Name: 用无标签荧光显微镜评价活体、人体阻力动脉中胶原蛋白和弹性蛋白的压力依赖性 Microarchitectures (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 了解无标签荧光显微镜技术用于活体人体阻力动脉成像，分析细胞外基质微结构与动脉壁力学的关系。该方法可量化弹性蛋白和胶原蛋白的空间组织，为血管生物学研究提供非侵入性手段。

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作者感谢南丹麦大学自然科学学院丹麦分子生物医学成像中心提供实验室和显微镜的使用。感谢Kristoffer Rosenstand和Ulla Melchior在压力肌动图和成像方面提供的出色技术协助。

采集本研究中使用的人体壁层心包活检样本均在获得书面知情同意后进行，方法如前所述33本研究中的人体组织研究遵循《赫尔辛基宣言》中规定的原则。34 并已获得南丹麦地区健康研究伦理委员会（S-20100044 和 S-20140202）以及丹麦数据保护局的批准。
1. 收集组织并分离（人类）阻力动脉
<ol>
	<li>在手术切除后立即收集感兴趣的组织样本。采集后立即将组织转移至 4 °C 的 HEPES 缓冲生理盐溶液（HBS）中，并在 HBS 中保存。 
	注意：人源组织仅可在获得相关机构和伦理委员会批准以及患者签署书面知情同意书后方可收集。HBS 成分（单位：mM）：NaCl 144，KCl 4.7，CaCl2 2.5，MgSO4 1.2，KH2PO4 1.2，HEPES 14.9，葡萄糖 5.5。用 NaOH 调节 pH 至 7.4，并通过 0.2 µm 滤膜过滤溶液。</li>
	<li>将收集的组织在 4 °C 的无菌 HBS 中静置过夜，以清除麻醉剂。 
	注意：各研究实验室应自行评估过夜储存对血管完整性和功能可能产生的影响。</li>
	<li>使用尖头镊子和显微解剖剪仔细分离出阻力型动脉（管腔直径约 ± 200 µm）。</li>
	<li>在准备成像/加压腔室的同时，将动脉置于冰上预冷的 HBS 中，并在 4 °C 下保存。</li>
</ol>
2. 在压力肌动图仪中安装分离的动脉
<ol>
	<li>将尖端直径约为 80 µm 的玻璃套管安装在套管固定架上，使尖端位于灌流室玻璃底部上方约 150 µm 处。 
	注意：使用尖端呈 45° 弯曲的套管可能有助于精确地将血管定位在玻璃底部上方。</li>
	<li>用含 1% BSA 的 HBS 填充进样和出样管路，并连接至压力系统。 
	注意：添加 BSA 的目的是维持内皮细胞功能。</li>
	<li>使用每根套管两个双结缝线将分离的动脉固定在套管上。 
	注意：缝线结可预先打好，并暂时保存在双面胶带上以备使用。</li>
	<li>向灌流室中加入 HBS，并在每根玻璃套管上放置两个双结。 
	注意：当使用具有肌源性张力的动脉时，应将 HBS 替换为无钙 HBS，并补充 3 µM EGTA 和 3 µM 硝普钠。</li>
	<li>用两对尖头镊子轻轻夹住动脉一端，打开动脉管腔，缓慢将其滑入套管，然后用两个结固定在套管上。</li>
	<li>施加 5 mmHg 的压力，以 HBS / 1% BSA 轻柔冲洗管腔。</li>
	<li>将动脉的另一端套入套管，并用两个双结将其固定在套管上。</li>
	<li>将肌张力测定仪转移至显微镜载物台上，将动脉加压至 5 mmHg（入口压力等于出口压力），然后加热至 37 °C，持续 30 分钟。</li>
	<li>可选步骤：根据制造商说明书校准轴向力传感器（1 g = 9.81 mN）。 
	注意：由于力传感器对温度敏感，加热后必须重新校准。</li>
</ol>
3. 实验操作：利用双光子显微镜成像动脉直径、管壁厚度以及胶原和弹性蛋白的微结构
<ol>
	<li>使用20倍物镜（数值孔径（NA）≥ 0.8）和低强度激发光，快速扫描压力维持在5 mmHg的插管动脉，以评估5 mmHg压力下的血管直径和管壁厚度。 
	注意：对于倒置显微镜，应使用水浸物镜；对于正置显微镜，应使用水浸式物镜。如果物镜不具备用于校正盖玻片厚度的校正环，请确保所用盖玻片与所选物镜相匹配。软件设置和描述可能因所使用的显微镜型号、用户界面及软件版本而有所不同。
	<ol>
		<li>设置光路。
		<ol>
			<li>启动Mai Tai双光子激光器，并将其设置为820 nm激发光。 
			警告：避免接触可见及不可见的激光光。</li>
			<li>同时在两个通道中收集发射光。使用460 nm长通二向色镜将发射光分配至两个光电倍增管，并分别采用中心波长为520 nm（弹性蛋白）和410 nm（胶原蛋白）、带宽为30–60 nm的带通滤光片收集发射信号。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>启用连续扫描，激光驻留时间为10 µs/像素，分辨率为512 × 512像素，视野为100%。</li>
