Name: 小鼠和人源性胃上皮单层培养对再生的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 了解建立小鼠和人源三维胃类器官并将其转移至二维单层培养的方法，用于研究胃上皮细胞再生与伤口愈合机制。该技术适用于大规模实验和幽门螺杆菌感染研究。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIDDK）资助项目 5 R01 DK083402-07（YZ）的支持。

为避免污染，整个操作应在无菌细胞培养罩内完成。人胃底组织根据辛辛那提大学机构审查委员会（IRB）批准的方案（IRB方案编号：2015 - 4869）从接受袖状胃切除术的患者中采集。 
所有小鼠实验均经辛辛那提大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，该委员会管理的设施符合美国实验动物评估和认证协会（AAALAC）标准。
1. 建立人源三维胃底类器官
注意：本实验方案基于本实验室先前发表的研究8。
<ol>
	<li>制备3D类器官培养基，其中包含50% Wnt条件培养基和20% R-spondin条件培养基。
	<ol>
		<li>制备Wnt条件培养基：将L细胞在Wnt生长培养基（Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素）中培养7天，收集培养基，并使用0.22 µm滤器过滤。</li>
		<li>制备R-spondin条件培养基：将经改造的可分泌R-spondin的HEK-293T细胞系在R-spondin生长培养基（Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素）中培养。细胞贴壁2小时后，更换为OPTIMEM生长培养基（含1%青霉素/链霉素），继续培养7天。随后收集R-spondin条件培养基，并使用0.22 µm滤器过滤。 
		注：该方案此前已有发表，更详细的步骤请参见6,7,8。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将生长因子减少、无酚红的基底膜基质在4 °C冰上解冻16小时。在大型塑料容器中，用冰预冷的无Ca2+/Mg2+ DPBS收集组织。在开始步骤1.4前始终保持冰上保存。 
	注：组织来源于接受袖状胃切除术的患者。</li>
	<li>使用镊子，在含有100 mL无Ca2+/Mg2+ Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）的无菌烧杯中剧烈冲洗组织，冲洗约30秒，直至去除碎片和血液。接着，使用无菌纱布擦去上皮层的黏液层。</li>
	<li>使用大号镊子牢固夹住组织的肌层，并用大号弯止血钳用力刮取上皮层。将刮下的上皮碎片收集至无菌聚苯乙烯培养皿中。</li>
	<li>使用刀片将上皮组织切成约2.0 × 2.0 mm2大小的碎片，以优化组织消化效果。用添加抗生素的无Ca2+/Mg2+ DPBS（无Ca2+/Mg2+ DPBS，1%青霉素/链霉素，0.25 mg/mL两性霉素B / 10 mg/mL庆大霉素，50 mg/mL卡那霉素）清洗组织碎片，直至洗涤液无血迹。如需要，可进行多次洗涤。通过将洗涤液经无菌纱布过滤至废液杯中，小心弃去洗涤液。</li>
	<li>将洗涤后的组织碎片收集至一个125 mL玻璃圆底烧瓶中，加入25 mm搅拌子和预热的孵育培养基（基础培养基补充2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、10 mM HEPES缓冲液、1 mg/mL I型胶原酶、2 mg/mL细胞培养级牛血清白蛋白）。用橡胶隔膜密封圆底烧瓶。</li>
	<li>将一根20 G脊髓穿刺针插入隔膜，并通过橡胶软管连接至氧气瓶。为过滤可能的污染物，将滤纸塞入管路中作为过滤装置。开启低流量氧气输出。在隔膜上插入10–15根排气针，以防止隔膜破裂。</li>
	<li>使用夹具将装置固定在铁架台上，并置于设定为37 °C的水浴摇床中孵育30–45分钟。组织孵育15分钟后，取出50 µL孵育培养基，显微镜下观察是否有腺体解离。若腺体密度不足或未从组织中分离，继续孵育5–10分钟。</li>
	<li>孵育结束后，立即使用无菌移液管或直接倾倒，向孵育体系中加入50 mL预热的DMEM/F12培养基。</li>
	<li>将腺体混合物经无菌纱布过滤至四个50 mL锥形管中。将滤液置于冰上15分钟，使提取的腺体沉降至管底。小心不要扰动已沉淀的腺体，使用移液管吸除并弃去上层40 mL上清液。将剩余的10 mL重悬于10 mL含抗生素的DPBS中。</li>
	<li>将混合液均匀分装至5 mL细胞培养试管中。在4 °C条件下以65 × g离心5分钟，小心用移液器吸除上清液。使用移液器或200 µL宽口吸头，将腺体沉淀重悬于已解冻的基底膜基质中，混匀至均一状态。 
	注：此步骤必须在冰上操作，避免基底膜基质在混匀过程中发生聚合。此外，应取50 µL样品进行显微观察，评估腺体密度。理想密度约为70%融合度。</li>
	<li>使用宽口吸头，将腺体以50 µL基底膜基质的体积接种至培养板中。接种过程中避免产生气泡。</li>
	<li>为使基底膜基质聚合，于37 °C孵育10–15分钟。若使用12孔板培养，每孔加入1 mL hFGO培养基（Advanced DMEM/F12培养基补充2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、0.25 mg/mL两性霉素B / 10 mg/mL庆大霉素、50 mg/mL卡那霉素、10 mM HEPES缓冲液、1 mM N-乙酰半胱氨酸、1× N2、1× B27、50% Wnt条件培养基、20% R-spondin条件培养基，并补充100 ng/mL骨形态发生蛋白抑制剂、1 nM胃泌素、50 ng/mL表皮生长因子、200 ng/mL成纤维细胞生长因子10、10 mM烟酰胺和10 µM Y-27632 ROCK抑制剂）。若非使用12孔板，则加入足量培养基以完全浸没基底膜基质液滴。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的湿润细胞培养箱中培养，每4–5天更换一次培养基。</li>
</ol>
2. 建立小鼠来源的三维胃底类器官
注意：本方案此前已发表6。开始实验前，将基底膜基质置于冰上解冻，并准备好所有试剂。
<ol>
	<li>采用研究机构批准的方法处死小鼠。取出小鼠胃组织，并按照先前发表的方案进行解剖。 6. 用 20 mL 冰冷的 Ca 洗涤2+/毫克2+无DBPS 
	注意：使用8至10周龄的C57BL/6小鼠进行胃底胃类器官培养。小鼠通过吸入二氧化碳实施安乐死，随后进行手动颈椎脱位，再取出胃组织。</li>
	<li>剥离胃部的肌肉层及所有可见的血管，操作方法如先前文献所述 6.</li>
