使用宽场高内涵分析系统对荧光标记组织进行自动载玻片扫描与分割
2018年5月3日
本文介绍了一种利用宽场高内涵分析系统（WHCAS）对载玻片上荧光标记组织进行自动分割的实验方案。该方案在涉及生物组织中荧光标记物定量的各个领域均具有广泛应用，包括生命科学、医学工程和健康科学。
本成像与分析方法的总体目标是建立一种易于设置的工作流程，用于自动分割任何荧光标记的载玻片贴附组织样本。该方法有助于回答生物科学领域中的关键问题，例如在特定感兴趣的组织样本区域内某种特定蛋白质的含量。该技术的主要优势在于可节省优化自动分割方案所需的时间，从而能够将此方法应用于后续的荧光标记载玻片贴附组织样本。
我们最初想到这一方法时，是需要在高倍镜下定量分析脑组织中的新生细胞。导入期刊后，打开“板获取设置”对话框，然后打开“物镜和相机”选项卡。将放大倍数设置为4倍，相机二乘一，增益设置为2。
打开“板式载玻片扫描”选项卡并输入相应的实验设置。在“访问位点”选项卡下，将位点均匀填充至各孔中，并打开“编辑板底设置”选项卡以输入相应的实验参数。将这些设置保存为设置A后，打开“物镜与相机”选项卡，将放大倍数设为40倍，相机二乘一合并（Camera binning）设为1，增益（Gain）设为2。
确认“载玻片扫描”和“编辑载玻片底部设置”选项卡下的所有设置与设定A中输入的内容一致。打开“采集循环”选项卡，输入样品中存在的波长数量，并勾选“启用基于激光的聚焦”和“启用基于图像的聚焦”选项。然后将这些设置保存为设定B。接下来，将最多三张载玻片放入载玻片适配器中，盖玻片朝下，标签位于切口一侧。
然后按 F4 键打开主菜单。选择“载玻片扫描”，点击“打开门并弹出载玻片”以将载玻片适配器插入宽场高内涵分析系统，然后点击“关闭门并加载载玻片”。
首先，确保选择适当的波长。在活体特征图像中移动至不同位置，直至找到目标区域。聚焦于该区域。
如果图像未对准焦距，请使用自动对焦按钮，或调整步长直至清晰对焦。若通过手动调节步长来对焦，请使用“抓取”功能拍摄图像。如需设置先前的扫描，请先加载设置A，然后选择预览载玻片。
标明玻片数量，然后选择“确定”。选择4倍作为放大倍数。接着选择“盖玻片朝下”，并继续选择之前扫描的基线设置。在选择“取消”前，请确保已勾选“采集设置”和“校准”选项，然后按“继续”。
在 W1:DAPI 选项卡下，单击“Live”，然后依次单击“Auto Expose”和“Snap”。完成后，点击“Close”。选择目录并输入先前的扫描名称。
“绘制区域”对话框将自动出现。使用矩形区域工具选择整个先前的扫描区域，然后单击“继续”。在上一次扫描结束时，加载设置B并打开“访问位点”选项卡。
首先，确保选择适当的波长。在活体特征图像中移动至不同位置，直至找到目标区域。聚焦于该区域。
如果图像未对焦，请使用自动对焦按钮，或调整步长直至图像清晰。若通过手动调节步长来对焦，请点击“拍摄”以捕获图像。随后，在 W1 DAPI 选项卡下，点击自动曝光，并确认“板采集拍摄 DAPI”图像清晰锐利。
在主菜单下，点击“Journal”，然后在下拉菜单中选择“Run Journal”。双击“Slide Region Acquisition Setup Journal”以启动程序，当“Setup Slide Region Acquisition”对话框出现时，点击“Continue”。当系统提示选择“DAPI Scan”时，选择低倍率的载玻片图像，然后点击“OK”。当提示选择“Plate Acquisition Snap”时，选中“Plate Acquisition Snap-DAPI”，然后点击“OK”。当“Create or Load Regions”对话框出现时，使用矩形区域工具在DAPI扫描图像上选择感兴趣的区域，然后点击“Continue”。
使用定位工具，选中目标区域，然后在“选择区域”对话框下方点击“继续”。当出现“确认区域”对话框时，点击“继续”，并在“保存区域”对话框出现时决定是否需要保存该区域。随后将出现三个对话框。
单击“继续”以关闭“设置完成”对话框。为消除任何样本位点定位的猜测，确保在“显示设置”选项卡下勾选“采集期间显示图像”，并打开“摘要”选项卡，单击“采集整板”以定位预选兴趣区域的载物台位置。当摄像头移动至包含目标细胞的位点时，单击“取消”以停止图像采集。
如果图像失焦，请勿惊慌。此步骤仅用于定位所选区域中第一个位点的载物台位置。请确认载物台已位于样本上方，并且您已正确输入位点数量。
优化波长设置，以确保获得聚焦于高动态范围的图像。然后再次打开“摘要”选项卡，点击“采集平板”。分析结束后，选择“显示”选项卡。
在“图像叠加”下拉菜单中，选择“显示孔信息”，以在左上角显示位点编号。滚动浏览各个位点，并排除那些失焦和/或包含组织褶皱、气泡或组织撕裂的位点。在此代表性图像中，显示了感兴趣区域内所有位点的高倍缩略图。
应逐一检查每个位点，以确定哪些位点应排除在分析之外。例如，在本实验中，位点149失焦，位点219存在气泡，位点54含有折叠。这三个位点均被排除在分析之外。
此处由多波长细胞评分模块生成的相应叠加图像，展示了根据实验要求定制的第59位点自动分割结果。完成分割后，可获得每种标记物阳性细胞比例、双标记物阳性细胞比例、无标记物阳性细胞比例、平均染色面积以及平均荧光强度等定量数据。观看本视频后，您应能够充分了解如何设置宽场高内涵分析系统，以建立针对载玻片上组织样本成像与分割的自动化工作流程。