		<li>手动扫描动脉，确定观察到最大直径的深度。</li>
		<li>选择一个覆盖动脉最大直径的矩形切片，并以像素尺寸≤300 nm/像素扫描单帧图像（图 2C）。使用尽可能低的激发光功率和像素驻留时间，以避免对活体动脉造成光损伤。 
		注意：建议获取一个矩形的 例如，100 × 1024 像素的图像，而非该位置的方形图像，以节省时间并限制组织的光子暴露（图2C).</li>
		<li>将图像保存以供后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定动脉最大直径处的管腔直径和管壁厚度。
	<ol>
		<li>在 Fiji 中加载图像。</li>
		<li>通过点击设置比例尺 主菜单 | 分析 | 设置比例尺 并输入 µm/像素 和像素比（强烈建议将像素比保持为 1:1）。</li>
		<li>选择 Fiji 线 工具，在动脉管腔两侧的两条内弹性膜之间各画一条线，然后单击 ctrl + MFiji 默认在结果表中报告长度。</li>
		<li>同样，绘制更多线条以测量每个壁的厚度，然后单击 ctrl + M 用于测量以下标记。</li>
		<li>保存测量结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在5 mmHg压力下对动脉壁全层进行扫描，成像胶原和弹性蛋白的微结构，沿动脉长度方向获取1至3个感兴趣区域的高质量三维图像序列。
	<ol>
		<li>使用60倍物镜（数值孔径≥1），优化像素尺寸和z轴间距，获取穿过动脉全层的图像序列。
		<ol>
			<li>根据光学路径、浸没介质和样品折射率，使用 Scientific Volume Imaging Nyquist 计算器（https://svi.nl/NyquistCalculator）计算最佳成像条件（像素尺寸和 z 轴步距）。 
			注意：请特别注意此处最佳像素大小和z间距与上述3.4节中关于使用建议之间的差异 最大值 像素大小</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用与上述相同的激发和发射设置（3.1.1.）。</li>
		<li>如上所述快速扫描血管壁，以确定z轴堆叠的厚度。</li>
		<li>定义z轴扫描的起始和终止深度、z步进间距以及像素密度（在3.3.1.1节中计算），并执行z轴扫描。每个通道分别保存。 
		注意：图像应足够小 例如 根据血管大小选择30 × 30 µm或50 × 50 µm区域，以避免曲率对后续图像分析的影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定方案中其余压力下的动脉直径、管壁厚度以及弹性蛋白和胶原蛋白的微结构。
	<ol>
		<li>在10 mmHg和20 mmHg压力下重复步骤3.1–3.2，在20 mmHg压力下重复步骤3.3。</li>
		<li>在40 mmHg压力下重复步骤3.1和3.2。</li>
		<li>在60、80和100 mmHg压力下重复步骤3.1–3.2，并在100 mmHg压力下重复步骤3.3。 
		注意：根据待检验的假设，步骤3.1–3.3可针对所有压力条件以及压力组合（例如一系列递增和递减压力的组合）重复进行。若发生光漂白，可添加浓度为0.3–1 µM的伊红以增强弹性蛋白的自发荧光。为避免光漂白，应尽可能使用最低功率的激发光。</li>
		<li>每次压力变化后，用新鲜的37 °C HBS替换肌动描记器腔室中的缓冲液。每次压力改变后，在成像前让动脉适应5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将通道图像堆栈分别保存，用于图像分析。</li>
	<li>检测动脉的活性。
	<ol>
		<li>在肌动图仪腔室中加入10 µM U46619，待观察到稳定的收缩后，再加入10 µM 缓激肽。</li>
		<li>按照第3.1节所述，在施加每种化合物后记录直径和壁厚。</li>
		<li>加入缓激肽后若动脉未完全舒张，则加入3 µM硝普钠，记录血管直径和管壁厚度。 
		注意：根据所研究动脉的药理学特性（血管床和物种），可使用其他血管收缩剂以及（内皮依赖性）血管舒张化合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：固定加压动脉，或继续进行胶原蛋白和弹性蛋白的成像以分析体积密度（步骤7）。
	<ol>