	<li>使用无菌剃刀片将胃底与胃窦及前胃分离。用小型手术剪将胃底剪切成约 2.0 x 2.0 mm 的小片。用镊子将组织碎片收集至含有 EDTA 孵育缓冲液（Ca2+/毫克2+无钙镁DPBS，5 mM EDTA），4 °C下轻柔振荡孵育2小时。</li>
	<li>在无菌操作台中，将锥形管和组织碎片置于冰上约5分钟。使用移液器尽可能吸除孵育缓冲液，注意不要扰动组织碎片。加入5 mL振荡缓冲液（1 g D-山梨醇，1.47 g蔗糖溶于100 mL Ca2+/毫克2+无钙镁DPBS）并用力手动震荡2分钟。静置使大碎片沉降，迅速使用1000 μL移液器吸走上层尚未沉降的小碎片。</li>
	<li>将移除的片段在 4 °C 下以 65 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>在避免产生气泡的情况下，吸除上清液，将沉淀重悬于基底膜基质中，并混匀至均匀状态。</li>
	<li>使用宽口吸头将基底膜基质以每孔50 µL接种，随后在37 °C孵育20分钟。</li>
	<li>加入足量 mFGO 生长培养基（含 2 mM L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素、10 mM HEPES 缓冲液、1 mM N-乙酰半胱氨酸、1× N2、1× B27、50% Wnt 条件培养基、20% R-spondin 条件培养基并补充 100 ng/mL 骨形态发生蛋白抑制剂、10 nM 胃泌素、50 ng/mL 表皮生长因子、10 ng/mL 成纤维细胞生长因子 10 以及 10 µM Y-27632 ROCK 抑制剂的 Advanced DMEM/F12 培养基），以完全浸没气泡。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞2 湿润的细胞培养箱。每4至5天更换一次培养基。</li>
</ol>
3. 二维转移的胶原蛋白包被
注意：除非另有说明，所有操作均应在无菌的组织培养罩内进行。在将3D类器官转移至单层培养前24小时开始进行胶原包被。将大鼠尾胶原置于冰上并避光保存。胶原包被的培养板可在4 °C保存，有效使用期最长为2周。若不立即使用包被板，需用封口膜包裹后于4 °C保存至使用时取出。
<ol>
	<li>使用 20 mM 乙酸将鼠尾胶原蛋白稀释至 50 µg/mL。</li>
	<li>用稀释后的胶原蛋白充分覆盖孔板表面。对于标准 12 孔板中的一个孔，加入约 1 mL 胶原蛋白溶液。在无菌操作台中室温孵育过夜。</li>
	<li>每孔用 1 mL 无 Ca2+/Mg2+ 的 DPBS 洗涤两次，并在无菌操作台中室温静置 2 小时，不加盖。</li>
</ol>
4. 二维转染用基底膜基质包被
注意：除非另有说明，所有操作均应在无菌的组织培养罩内进行。在将3D类器官转移至单层细胞前2小时，开始基底膜基质包被。保持基底膜基质处于冰上。包被后的培养板应立即使用，不可长期储存。
<ol>
	<li>在15 mL圆锥形管中，用细胞培养级水以1:10的比例稀释基底膜基质，冰上操作。</li>
	<li>使用移液器将100 µL稀释后的基底膜基质加入标准12孔板的每个孔中。用细胞刮刀将稀释的基底膜基质在孔内均匀铺布，形成均一涂层。</li>
	<li>在37 °C下孵育1 h。</li>
	<li>用移液器吸除残留液体，室温干燥1 h，然后转移3D类器官。</li>
</ol>
5. 将三维 m/hFGOs 转移至二维胃上皮细胞单层
<ol>
	<li>在3D小鼠或人源性FGO培养6至7天后，开始将3D类器官转移至2D单层培养。 
	注意：每孔所需的单层培养建议使用300个完整类器官，或来源于300个类器官的单细胞。在培养状态良好的情况下，预期在12孔板中每孔可获得约150个类器官。</li>
	<li>转移前请确保培养板已包被。 
	注意：基底膜基质包被的培养板具有半透明凝胶层，而胶原蛋白包被的培养板则无明显包被可见迹象。</li>
	<li>通过直接将1 mL无Ca2+/Mg2+的DBPS滴加到类器官球中心，使其从培养板上脱离。</li>
	<li>使用移液器将基底膜基质与类器官混合物收集至细胞培养试管中。每管收集2个基底膜基质球。在40 × g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
	<li>使用真空系统吸除上清液，并尽可能去除基底膜基质。加入4 mL无Ca2+/Mg2+的DBPS重悬，吸除上清液，重复2至3次。若进行完整类器官转移流程，请继续至步骤5.10；若进行单细胞悬液流程，请继续至步骤5.7。</li>
	<li>将细胞解离溶液&#160;预热至37 °C，并向每管中加入1 mL。通过轻轻翻转试管或使用移液器吹打混匀。在37 °C孵育10分钟。</li>
	<li>直接向每管中加入2 mL无Ca2+/Mg2+的DBPS。</li>
	<li>使用26 G针头将混合物推注2至3次。肉眼观察是否形成单细胞。若仍存在类器官或细胞团块，再推注1至2次。</li>
	<li>在40 × g、4 °C条件下离心5分钟。将沉淀重悬于2D FGO培养基中（2D小鼠FGO生长培养基：高级DMEM/F12培养基，添加2 mM L-谷氨酰胺、10 mM青霉素/链霉素、10%胎牛血清、10 mM HEPES缓冲液、1 × N2、1 × B27，并补充10 nM胃泌素、50 ng/mL表皮生长因子、1 µM TGF-β抑制剂和10 µM Y-27632 ROCK抑制剂。2D人源FGO生长培养基：高级DMEM/F12培养基，添加2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、10 mM HEPES缓冲液、10%胎牛血清、10 mM烟酰胺、1 × N2、1 × B27，并补充50 mg/mL卡那霉素、50 ng/mL表皮生长因子、10 µM Y-27632 ROCK抑制剂和1 µM TGF-β抑制剂）。</li>
	<li>将重悬液接种至包被的培养板中。将培养板置于37 °C孵育。每4天更换一次培养基，若培养基变黄则提前更换。单层细胞形成约需4天。</li>
</ol>
6. 使用二维胃上皮细胞单层的划痕伤口实验
<ol>
	<li>当细胞培养达到100%融合度时，使用剃须刀片在单层细胞上划痕。</li>
	<li>在室温下用3.7%多聚甲醛固定单层细胞15分钟，随后在室温下用0.5%非离子型去污剂/PBS处理20分钟以进行通透。</li>
	<li>接着在室温下用2%驴血清封闭单层细胞1小时，然后加入1:1000稀释的H+,K+-ATP酶一抗，在4°C孵育过夜；用0.1%非离子型去污剂/PBS洗涤后，加入1:100稀释的驴抗小鼠488二抗和10 μg/mL Hoechst细胞核染料，在室温下孵育1小时。</li>
	<li>为鉴定二维人源胃上皮单层培养中的表面黏液凹陷细胞，使用20 μg/mL的Ulex europaeus（UEAI）FITC偶联物对细胞进行染色，并在共聚焦显微镜下成像。</li>
	<li>每隔数小时拍摄一次伤口图像。根据单层细胞的质量及患者间的差异，划痕通常在24至48小时内完成再上皮化。</li>
</ol>

