持续 30 分钟。旋转后，丢弃捕获在其界面的髓鞘中的 dbps 密度梯度培养基。
然后使用零点 5 ml 培养基 A 和 2% NGS 洗涤细胞，并在 4 摄氏度下以 300 倍 g 离心试管 10 分钟。去除尽可能多的上清液，然后将来自相同实验条件的细胞沉淀一起拉入 1 ml 含 2% NGS 的培养基 A 中。如果感兴趣的细胞表达荧光蛋白，则将细胞悬液通过 35 微米细胞过滤器盖，然后将它们转移到冰上避光的 5 ml Facs 冷管中。
为了对小胶质细胞进行免疫染色，使用零点 3 ml 培养基 A 加 2% NGS 重悬细胞沉淀，然后将细胞分成三个 1 点 5 ml 管，一个用于未染色细胞测量自发荧光，一个用于测量二抗与小胶质细胞的非特异性结合，第三个作为测试。向所有试管中加入 1% 的低内毒素无叠氮化物或叶子，以阻断 CD16、CD32 与免疫球蛋白 FC 结构域的相互作用。然后，每 5 分钟轻轻搅拌一次，孵育细胞 10 分钟。
接下来，向第三管中加入 4C4 抗体，每 10 分钟轻轻搅拌孵育 30 分钟。然后以 300 倍 g 和 4 摄氏度离心试管 10 分钟。弃去上清液后，用零点 5 ml 培养基 A 加 2% NGS 洗涤沉淀一次，然后再次旋转试管。
用零点 5 ml 培养基 A 和 2% NGS 重悬细胞沉淀，然后加入 1% 的叶子，每 5 分钟轻轻搅拌一次，孵育细胞 10 分钟。对于试管 2 和 3，添加二抗并将试管置于避光处。旋转试管并弃去上清液后，使用零点 5 ml 培养基 A 加 2% NGS 洗涤样品两次，然后用 1 ml 培养基 A 加 2% NGS 重悬细胞沉淀。
将细胞悬液穿过 35 微米细胞过滤器盖，并将其转移到避光冰上的 5 ml 冷 FACS 管中。最后，根据文本方案进行 FACS 分选和 RNA 提取。在本研究中，从 8 只 dpf mpeg1 EGFP 阳性 NBT dsRED 阳性幼虫中分离出神经元和巨噬细胞加小胶质细胞。
FACS 用于根据细胞的大小和粒度功能将细胞与碎片分离。然后将单细胞与双峰或细胞团聚体分离。从单个细胞群中，绘制一个门以消除死细胞。
相应的点图显示，该实验方案保留了细胞质膜的完整性，因为死细胞的比率仅为 26.7%。如图所示，神经元和巨噬细胞加上小胶质细胞很容易与活细胞群门分离。在大脑中，神经元群似乎比巨噬细胞和小胶质细胞群更突出。
在第二项研究中，FACS 分选用于用 4C4（一种特异性标记小胶质细胞的抗体）从幼虫大脑中分离活的小胶质细胞。如下表中的小胶质细胞分离和 RNA 提取数据所总结的那样，斑马鱼幼虫大脑中的小胶质细胞数量各不相同，并且非常低，为 3 dpf。最后，通过从 5 个 dpf 幼虫斑马鱼大脑的小胶质细胞中进行的一项实验获得的 RNA 提取结果显示在该电泳轨迹中，并清晰地显示了核糖体 RNA。
一旦掌握，这项技术可以在 12 小时内完成，具体取决于每种情况需要多少个头。在尝试此过程时，请务必记住保持所有物品低温和表面清洁，以避免 RNA 降解。开发后，这项技术为神经科学领域的研究人员使用斑马鱼作为模型来探索生理和病理条件下不同细胞的基因表达谱铺平了道路。
看完视频后，您应该对如何从斑马鱼幼虫大脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞，以及如何提取高质量的 RNA 进行下游分析（如 qPCR 和转录组学）有很好的了解。
概述
本研究提出了一种从幼体斑马鱼脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞的协议，重点关注生理和病理条件。主要目标是提取高质量RNA用于下游分析，包括qPCR和转录组学，以了解这些细胞类型的基因表达谱。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 遗传学
背景
- 转基因幼体斑马鱼有效用于单个细胞的活体成像。
- 特定细胞类型的分离对于研究其功能至关重要。
- 理解基因表达谱有助于表征细胞特性。
- 该协议允许在分离过程中对基因表达进行最小修改。
研究目的
- 使用幼体斑马鱼作为分离中枢神经系统细胞的模型。
- 分析分离的神经元、巨噬细胞和小胶质细胞的基因表达谱。
- 促进下游应用，如qPCR和转录组学。
使用的方法
- 在各种条件下从幼体斑马鱼脑中分离细胞。
- 使用荧光来识别和分离特定的细胞类型。
- 多次离心和重悬步骤以获得纯度。
- 采用FACS分选以将细胞与碎片和双重体分开。
主要结果
- 研究在细胞分离中实现了高纯度，细胞死亡率最小。
- RNA提取足以用于下游分析。
- 基因表达谱的见解有望增强对细胞功能的理解。
结论
- 该协议能够有效地从斑马鱼中分离重要的中枢神经系统细胞类型。
- 它增强了研究基因表达和细胞功能的潜力。
- 对于理解健康和疾病中的神经元机制具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating specific CNS cell types from larval zebrafish without altering their gene expression enables mechanistic de-risking in early target validation. This approach supports phenotypic screening and assay development by providing disease-relevant systems with high transcriptional fidelity. The resulting RNA quality (RIN > 7) allows reliable qPCR and transcriptomic analysis, improving predictive confidence in lead identification and preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating neurons, macrophages, and microglia with preserved gene expression profiles.
- Operational Value: Uses transgenic lines (NBT:DsRed, mpeg1:eGFP) and 4C4 antibody staining for specific cell isolation without enzymatic digestion that could alter cellular states.