		<li>在37 °C条件下，加入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（1x PBS）固定1小时。</li>
		<li>用1×PBS将固定的动脉清洗三次，然后轻轻将动脉从套管上滑下，操作时仅触碰结扎线以外的动脉部分。不要移除结扎线，在将动脉转移至储存管时可利用结扎线抓持动脉。</li>
		<li>置于 1x PBS / 0.05 % 叠氮化钠溶液中，4 °C 保存，用于后续弹性蛋白和胶原蛋白体积密度成像或其他用途。 
		注意：固定的动脉可在 4 °C 条件下保存于 1x PBS / 0.05 % 叠氮化钠中，至少可保存 3 个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 应力应变关系及血管壁固有刚度的计算
<ol>
	<li>请按照 Bloksgaard, M. et al.13 及其中参考文献所述的公式和计算步骤，计算应力、应变和管壁刚度。</li>
</ol>
5. 图像分析 - （内弹性膜）IEL 分支角度
<ol>
	<li>在 Fiji 中打开图像堆栈。转到 文件 | 打开图像 以选择图像堆栈。 
	注意：使用 Fiji 中的角度工具测量 IEL 弹性纤维分支角度时，需采用覆盖 IEL 的 2–7 个连续 z 切片（厚度为 1–2 µm）的最大强度投影图像28,35。示例请参见 图 4A。</li>
	<li>转到 图像 | 堆栈 | z 投影…，选择图像并选择 &#34;最大强度投影&#34;。</li>
	<li>将最大强度投影保存为 TIFF 格式。</li>
	<li>使用 &#34;角度工具&#34;尽可能多地选择 IEL 纤维分支点，并系统性地处理所有图像。按 ctrl + M 测量每个角度。</li>
	<li>保存 Fiji 的结果表格。</li>
</ol>
6. 图像分析 - 外膜胶原波浪度
<ol>
	<li>在 Fiji 中打开图像栈。转到 文件 | 打开 图像以选择图像栈。 
	注意：使用 Fiji NeuronJ 插件测定胶原蛋白波状度时，采用覆盖外弹性膜（EEL，厚度为 1-4 µm）外侧胶原的 2-7 个连续 z 层的最大强度投影，具体方法如 Rezakhaniha, R. 等人37所述（图 4B）36。</li>
	<li>设置标尺。转到 分析 | 设置标尺 以输入像素尺寸。</li>
	<li>转到 图像 | 栈 | z 投影… 选择要处理的图像，并选择 &#34;最大强度投影&#34;。</li>
	<li>通过点击 图像 | 类型 | 8 位 将图像类型更改为 8 位 TIFF，并将最大强度投影保存为 TIFF 格式。</li>
	<li>使用 Fiji Neuron J 插件测量胶原纤维的直线度。
	<ol>
		<li>点击 Fiji | 插件 | Neuron J 打开 NeuronJ 插件。</li>
		<li>点击 加载图像 | 选择文件 在 NeuronJ 中打开 8 位 TIFF 图像。</li>
		<li>点击 添加轨迹，通过点击每根纤维的起点和终点来选择要分析的纤维。</li>
		<li>点击 测量轨迹，在对话框中选择 显示轨迹（Lf）和 顶点测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 Excel（或类似软件）中计算 L0/Lf 并保存结果。
	<ol>
		<li>将 Fiji Neuron J 的轨迹和顶点输出结果复制粘贴到 Excel（或类似软件）中，并根据顶点测量值使用勾股定理计算 L0。线段上的第一个和最后一个点表示二维坐标系中斜边两端的位置。 
		注意：L0/Lf [通过直线测量的胶原纤维束端到端长度（L0）/ 全长（Lf）] 接近 1 表明胶原纤维几乎呈直线。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 胶原蛋白和弹性蛋白体积密度的成像
<ol>
	<li>用 PBS 清洗（固定的）动脉 1 次，然后在避光条件下用含 1 µM 伊红的 1× PBS 溶液染色 15 分钟。对于固定后的动脉，此步骤在室温下进行。 
	注意：伊红可增强弹性蛋白的荧光信号。若样品在染色液中停留时间过长，伊红也会染色胶原蛋白和细胞质等其他结构。若其他结构染色过强，可将伊红浓度降至 0.3 µM，或重复清洗步骤。</li>
	<li>用 1× PBS 洗涤动脉 3 次
	<ol>
		<li>对于固定动脉：将动脉置于载玻片上用于成像。 
		注意：对未加压血管进行成像无法获取任何几何形态的定量信息。当需要绝对定量数据时，应始终在活体、加压状态下的动脉中获取。本方法可用于未加压动脉获取体积比数据。
		<ol>