概述
本文介绍了一种利用宽场高内涵分析系统（WHCAS）对荧光标记组织进行自动分割的实验方案。该方法可简化生物组织中荧光标记物的定量分析，适用于生物科学和医学工程等多个领域。
关键研究组成部分
科学领域
- 生命科学
- 医学工程
- 健康科学
背景
- 自动分割技术可增强对荧光标记组织的分析。
- 高内涵分析系统有助于对生物样本进行详细成像。
- 组织样本中蛋白质的定量对于理解生物过程至关重要。
- 该方法的开发旨在解决脑组织中新细胞定量中的挑战。
研究目的
- 建立高效的自动化组织样本分割工作流程。
- 提高荧光标记物定量的准确性和速度。
- 提供适用于多种组织类型的标准化操作方案。
使用的方法
- 建立宽场高内涵分析系统用于成像。
- 配置实验参数以实现最佳成像效果。
- 使用软件工具进行图像采集与分析。
- 实施自动对焦及基于图像的聚焦技术。
主要结果
- 成功实现了荧光标记组织的分割。
- 高倍成像提供了组织样本的详细视图。
- 准确识别并分析了感兴趣区域。
- 建立了排除失焦或质量不佳图像的排除标准。
结论
- 自动分割方案显著减少了分析时间。
- 该方法可应用于多种生物组织。
- 未来应用可能促进多个科学领域的研究进展。
常见问题
行业重要性概述
采用宽场高内涵分析系统（WHCAS）进行自动化的载玻片扫描和分割，可解决在大范围组织切片中定量荧光标记物的瓶颈问题，实现可重复、高通量的分析，用于靶点验证和检测方法开发。通过标准化图像采集和分割工作流程，该方法减少了变异，加快了基于组织的生物标志物的临床前评估，支持在早期发现阶段做出数据驱动的决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过量化疾病相关组织中的蛋白质表达模式，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：减少针对单个实验优化实验方案所需的时间，可在多种荧光标记靶标中快速应用。
- 预测价值：通过稳定且定量的标志物定位和表达水平读数，支持机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过生成适用于高内涵检测的标准化、分段组织图像，为下游筛选准备经过验证的生物系统。
- 操作价值：通过自动选择区域并排除受损部位（如失焦、折叠或产生气泡的组织），提高检测的标准化程度和可重复性。
- 可扩展性：通过预构建的软件模块，可在多种标记物和组织类型中重复使用该平台，支持蛋白质定位、增殖、活性、凋亡和血管生成等分析。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过提供标志物阳性细胞比例、平均染色面积和荧光强度的定量数据，实现在从发现到临床前验证过程中的持续一致性。
- 基于风险调整的推进：通过提供可靠且经过排除性过滤的数据集，支持临床前决策，真实反映生物学信号。
- 疾病相关性体系：已证实适用于脑肿瘤组织分析，可扩展至载片组织中任何荧光标记的细胞核或细胞质标志物。
流程与工作流整合
该方法可融入从早期发现、先导化合物鉴定到临床前研究的整个发现流程，能够在各个阶段实现标准化的组织分析。
- Discovery Biology：通过量化特定感兴趣组织区域中的标志物表达，支持假设验证和通路阐明。
- Screening：通过自动分割和定量输出实现检测就绪，可在不同实验场所间可靠地评估化合物。
- Analytics：生成可量化的读出结果，包括阳性细胞比例、平均染色面积和平均荧光强度，支持不同实验条件间的比较。
- Translational Research：提供与生物标志物一致的定量组织数据，适用于验证研究，从而连接临床前研究的连续性。
- Enterprise Reuse：作为可在多个项目中重复使用的能力，利用预构建的软件模块和已保存的设置（设置 A 和 B），实现一致的切片扫描与分割。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证的预测可信度，降低基于组织检测中的机制模糊性。
- 操作价值：组织成像与分析工作流程的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过减少方案优化时间提升决策效率，实现资本利用效率，并降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于定量且经过排除验证的组织数据，进行风险校正后的优先排序和推进决策。
实施注意事项
- 需要具备宽场高内涵分析系统的操作经验以及相关软件的使用技能。
- 依赖于具备载玻片扫描、多波长采集以及基于激光和图像对焦功能的仪器设备。
- 需要跨团队统一采集参数设置（例如，放大倍数、像素合并、增益）和感兴趣区域定义的操作规范。
- 在将该方法应用于不同组织类型、标志物表达或切片厚度时，需考虑相应的适应性调整。
- 存在实际限制，例如尽管采用自动采集，仍需手动排除存在伪影的位点（如失焦图像、组织褶皱、气泡等）。