<ol><li>Nagy, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+regulates+cellular+migration+and+apoptosis+by+activation+of+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling.</a> J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).</li>
<li>Mnich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Helicobacter+pylori+on+the+healing+process+of+the+gastric+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier.</a> World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bm-TFF2%2C+a+toad+trefoil+factor%2C+promotes+cell+migration%2C+survival+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing.</a> Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).</li>
<li>Crabtree, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cytokines+in+pathogenesis+of+Helicobacter+pylori-induced+mucosal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage.</a> Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li>
<li>Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+microfluidic+strategy+for+cell+migration+assay+in+an+in+vitro+wound-healing+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model.</a> Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).</li>
<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Bertaux-Skeirik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+plays+a+functional+role+in+Helicobacter+pylori-induced+epithelial+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation.</a> PLoS Pathog. 11 (2), e1004663(2015).</li>
<li>Tarnawski, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+gastrointestinal+ulcer+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing.</a> Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).</li>
<li>Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+novel+epidermal+growth+factor-secreting+cell+lineage+by+mucosal+ulceration+in+human+gastrointestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells.</a> Nature. 343, 82-85 (1990).</li>
<li>Wright, C. L., Riddell, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+of+the+stomach+and+duodenum+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Surg+Pathol%22%5BJournal%5D)">Histology of the stomach and duodenum in Crohn's disease.</a> Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).</li>
<li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+Spasmolytic+Polypeptide%2FTFF2-Expressing+Metaplasia+%28SPEM%29+During+Gastric+Repair+Is+Absent+in+the+Aged+Stomach%5BTitle%5D)+AND+%22CMGH%22%5BJournal%5D)">The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach.</a> CMGH. , In Press (2016).</li>
<li>Bertaux-Skeirik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+variant+isoform+9+emerges+in+response+to+injury+and+contributes+to+the+regeneration+of+the+gastric+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium.</a> Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).</li>
<li>Nam, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+chief+cells+are+cryptic+progenitors+for+metaplasia+in+the+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach.</a> Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案详细描述了建立人源和鼠源胃上皮单层细胞的方法，可用于划痕损伤实验。该方案基于从原代人（或小鼠）组织中分离常驻干细胞的概念，是对Schlaermann首次发表的方案进行的改良。 等7特别是，我们在此优化了实验方案，以建立一种融合且具有极性的胃上皮单层细胞层，该细胞层可表达胃上皮中存在的主要细胞谱系。 体内胃溃疡修复是一个复杂的过程，涉及组织再上皮化、再生和增殖9,10,11特别是，本实验室已报道，胃上皮的再生与再生胃腺体边缘出现表达解痉肽/三叶因子（TFF）2的化生性病变（SPEM）相一致。12,13SPEM 定义为壁细胞谱系转分化为黏液细胞化生的过程14 随着损伤出现，并在黏膜恢复至正常细胞组成时消失...