- Predictive Value: Supports biological de-risking and functional target validation by providing access to native CNS cell populations for pathway clarification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological suspensions ready for downstream functional assays and compound screening.
- Operational Value: Employs FACS with 35 micron straining and density gradient purification to ensure single-cell suspensions free of agglomerates and debris.
- Assay Readiness: Delivers high-quality RNA (RIN > 7) suitable for quantitative gene expression analysis, enabling reliable compound evaluation in phenotypic screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Provides disease-relevant larval zebrafish brains to study CNS cell roles in development and pathology, supporting biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables transcriptomic analysis of microglia and qPCR in neurons/macrophages, facilitating risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic De-risking: Links isolation protocol to gene expression readouts that help clarify cell-specific mechanisms in neurodevelopment and disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for neuroinflammatory and neurodegenerative targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating live CNS cells with intact gene expression for mechanistic studies.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, reproducible cell isolation and RNA extraction yielding quantitative transcriptional outputs.
- Analytics: Generates high-integrity RNA (RIN > 7) for qPCR and transcriptomics, providing measurable readouts to compare genetic conditions or treatment effects.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical continuity by enabling microglial and neuronal profiling in zebrafish disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for isolating zebrafish CNS cells applicable across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in CNS cell function through native-state isolation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via cold mechanical homogenization, FACS gating, and RNA quality controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early transcriptional data from disease-relevant systems, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated CNS cell expression profiles from zebrafish models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, fluorescent microscopy, and FACS operation for accurate cell sorting.
- Depends on access to cold homogenizers, centrifuges, cell strainers (40 and 35 micron), and FACS equipment maintained at 4°C.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols (e.g., 4C4 antibody, NGS blocking) and RNA extraction QC to ensure consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol across different larval ages (3–8 dpf) and transgenic lines.
- Includes practical limitations such as low microglia yield at early stages (3 dpf) and the need to avoid RNA degradation through strict cold-chain and aseptic handling.