			<li>在载玻片上贴两条双面胶带，间距为 1–1.5 cm。双面胶带厚度约为 100 µm。根据待固定的动脉直径，添加一层或多层胶带以匹配其尺寸。</li>
			<li>在载玻片中央的胶带围成的区域内加入 10–20 µL PBS，并将动脉置于液滴中。 
			注意：液滴应尽可能小且扁平，以避免加盖玻片时将动脉推离原位。</li>
			<li>盖上盖玻片，并压紧至双面胶带上。</li>
			<li>在盖玻片与载玻片之间的空隙中加入 1× PBS 以形成液体储层。每隔一小时补充一次液体，防止样品干燥。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用数值孔径（NA）&#62; 1 的 20 倍物镜，获取胶原蛋白和弹性蛋白体积密度的图像堆栈，尽可能覆盖更多的动脉壁区域，同时保持良好的光学分辨率（图 2D、2G 和 2H）。 
	注意：对盖玻片下的固定动脉成像时，使用水浸物镜；对活体动脉成像时，使用水浸式物镜。若物镜无校正环以校正盖玻片厚度，则需确保所用盖玻片与物镜匹配。建议使用最优的像素尺寸和 z 轴间距。可通过奈奎斯特计算器（步骤 3.3.1.1）计算这些参数。若无法计算，可采用最小像素尺寸 300 nm 和 z 轴间距 1 µm。建议沿动脉长度方向获取三组图像，以便评估实验内变异性。</li>
	<li>使用 820 nm 激发光对弹性蛋白成像，并采集中心波长为 520 nm、带宽为 30–60 nm 的发射光信号。</li>
	<li>使用 990 nm 激发光对胶原蛋白成像，以避免激发弹性蛋白及其他自发荧光蛋白，并采集中心波长为 495 nm、带宽为 10–30 nm 的发射光信号。</li>
	<li>将各通道的图像堆栈分别保存为 TIFF 文件</li>
</ol>
8. 使用 Ilastik 进行图像分析以提取弹性蛋白和胶原蛋白体积密度
<ol>
	<li>通过点击选择 文件 | 另存为… HDF5，使用 Fiji 将 TIFF 图像堆栈转换为 HDF5 格式28,35。</li>
	<li>在计算机硬盘上创建两个数据文件夹，分别用于存放弹性蛋白和胶原蛋白的图像堆栈。将相应的图像堆栈复制到对应的文件夹中。</li>
	<li>在 Ilastik 软件中创建两个新项目，分别用于弹性蛋白和胶原蛋白。
	<ol>
		<li>打开 Ilastik | 创建新项目 | 像素分类 | 新项目 | 添加数据，并选择在步骤 8.2 中创建的图像文件夹。 
		注意：请遵循 Ilastik 向导的指引。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导入一个三维图像堆栈以训练软件。
	<ol>
		<li>选择 输入数据小工具 | 主工作区区域 | 原始数据选项卡 | 添加新… | 添加独立图像(s)，并选择所需图像数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在软件中选择相关特征。
	<ol>
		<li>打开 特征选择小工具 | 选择特征，将弹出一个新对话框。详见 图 5A。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用训练小工具下的 添加标签 按钮至少添加两个标签。 
	注意：每个标签对应一种需要分离的对象类型。本研究中对弹性蛋白使用了三个标签：弹性蛋白本身、亮斑（需排除）和背景（需排除）。</li>
	<li>使用画笔样式的注释工具在原始图像堆栈上绘制标签。
	<ol>
		<li>选择适当的标签：点击 画笔 工具并开始绘制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击 启用实时更新，提示 Ilastik 分析图像堆栈并查找相似特征。</li>
	<li>仔细检查预测图（图 5D）。 
	注意：从原始图像到完整预测图的过程如 图 5 所示。Ilastik 使用预测图根据像素更可能归属的标签对图像堆栈进行分割（图 5D）。</li>
	<li>应用阈值。
	<ol>
		<li>选择 阈值分割小工具，选择适当的方法，输入标签、平滑、阈值和尺寸滤波参数，最后点击应用。 
		注意：此步骤将图像中具有相同标签的部分分割为离散对象。对于高度连接的组织（如弹性蛋白和胶原蛋白），无需进行分割，因此应用 0.4 的阈值（默认值为 0.5）。图 5E 和 5F 展示了应用阈值后的结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复训练 Ilastik，直到结果令人满意（在各自的分析中仅识别出弹性蛋白或胶原蛋白）。
	<ol>