划痕伤口实验是一种研究修复与再生的常用方法1,2,3,4,5,6。本研究所提出的方法可用于专门研究胃部再生及Helicobacter pylori的定植。过去，胃癌细胞系被用于研究Helicobacter pylori（H. pylori）感染1,2，直到最近，诸如AGS细胞等胃癌细胞系仍被广泛使用1,2,3,4。胃癌细胞培养的一个局限性在于其无法重现胃上皮细胞的多样性。为尝试克服这一局限，本文展示了基于Schlaermann et al.7首次描述的改良方法，建立并转移来源于人和小鼠的原代三维胃底胃类器官（FGOs）至胃上皮单层细胞，用于伤口愈合实验。我们证明，由剪切后的三维胃FGOs或FGO来源的单个细胞衍生的胃上皮单层细胞具有极性细胞组成，能够紧密模拟体内胃上皮的结构特征。鉴于胃癌细胞系无法呈现该技术所展示的细胞组成，当前方案相较于其他划痕伤口实验方法具有优势。本方法已优化，单层细胞既可由完整类器官建立，也可由解离类器官获得的单细胞悬液建立，并可在基底膜基质或胶原蛋白包被的培养皿中接种。本方案的总体目标是建立来源于类器官的胃上皮单层细胞培养体系，用于新型伤口愈合实验。

