通过一种创新的RNA 原位检测技术鉴定啮齿类动物伏隔核中的多巴胺D1-α受体

本项新型RNA原位杂交检测技术的总体目标是可视化特定脑区内单个RNA分子，这对于阐明中枢神经系统疾病过程中多巴胺能功能障碍具有重要意义。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如多巴胺能异常在介导行为反应和调节工作记忆功能中的作用。该方法的主要优势在于提供了一种全新的原位杂交技术，可用于研究中枢神经系统疾病进展过程中多巴胺系统的功能障碍。

尽管该方法可用于了解特定脑区内靶标 mRNA 的总体表达水平，也可用于确定 mRNA 转录本在特定脑区细胞中的分布情况。开始此操作时，应在成年大鼠脑组织取出后五分钟内，将其浸入液氮中 15 秒。接着，将脑组织置于低温恒温切片机中，在 -20 °C 下平衡一小时。

一小时后，从位于前囟前 2.76 毫米至 2.28 毫米处包含伏隔核的组织中切取 30 微米厚的切片，并将切片贴附于载玻片上。随后，在 -20 °C 下干燥切片 10 分钟。接着，将载玻片浸入预冷的 4% 多聚甲醛溶液中，在 4 °C 下固定 1 小时。

接下来，将切片置于室温下的递增浓度乙醇梯度中，然后将切片转移至新鲜的100%乙醇中再处理五分钟。随后，将切片放置在吸水纸上，使其自然晾干。使用画圈笔在每个组织区域周围画出屏障。

让屏障完全干燥一分钟。为预处理脑切片，打开烘箱并将温度设为40摄氏度。在每张脑切片上加入三滴预处理试剂。

然后将切片在室温下孵育30分钟。接着将载玻片浸入1×PBS中，在室温下放置1分钟，再将载玻片转移至新鲜的1×PBS中继续孵育1分钟。载玻片在1×PBS中的总时间不应超过15分钟。

进行多重检测时，将目标探针在40摄氏度水浴中温育10分钟，然后冷却至室温。将RNA试剂置于室温下。用吸水纸除去载玻片上的多余液体，并将载玻片放回载玻片架上。

然后在每个样本切片上加入三滴 Drd1alpha 作为探针，并在 40 摄氏度下孵育样品 2 小时。随后，在室温下用 1X 洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。接着用吸水纸吸去载玻片上多余的液体，并将其放回载玻片架上。

在孵育步骤之间，切勿让脑组织切片干燥。在每个样本切片上加入三滴AMP 1FL，并在40摄氏度下孵育30分钟。随后，在室温下用1X洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次两分钟。

然后用吸水纸吸去载玻片上多余的液体，并将载玻片放回载玻片架上。随后，在每个样本切片上加入三滴 AMP 2FL。在 40 摄氏度下孵育样本 15 分钟。

接下来，将切片在室温下浸入1X洗涤缓冲液中，每次两分钟，重复两次。用吸水纸吸去切片上的多余液体，并将其放回载片架上。在每个样本切片上加入三滴AMP 3FL，于40摄氏度孵育30分钟。

接着，在室温下用1×洗涤缓冲液洗涤载玻片，每次2分钟，共洗涤两次。用吸水纸吸去载玻片上多余的液体，并将其放回载玻片架上。然后在每个样本切片上加入三滴AMP 4FL ALT A，于40摄氏度孵育15分钟。

将载玻片在1X洗涤缓冲液中室温洗涤两次，每次两分钟。去除载玻片上多余的液体，立即在每个切片上滴加两滴封片试剂。然后，将22毫米×22毫米的盖玻片覆盖在每张脑组织切片上。

然后将载玻片避光保存于 2 至 8 摄氏度，直至干燥。进行成像时，打开共聚焦显微镜并切换至 60X 物镜。获取 Z 轴层扫图像，并采集伏隔核区域中 Drd1alpha 标记细胞的图像。

对于显示离散点状染色模式的伏隔核图像，采用半定量分析方法评估其表达的动态范围。根据每个细胞内的点状数量，将每个细胞的评分定为0到9分。因此，这种杂交信号评分方法可以评估Drd1alpha在单个细胞间表达的程度和变异性。

以下是显示雄性和雌性大鼠中Drd1alpha表达的代表性共聚焦图像，其呈现离散点状染色模式。为考虑嵌套数据结构，针对每个类别计算平均计数值，并用于统计分析。采用Mann-Whitney U检验评估雄性和雌性大鼠中中位细胞计数的差异。

使用相对频率和累积频率分析每个类别中细胞的出现频率。与雄性动物相比，雌性动物在较低排序类别中的细胞频率显著升高，表现出分布上的明显偏移。总体而言，结果表明伏隔核中Drd1alpha的表达存在显著的性别差异。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在七小时内完成。在进行此操作时，务必牢记需快速操作，因为温度变化或组织干燥可能会损伤 mRNA，从而影响我们获得可靠信号的能力。观看本视频后，您应能充分理解如何在皮层组织中进行原位杂交技术，对选定脑区内的荧光信号 mRNA 转录本进行成像，并对 mRNA 转录本的分布进行表征，以用于统计分析。