		<li>在此过程中频繁切换训练、分割（有时也包括阈值分割）小工具。重新训练 Ilastik 效果的示例如 图 6 所示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>批量分析相似图像数据：选择 批量预测输入选择，并添加相关文件。 
	注意：Ilastik 的输出是一组伪 1 位三维图像堆栈（图像掩模），其中 0 表示无弹性蛋白（或胶原蛋白），1 表示存在（实际位深为 8 位）。</li>
	<li>通过视觉比较图像掩模与原始图像文件，逐一验证每个图像堆栈的结果。</li>
	<li>优化 Ilastik 掩模（步骤 8.4–8.9），并对结果不理想的图像堆栈重新分析。</li>
	<li>使用 MATLAB 根据 Ilastik 图像掩模计算弹性蛋白和胶原蛋白的体积密度
	<ol>
		<li>打开 MATLAB。</li>
		<li>在 MATLAB 的 &#34;当前文件夹&#34; 窗口中选择包含 Ilastik 图像掩模的文件夹。</li>
		<li>将 补充文件 1 中的 MATLAB 脚本复制到 MATLAB 编辑器中，并将代码保存为计算机硬盘上 MATLAB 文件夹中的 volumeCalculator.m。</li>
		<li>在脚本中输入像素大小和像素高度： 
		pixelSize = 0.1230000*0.1230000; %微米*微米 
		pixelHeight = 0.9; % 微米</li>
		<li>保存脚本。</li>
		<li>进入 MATLAB 命令窗口，输入 &#34;volumeCalculator('path-to-data')&#34; 以加载脚本。</li>
		<li>按回车键。每个图像掩模将被求和，并乘以（已知的）像素/体素体积（像素物理尺寸乘以 z 轴分辨率）。MATLAB 输出结果为每个图像堆栈中弹性蛋白和胶原蛋白的总体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存结果。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究提出了一种标准化的成像与压力肌动图联合分析方法，可用于在0至100 mmHg的压力范围内，同步评估阻力动脉的力学特性以及动脉壁结构随压力变化的情况。该方法最初采用自行搭建的设备开发完成，但任何可安装于双光子激发荧光显微镜上的压力肌动图系统均可适用，前提是两种设备的设计均允许对动脉壁进行成像。应特别注意物镜的形状、宽度和工作距离，以及成像操作的具体条件。直立显微镜需使用水浸式物镜，而倒置显微镜则推荐使用水浸没式物镜，以避免样品与物镜之间折射率差异所导致的成像问题。此外，应注意盖玻片的厚度，可通过使用带校正环的物镜对物镜与盖玻片之间的厚度失配进行校正（若具备该功能），或通过匹配所用物镜推荐的盖玻片厚度来实现。
在所述方案中，利用低能量近红外光成像弹性蛋白的自发荧光和胶原的二次谐波信号，从而实现长时间成像。在本研究使用的人类阻力动脉中，内弹力板由相互连接、呈纵向排列的纤维状弹性蛋白网络构成13,33，类似于人皮下阻力动脉（hSCA）的IEL结构<sup class=...

阻力动脉重构在原发性高血压、糖尿病和代谢综合征中的致病作用和影响已有文献记载1,2,3,4,5。阐明微血管壁力学特性与微细结构特性之间的关系，对于建立描述这种关联的数学模型至关重要。此类模型将有助于深入理解血管重构过程，并推动开发可用于评估靶向动脉壁疾病相关重构的药理学策略的计算机模拟模型。
既往研究主要关注通过结合力学测量与细胞外基质（ECM）的微结构信息，来理解动脉壁微结构与其力学特性之间的关系，但这些研究几乎 exclusively 针对小鼠或猪的大口径弹性传导动脉6,7,8,9,10,11。动脉壁微结构的成像通常采用非线性光学技术，利用弹性蛋白的自发荧光以及胶原产生的二次谐波信号。该方法可在无需染色的情况下实现对细胞外基质两大主要成分——弹性蛋白和胶原——进行时空成像。由于厚壁中膜对光的散射作用，在大口径传导动脉中实现动脉壁全层成像具有挑战性。然而，为了明确动脉壁结构成分的微结构特征如何影响其力学性能，必须在力学测试过程中获取三维信息。对于人主动脉等大动脉，这需要对面积为1-2 cm2的动脉壁组织样本进行双轴固定、力学测试，并对感兴趣区域进行成像7,9,10,12。目前仅能对部分管壁同时进行成像与力学测试。
对于任何物种的小动脉（例如, 人的心包13，肺部14 和皮下15 动脉，大鼠肠系膜动脉16,17,18,19,20小鼠提睾肌动脉、肠系膜动脉、脑动脉、股动脉和颈动脉21,22,23,24,25,26,27）可以实现对整个管壁厚度的成像，并可与力学测试相结合，从而同步记录管壁的力学特性及其内部结构排列。然而，据我们所知，目前仅在人类阻力动脉中最近报道了对细胞外基质三维结构改变与阻力动脉壁力学性质变化之间关系的直接数学建模研究。13,15.