<table><tbody><tr><td>高级DMEM/F12培养基（基础培养基）</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX（L-谷氨酰胺）</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B/庆大霉素</td><td>Thermo Scientific</td><td>R01510</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>RO1510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP抑制剂（Noggin）</td><td>Pepro Tech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>胃泌素</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Pepro Tech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK抑制剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;抑制剂</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 无DPBS</td><td>Fisher</td><td>21-031CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基（DMEM）</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>FBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22&amp;micro;m滤器</td><td>Fisher</td><td>099-720-004</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LS004214</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes（擦拭纸）</td><td>Fischer Scientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr><td>125 mL圆底烧瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1英寸（25 mm）搅拌子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>橡胶隔垫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铁架台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铁架台夹</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 G、1.5英寸长针头</td><td>Thermo Fisher</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20 G、3.5英寸长脊髓穿刺针</td><td>Thermo Fisher</td><td>405182</td><td></td></tr><tr><td>12孔细胞培养板</td><td>Midwest Scientific</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型、酚红-free Matrigel&lt;sup&gt;TM &lt;/sup&gt;（基底膜基质）</td><td>Fisher</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>无菌剃刀刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>宽头镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>弯止血钳</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L宽口移液器吸头</td><td>Thermo Fisher</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>5 mL细胞培养试管</td><td>Fisher</td><td>14-956-3C</td><td></td></tr><tr><td>带橡胶管的氧气瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g D-山梨醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher</td><td>SS-500</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖托盘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾I型胶原</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养级冰醋酸</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养级水</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>2孔腔室载玻片</td><td>Thermo Fisher</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>12孔Transwell（聚酯膜插件）</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Corning</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>Accutase（细胞解离溶液）</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>26&lt;sup&gt;3/8&lt;/sup&gt; G注射器</td><td>Thermo Fisher</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L细胞</td><td>L细胞是一种可产生Wnt3a的细胞系，由荷兰Hubrecht发育生物学与干细胞研究所Hans Clevers博士惠赠。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T R-spondin分泌细胞</td><td>经修饰的可分泌R-spondin的HEK-293T细胞系由美国辛辛那提儿童医院医学中心及辛辛那提大学医学院新生儿科、围产与肺部生物学系Jeff Whitsett博士提供。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HK-ATP酶一抗</td><td>Invitrogen</td><td>SC-374094</td><td></td></tr><tr><td>E-钙黏蛋白</td><td>SantaCruz</td><td>sc-59778</td><td></td></tr><tr><td>UEA1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488二抗（驴抗小鼠488二抗）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37114</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究再生的鼠源和人源原代胃上皮单层培养

