泡沫病毒 Intasomes 原型的组装与纯化
March 19th, 2018
重组逆转录病毒整合酶和 dna 寡聚物模仿病毒 dna 末端可以形成一个酶活跃的复杂称为 intasome。Intasomes 可用于生物化学、结构和动力学研究。本协议详细介绍了如何组装和纯化原型泡沫病毒 intasomes。
该程序的总体目标是组装和纯化原型泡沫状病毒内化体，然后将其用于生化、结构和动力学研究。这种方法可以帮助回答逆转录病毒学领域的关键问题，例如整合的机制和动力学。该技术的主要优点是它允许分离整合复合物，而不是物种的异质混合物。
该方法的视觉演示是有益的，因为整合复合物的回收和溶解对于确保最佳 intasome 产量至关重要。首先，将 1XTEN 缓冲液、10 微摩尔 oligo-1 和 10 微摩尔 oligo-2 混合，最终体积为 1.5 mL。然后，将 25 μL 混合物分装到 60 个 0.2 mL 聚合酶更换反应管中。
使用热循环仪对 DNA 进行退火，时间和温度在文本方案中列出。反应结束后，合并来自所有 60 个试管的退火反应。然后加载 500 微升两个 0.5 毫升 3 道尔顿截留分子量超离心过滤器浓缩装置。
在微量离心机中以 14， 000 倍 g 的速度在室温下离心 10 分钟，浓缩退火的病毒 DNA。丢弃流出液后，向每个过滤单元中加入 250 μL 剩余的退火病毒 DNA。重复旋转直到剩余约 50 微升，并丢弃流出物。
然后，通过用 450 μL TE 洗涤 3 次，将样品交换到 TE 缓冲液中。更换缓冲液后，倒置过滤器单元，并在室温下以 1000 x g 离心 2 分钟。每个过滤单元的最终截留体积应约为 50 μL。混合吸附物并转移至 1.5 mL 螺口盖管中。
最后，测量病毒 DNA 的 260 纳米紫外吸收度以计算 DNA 浓度。为了组装内化体，将 50 毫摩尔双三丙烷 pH 7.5、500 毫摩尔氯化钠、120 微摩尔 PFV 整合酶和 50 微摩尔病毒 DNA 混合在 150 微升的总体积中。用双蒸水或可用的最高纯度水清洁一根 10 厘米长、直径为 10 毫米、6 至 8 千道尔顿的截止分子量透析管和相关卡箍。
夹住管路的一端，用 1 到 2 毫米的冲洗缓冲液冲洗透析管内部 3 次。用移液管和薄凝胶加载尖端去除尽可能多的冲洗缓冲液。然后，用移液管和薄凝胶加载头将 intasome 组件转移到透析管上。
确保组件直接排入透析管底部。夹住透析管的开口端，尽量减少进入透析管内的空气量。然后将管路放入透析缓冲液中。
轻轻搅拌透析过夜，使管路旋转但不处于涡旋中。确保透析管浸没并移动。大约 1 小时后，沉淀物应在管道内可见。
准备两个大口径移液器吸头，方法是在干净的表面上用新的剃须刀或手术刀刀片从 200 μL 吸头的末端取出 2 到 4 mL。从透析缓冲液中取出透析管。为防止用可能残留在管末端靠近夹子的透析缓冲液稀释 intasome 样品，请使用带有小移液器吸头的微量移液器去除任何多余的透析缓冲液。
从透析管的这一端取下夹子。回收组件时，收集尽可能多的溶液并沉淀是很重要的。使用宽口径 propette 尖端将透析管内的样品（包括沉淀物）转移到冰上的 1.5 mL 试管中。
记下回收材料的总体积。总体积通常约为 140 μL。含沉淀物的样品为 200 毫摩尔氯化钠。
通过加入适当体积的 5 摩尔氯化钠原液，将盐增加到 320 毫摩尔氯化钠的最终浓度。将装有样品的冰桶转移到 4 摄氏度的冷藏室中。使用宽口径移液器吸头通过移液重新悬浮和溶解沉淀物。
每 20 分钟重复一次，持续至少 1 小时。大部分沉淀物应进入溶液。为了纯化 intasome，用 SEC 电泳缓冲液以 0.4 mL/min 的流速平衡交联琼脂糖体积排阻层析柱或 SEC 柱。