在此工作中，一个 离体 描述了一种用于对离体人阻力动脉血管壁中弹性蛋白和胶原蛋白微结构进行被动力学测试及同步三维成像的方法。该成像方案可应用于任何感兴趣物种的阻力动脉。文中阐述了图像分析方法，用于测量内弹性膜分支角度和外膜胶原纤维的直线度。13 使用 Fiji28使用 Ilastik 软件测定胶原蛋白和弹性蛋白的体积密度29 最后，讨论了将力学和成像数据纳入动脉壁力学数学模型的情况。
结合数学建模，描述成像及图像分析技术的目标是为研究人员提供一种系统性方法，用于描述和理解阻力动脉细胞外基质（ECM）在压力作用下发生的可观测变化。该方法重点在于通过比较血管在20、40和100 mmHg压力下的ECM结构，定量分析加压过程中ECM的变化。选择这些压力值分别用于确定动脉壁在其更具顺应性（20 mmHg）、更僵硬（100 mmHg）以及中间状态（40 mmHg）时的结构特征。然而，根据研究者所关注的具体科学假设，活体动脉血管壁中的任何过程，包括由血管活性物质引起的变化、滞后现象（hysteresis）以及血流影响等，均可通过该方法进行定量分析。
重点强调了双光子激发荧光显微镜（TPEM）与压力肌动图系统结合，用于研究活体动脉细胞外基质（ECM）在压力（或其他因素）诱导下的变化。首先，该方法能够同时获取动脉壁整体的三维结构（包括直径和壁厚），并无需标记即可高质量、高分辨率地获取胶原蛋白和弹性蛋白微结构的三维图像13，其原理是利用弹性蛋白的自发荧光以及胶原蛋白的二次谐波生成信号（SHG）30。其次，TPEM采用低能量的近红外激发光，可最大限度减少对组织的光损伤，从而允许在血管壁的同一位置进行多次重复成像，实现对所观察变化的重复测量分析。
本文讨论了一种使用共聚焦成像对压力固定的动脉进行观察的替代方法，以便无法使用双光子显微镜（TPEM）的研究人员也能采用所描述的方法。有关细胞外基质（ECM）结构和体积密度的信息也可通过连续切片组织的二维分析获得，例如文献31,32所述。然而，由于该方法无法在动脉的整个长度尺度上，以及在不同生理条件下获取三维结构信息，因此不建议将其用于研究压力或治疗所诱导的细胞外基质三维结构变化。
研究人员应用本方法所需的最低要求是能够使用动脉插管和加压装置，并结合共聚焦或双光子激发荧光显微镜。以下方案中描述的装置为自行搭建的带纵向力传感器的压力肌动图系统，专为适配自行构建的倒置双光子激发荧光显微镜而设计。

<table><tbody><tr><td>精细科学工具</td><td>15401-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细科学工具</td><td>11251-23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼康</td><td>SMZ800N</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>761028</td><td>用于解剖</td><td></td></tr><tr><td>Vitrex Medical A/S，赫勒沃，丹麦</td><td>1.63, 2.13, 210mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>史密斯医疗国际公司，英国</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>爱惜康</td><td>Ethilon 11-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>定制设备</td><td></td><td>丹麦专利号 201200167，南丹麦大学，J. Schoubo V. Jensen，F. Jensen，T.R. Uhrenholt</td><td></td></tr><tr><td>梅特勒-托利多</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>B3259</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>A7030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>C5670</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>G7021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>E3889</td><td></td><td></td></tr><tr><td>默克密理博，海勒鲁普，丹麦</td><td>1.00496.9010</td><td>磷酸盐缓冲（pH 6.9）4% 甲醛溶液&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>H3784</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>P9666</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>P5655</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>M2643</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>S2002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>S5886</