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

体外 胃部伤口修复的研究通常采用胃癌细胞系，通过划痕伤口实验来检测细胞增殖与迁移。然而，此类实验的一个关键局限在于其细胞类型的均一性。修复过程十分复杂，需要多种细胞类型之间的相互作用。因此，若培养体系中缺乏细胞亚群，则成为理解修复机制时必须克服的问题。胃类器官模型有望解决这一难题，因其包含的多种细胞类型能够更真实地模拟胃上皮或其他天然组织的细胞组成。 体内. 此处展示的是一种新型的， 体外 源自人或小鼠三维类器官的划痕损伤实验，可将完整类器官或经解离后形成的单细胞悬液接种至胃上皮单层细胞中。本实验方案的目标是建立由类器官衍生的胃上皮单层细胞体系，用于一种新型的划痕损伤实验系统，以研究胃组织再生过程。

类器官来源于人胃体/胃底组织或小鼠胃底组织（图1A）。分别对人或小鼠来源的胃组织进行胶原酶或EDTA消化后，将胃腺体嵌入基底膜基质中，并培养6-7天（图1A）。图1B展示了由人源胃类器官（huFGOs）进一步转移至基底膜基质包被的腔室载玻片上形成的胃上皮单层细胞（huGEM）。培养4天后，融合的huGEM用于划痕损伤实验（图1B）。通过延时成像分析采集的huGEM图像显示，在24小时的培养期间，细胞实现了伤口闭合（图2）。
研究发现，huGEMs 表达了天然胃组织中存在的主要细胞谱系。免疫荧光染色显示，存在一层极化的 E-钙黏蛋白阳性单层细胞，其中包括壁细胞...

本文介绍了一种建立和培养人源及小鼠源三维（3D）胃类器官的方案，以及将三维类器官转化为二维单层细胞的实验方法。同时描述了利用胃上皮单层细胞作为新型划痕损伤模型进行再生研究的方法。

体外胃部伤口修复研究通常采用胃癌细胞系，通过划痕损伤实验检测细胞增殖和……

该培养系统的主要目标是建立一种源自小鼠或人类的原代胃单层细胞模型，用于研究伤口愈合实验中的再生过程。该方法有助于解答胃部研究领域中的关键问题，例如胃上皮细胞在损伤后再生的机制。该技术的主要优势在于：第一，利用源自小鼠或人类的原代胃细胞，在伤口愈合实验中研究细胞迁移与再生过程；第二，可生成人源胃类器官，用于大规模实验。尽管该方法可用于研究胃上皮的再生过程，也可应用于其他系统，如幽门螺杆菌感染以及上皮细胞与免疫细胞的共培养。本实验操作将由本实验室的研究生 Emma Teal 进行示范。首先，将准备好的组织收集到一个盛有无钙镁 DPBS 的大型塑料容器中。使用前将塑料容器置于冰上。接下来，用镊子在含有100毫升无钙镁DPBS的无菌烧杯中剧烈冲洗组织约30秒。然后用无菌纱布擦去上皮层的黏液层。接下来，使用大号镊子牢固地夹住组织的肌层，然后用大号弯头止血钳用力刮取上皮组织。将刮下的上皮组织储存于无菌的聚苯乙烯培养皿中。为了优化组织消化效果，将上皮组织切成细小碎片。然后用不含钙镁的 DPBS 缓冲液（添加抗生素）洗涤组织，多次洗涤以去除血液。将洗涤液弃入废液杯中。然后将洗涤后的上皮组织片段收集到一个含有25毫米搅拌子和预热孵育液的125毫升玻璃圆底烧瓶中。收集完组织片段后，用隔垫密封圆底烧瓶，并使用夹具将装置固定在铁架台上。然后将一根20号脊髓穿刺针插入隔膜中。使用橡胶软管将隔膜连接至氧气瓶。在隔膜中插入10至15根出气针以防止其破裂，随后将氧气出口调至低流量并打开开关。此后，将水浴在搅拌器上校准至 37 摄氏度，持续 30 至 45 分钟。校准完成后，将装置放入水浴中。孵育 15 分钟后，检查是否有解离的腺体。在完成所需的孵育时间后，使用血清移液管向孵育液中加入15毫升预热的DMEMF12培养基。接着，将获得的腺体混合物通过无菌纱布过滤至四个15毫升的锥形管中。然后将滤液置于冰上孵育15分钟。这将使腺体沉降到锥形管底部。使用刻度移液管从腺体悬液上层弃去40毫升上清液。将剩余的10毫升腺体混合物用10毫升添加了抗生素的DPBS重新悬浮。然后将整个混合物分装到5 mL细胞培养试管中。在4°C条件下以65 × g离心5分钟。离心后小心移除上清液。使用宽口的200微升移液器吸头将获得的腺体沉淀溶解于基底膜基质中。混匀悬浮液至均匀状态。然后，在宽口移液器的辅助下，将腺体以15微升基底膜基质进行铺板。为使基底膜基质聚合，需在37摄氏度下孵育10至15分钟。若在12孔细胞培养板中培养，则每孔加入1毫升hFGO培养基。随后将细胞置于37摄氏度、加湿的细胞培养孵箱中进行培养。每45天更换一次培养基。在三维小鼠或人源FGO培养6至7天后，开始将三维类器官转移至二维单层培养。操作时，向气泡中心加入1毫升无钙镁的DPBS，使三维基底膜气泡从培养板上脱落。然后将基底膜基质与类器官混合物收集到细胞培养管中。随后在4°C条件下，以40 × g离心5分钟。离心后，使用真空系统吸除上清液，并尽可能多地去除基底膜基质。然后，将沉淀物溶解于4毫升无钙镁的DPBS中。在收集类器官以制备单层细胞前，务必尽可能去除基底膜基质。接着，向每支试管中加入1毫升预热至37摄氏度的细胞解离溶液。然后通过反复倒置数次混匀管内物质。最后将试管置于37摄氏度孵育10分钟。为获得单细胞悬液，将2毫升无钙镁的DPBS直接加入每支试管中。然后使用26号针头将悬液混合两到三次。混合后，离心细胞悬液，再将细胞沉淀溶解于2D FGO培养基中。为获得完整的类器官，将细胞悬液接种至包被好的培养板上。然后将培养板在 37 摄氏度下孵育约四天。如果培养基颜色变黄，则更换培养基。一旦培养物达到 100% 汇合度，即用剃刀片划伤单层细胞。然后在室温下用3.7%的多聚甲醛固定单层细胞15分钟。接着在室温下用Triton X-100处理单层细胞20分钟以进行通透。通透完成后，用2%驴血清在室温下封闭单层细胞1小时。封闭一小时后，将单层细胞与一抗溶液在4摄氏度下孵育过夜。用封口膜包裹单层细胞，以防止过夜孵育过程中液体蒸发和培养物干燥。次日，用含0.1%非离子去污剂的PBS溶液洗涤。然后，在室温下用二抗和每毫升10微克的宿主细胞核染料孵育一小时。接着，对细胞进行染色。随后，在共聚焦显微镜下鉴定二维人源胃单层培养中的表面黏液凹陷细胞。最后，每隔几小时拍摄一次伤口的图像。这些延时分析图像显示了人源FGO的形成过程。这些类器官被转移至编码的基底膜基质腔室载玻片上的胃上皮单层细胞中。每隔八小时对胃上皮单层细胞进行一次分析，持续一天。图像显示，伤口区域持续减小，并在培养一天后完全消失。该免疫荧光染色显示存在E-cadherin阳性的单层细胞，该单层由表面黏液细胞构成。这表明胃上皮单层细胞的再生。细胞核经hoechst染色。随后，利用从人胃上皮单层细胞中提取的RNA进行RT-PCR分析，以确认壁细胞、表面黏液细胞、主细胞及黏液颈细胞的表达。ATPa 和 PgC 的存在分别表明壁细胞和主细胞的存在；MUC5AC 和 MUC6 的存在分别表明表面黏液细胞和黏液颈细胞的存在。在此免疫荧光图像中，通过 EdU 的高效摄取显示了人胃上皮单层培养中的增殖细胞。这些免疫荧光图像显示了胃上皮在划痕损伤后 0、8、16 和 24 小时的再生情况，以及表面黏液细胞和壁细胞的表达。一旦掌握，若操作得当，三维到二维的转移可在一小时内完成。在进行该操作时，重要的是要记住，在将类器官从三维转移到二维培养前，应充分洗去收获的类器官上的基底膜基质。在完成该操作后，还可进行其他方法，如在单层细胞上建立幽门螺杆菌感染模型以及单层细胞与免疫细胞的共培养，以回答更多科学问题，例如宿主与病原体之间的相互作用。该技术建立后，为胃肠病学领域的研究人员探索胃部疾病及再生机制开辟了道路。请注意，操作人体组织可能具有极高危险性，因此在进行该操作时，必须始终采取无菌技术及个人防护措施等安全预防手段。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠和人源性胃上皮单层培养对再生的研究