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>S5761</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>1.06462</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吉布科，赛默飞世尔科技</td><td>10010015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>PHR1423</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;西格玛-奥德里奇，Br&amp;oslash;ndby，丹麦</td><td>Z370525</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;托克里斯生物科学，布里斯托尔，英国</td><td>538944</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼康</td><td>定制设备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光谱物理，加利福尼亚州芒廷维尤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼康</td><td>CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼康</td><td>CFI Plan Fluor 20XMI（多介质浸没）NA 0.75</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滨松，巴勒鲁普，丹麦</td><td>H7422P-40</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF 分析技术股份公司（T&amp;uuml;bingen，德国）</td><td>ChromaET 460 nm 长通二向色镜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF 分析技术股份公司（T&amp;uuml;bingen，德国）</td><td>Semrock FF01-520/35-25 BrightLine 滤光片</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF 分析技术股份公司（T&amp;uuml;bingen，德国）</td><td>Chroma ET402/15X&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scotch™</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>盖玻片厚度应与显微镜所用物镜匹配（#1 或 #1.5），或调节校正环以匹配盖玻片</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过无标记荧光显微镜评估活体人阻力动脉中胶原蛋白和弹性蛋白的压力依赖性微结构

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

阻力动脉重构在原发性高血压、糖尿病及代谢综合征中的致病作用已有文献记载。开展针对微观结构的数学模型研究并发展此类模型，有助于理解健康与疾病状态下人类阻力动脉的力学特性，进而阐明疾病及医学治疗对人类微循环的影响机制。为了建立这些数学模型，关键在于解析微血管壁的力学特性与微观架构特性之间的关系。本文描述了一种 离体 一种用于被动力学测试及同步无标记三维成像的方法，可对离体人阻力动脉血管壁中弹性蛋白和胶原蛋白的微结构进行成像。该成像方案可应用于任何目标物种的阻力动脉。文中描述了图像分析方法，用于定量分析：i）利用Fiji软件测定压力诱导的内弹性膜分支角度变化及外膜胶原纤维的直线度；ii）利用Ilastik软件测定胶原和弹性蛋白的体积密度。建议尽可能在活体灌注动脉上同时进行力学测量与成像，但也讨论了一种替代方案，即采用标准视频显微压力肌动图结合血管再加压后固定样本的成像方法。该替代方法为用户提供了不同的分析选择。文中还探讨了将力学与成像数据整合至动脉壁力学数学模型中的应用，并提出了本方案未来的发展与改进方向。

本研究中用于成像的定制压力肌动描记仪如图1所示。在肌动描记仪的设计中特别关注了以下两点：i) 腔室体积较小（2 mL）；ii) 可将套管放置在靠近玻璃底部且与之平行的位置（图1B）。腔室底部可容纳一块50 × 24 mm #1.5玻璃盖玻片（可更换）。压力控制器由一个标准的1 L玻璃瓶和一个血压计（已移除袖带）构成。对于需要流动条件的肌动描记仪装置，建议使用伺服压力控制器。
图2 展示了在本实验方案中获取单张图像和图像序列的推荐位置。为便于说明，图中包含了一个安装好的动脉的透射光显微图像。 图2A. 固定后动脉的结扎点间长度约为1.6 mm。对动脉进行扫描，直至观察到最大直径处（<strong class="xfig...

我们描述了对离体活体人阻力动脉血管壁进行同步力学测试和三维成像的方法，并采用Fiji和Ilastik进行图像分析，以量化弹性蛋白和胶原蛋白的空间排列及体积密度。我们讨论了将这些数据应用于血管壁力学数学模型中的方法。

阻力血管重构在原发性高血压、糖尿病和代谢综合征中的致病作用已有文献记载。研究……