本视频介绍了一种从人胃底组织中分离胃上皮细胞的方法。所分离的上皮细胞可作为体外模型，用于研究其在胃生理学和病理生理学中的调控作用。...

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我们详细描述了以下操作步骤：1）利用磁性纳米颗粒高效构建用于慢病毒或逆转录病毒转导的肠道类器官；2）对经基因工程改造的类器官制备冷冻切片。该方法为高效调控类器官中的基因表达以研究其下游效应提供了有力工具。...

利用磁性纳米颗粒转导病毒载体对原代小鼠肠道类器官进行遗传工程改造以用于冰冻切片

在本实验方案中，我们描述了如何直接从肠隐窝分离并培养小鼠原代结肠上皮单层细胞。我们提供了在可渗透滤膜上生成汇合单层细胞的实验方法，用于划痕伤口愈合及生物化学研究的汇合单层细胞培养方法，以及用于免疫荧光分析的稀疏和汇合单层细胞培养方法。...

从小鼠肠道隐窝生成原代结肠上皮单层细胞

从小鼠视网膜获得的穆勒胶质细胞原代培养物是研究微小RNA处理后胶质细胞转化为视网膜前体细胞的一种非常稳健且可靠的工具。可在将其进一步应用于体内实验之前，利用该体系检测单个分子或分子组合的效果。 体内...

原代细胞培养研究微小RNA处理后小鼠穆勒胶质细胞的再生潜能

胃源性患者类器官在研究中的应用日益广泛，但目前尚缺乏从单细胞消化物出发、以标准化接种密度培养人胃类器官的正式方案。本方案提供了一种详细方法，可从上消化道内镜活检组织中稳定地构建胃类器官。...

建立和表征源自良性胃体与胃窦上皮活检组织的患者来源胃类器官

覆盖派尔集合淋巴结的特殊滤泡相关上皮中的M细胞在肠相关淋巴组织的黏膜免疫监视中发挥重要作用。本文描述了评估M细胞介导细菌转胞吞作用的方法。...

应用小鼠结扎派伊尔集合淋巴结肠段环实验评估M细胞对细菌的摄取

了解建立小鼠和人源三维胃类器官并将其转移至二维单层培养的方法，用于研究胃上皮细胞再生与伤口愈合机制。该技术适用于大规模实验和幽门螺杆菌感染研究。

用于研究再生的鼠源和人源原代胃上皮单层培养

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