本方法的总体目标是提供一种标准化流程，用于获取活体人类阻力动脉的图像，以分析细胞外基质微细结构与动脉壁力学特性之间的关系。该方法有助于回答血管生物学与血管力学领域的一些关键问题，例如压力如何引起血管壁整体几何形态及其微细结构的变化。该技术的主要优势在于成像过程中无需对样本进行标记。尽管该方法可为阻力动脉的力学特性提供见解，但该方案的改进版本也可应用于其他管状器官，如支气管，或应用于人膀胱组织条或肠壁组织。首先，在手术切除后立即收集感兴趣的组织样本，并按照随附的文字方案所述方法制备血管。将插管的动脉加压至5 mmHg。然后通过启动双光子激光器并将激发波长设置为820纳米，建立成像的光路。插入一个460纳米长通二向色镜，将发射光在光电倍增管之间分光，并在两个通道中同时收集发射信号。使用中心波长为520纳米、带宽为30至60纳米的带通滤光片收集弹性蛋白的自发荧光，另使用中心波长为410纳米的带通滤光片收集胶原蛋白的二次谐波生成信号。现在将激光驻留时间及像素设为10微秒。将分辨率为512 × 512像素，对应100%视野。启用连续扫描，并尽可能使用最低的激发光功率和像素驻留时间，以避免对活体动脉造成光损伤。然后手动扫描动脉，找到直径最大的平面。接着，选择一个矩形切片，覆盖动脉最宽处的直径，并以每像素300纳米或更小的像素尺寸扫描单帧图像。将此图像保存，以供后续分析使用。为了测定动脉最大直径处的管腔直径和管壁厚度，首先在 Fiji 中加载图像。通过点击主菜单，然后依次选择分析（Analyze）和设置尺度（Set Scale）来设定比例尺。在此处输入微米/像素和像素比例。接下来，选择 Fiji 的线工具，在动脉管腔两侧的两条内弹性膜之间画一条线。然后按 Ctrl+M，将长度记录在结果表中。继续绘制更多线条以测量每层管壁的厚度，并保存最终测量结果。更换为数值孔径为1或更高的60倍物镜。在5毫米汞柱压力下，扫描动脉壁的完整厚度，以成像胶原蛋白和弹性蛋白的微结构。接下来，定义Z轴堆栈的起始与终止深度、Z轴步进间距以及像素密度。设计Z轴层扫时，确保目标区域足够小，以避免在后续分析中引入曲率干扰。完成后，设置各通道分别保存。最后，选取一至三个不同的目标区域，获取高质量的三维图像层扫数据。如果您的弹性蛋白自发荧光正在发生漂白，则说明激发光功率过高，应避免这种情况。为了完成正在进行的实验，可添加低浓度的伊红以增强弹性蛋白的自发荧光。完成之后，在压力最高达100毫米汞柱的范围内重复整个过程，每次压力变化后均需用新鲜的37摄氏度HBS缓冲液替换肌动描记器腔室中的缓冲液。开始图像分析时，在Fiji中打开弹性蛋白图像堆栈，然后转到图像，点击堆栈，选择Z投影以选定要处理的图像，并选择最大强度投影作为投影类型。将最大强度投影保存为 TIFF 图像。然后尽可能多地选择内弹性膜纤维分支点，并使用角度工具进行测量。系统地处理每张图像，完成后保存 Fiji 结果表格。为了测量外膜胶原的波浪状结构，首先在 Fiji 中打开胶原图像堆栈。接着，点击图像菜单下的堆栈选项，选择 Z 投影以选定需要处理的图像并设置最大强度投影。随后，通过点击图像、类型，然后选择 8 位，将图像类型更改为 8 位 TIFF 图像。将最大强度投影保存为 TIFF 图像。单击 Fiji，然后在插件中选择 Neuron J，以打开 Neuron J 插件。随后在 Neuron J 中打开8位 TIFF 文件。文件打开后，单击“添加轨迹”，通过单击每根纤维的起点和终点来选择要分析的纤维。接下来，进入测量轨迹，选择对话框中的显示轨迹和顶点测量。为计算胶原纤维的直线度，首先将 Fiji 轨迹窗口中的数值复制到 Excel 中。轨迹窗口中的长度值表示所分析胶原纤维的全长 Lf。其次，将所分析的每条胶原纤维束在 Fiji 顶点窗口中的第一个和最后一个 XY 坐标复制到 Excel 中。然后使用勾股定理计算所分析胶原纤维两端之间连接的直线长度 L0。最终通过 L0/Lf 计算胶原纤维的直度。按照上述所示方案，确定动脉最宽的部分，并在该位置利用无标记荧光显微镜扫描动脉，以测量最大血管直径和血管壁厚度。使用更高放大倍数和高数值孔径的物镜，不仅可以测量血管直径和管壁厚度，还能分析胶原蛋白和弹性蛋白的微细结构。利用适当图像分析软件，可在连续的图像切片中确定弹性纤维分支角度和胶原蛋白直线度等微细结构特征。这使得能够直接分析不同压力下胶原蛋白和弹性蛋白微细结构变化与增量弹性模量之间关系。通过该方法，还可以从图像中提取其他信息，例如血管外膜胶原沿血管纵轴的取向角度，或中膜细胞外基质的微结构。利用此方法从图像中提取的定量数据可输入数学模型，以阐明健康与病变的人体循环系统在不同条件下的响应机制。观看本视频后，您应能够全面了解如何设计成像实验及后续的图像分析，以获取有关压力如何诱导阻力动脉壁微结构变化的信息。请务必注意，在使用双光子激发荧光显微镜时，必须避免样品暴露于可见光和不可见光下。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用无标签荧光显微镜评价活体、人体阻力动脉中胶原蛋白和弹性蛋白的压力依赖性 Microarchitectures

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非接触式、无标记的细胞与细胞外基质拉曼光谱监测

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体外管腔内凝胶灌注：一种用于人阻力动脉显微分析的先进技术方法

了解无标签荧光显微镜技术用于活体人体阻力动脉成像，分析细胞外基质微结构与动脉壁力学的关系。该方法可量化弹性蛋白和胶原蛋白的空间组织，为血管生物学研究提供非侵入性手段。

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