将intasome 样品放入微量离心机中，在 4 °C 下以 14， 000 倍 g 离心 10 分钟，以沉淀任何剩余的沉淀物。小心取出上清液后，将其加载到 200 μL 进样定量环上。将样品上样到 SEC 色谱柱上。
用 25 mL SEC 电泳缓冲液洗脱，并收集 95 个 270 μL 馏分。观察到 SEC 色谱图显示三个 A280 和 A260 峰。将 2 微升每个 intasome 峰分数混合在 50 ng 三千碱基超螺旋血浆 DNA 中，溶于反应缓冲液中，最终反应体积为 15 μL。
还包括一个没有添加 PFV intasome 的阴性对照。在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。用 0.75 μL 蛋白酶 K 和 0.75 μL SDS 终止反应。
然后将样品在 55 摄氏度下孵育 1 小时。接下来，向每个整合反应中加入 3 微升 50% 甘油。将整个反应体积上样至每体积重量为 1% 的琼脂糖凝胶。
此外，将 1 μL 10 kb DNA 大小的标记物加载到样品两侧的泳道中。在外泳道中，加载 6 微升橙色 G 染料。在恒压（每厘米 10 伏特）下，在环境温度下电泳 1 小时，或直到橙色 G 染料前沿到达凝胶末端。
立即使用用于检测溴化乙锭的荧光扫描仪对琼脂糖凝胶进行成像。此图像应将协同积分显示为一个在 3 kb 处运行真实大小的带。使用成像软件定量每个泳道中的条带后，选择具有最一致积分活性的馏分。
将每个馏分分成 5 微升等分试样。最后，将等分试样在液氮中快速冷冻，然后在零下 80 摄氏度下储存。显示了 PFV intasome 组装纯化的代表性色谱图。
可以看到三个峰值。中心峰与正确组装的 intasomes 相关。积分效率显示为中心色谱峰的分数。
测试了 Intasome 在没有和有冻融和解冻的活性。冻融显示整合反应产物的溴化乙锭染色 agraose 凝胶无差异。这里显示了超螺旋质体、协同整合产物、半视整合产物和未反应的病毒 DNA。
从溴化乙锭图像中定量分析的积分效率也证实，冻融后没有积分活性的损失。这允许长期存储。标记分子和位置影响 PFV 内嵌体组装的效率。
未标记的 intasomes 和内部 Cy5 标记显示出相同的组装效率。然而，末端标记 Cy5 或生物素会降低组装效率。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两天内完成。
按照此程序，可以执行其他方法，如生化和单分子分析，以回答有关整合、动力学和动力学的其他问题。观看此视频后，您应该对如何组装、纯化和功能评估 PFV 内小体有很好的了解。
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概述
本协议概述了原型泡沫病毒整合体的组装和纯化，这是由重组逆转录病毒整合酶和DNA寡聚体形成的具有酶活性的复合物。这些整合体可用于逆转录病毒学的生物化学、结构和动力学研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 逆转录病毒学
- 生物化学
- 结构生物学
背景
- 整合体对于理解逆转录病毒的整合机制至关重要。
- 此方法允许分离整合复合物，提高研究精确度。
- 视觉演示对于最佳恢复和复合物的溶解至关重要。
- 逆转录病毒学的关键问题可以使用这种技术来解决。
研究目的
- 组装和纯化原型泡沫病毒整合体。
- 促进生物化学、结构和动力学研究。
- 提高对逆转录病毒整合动力学的理解。
使用的方法
- 将1XTEN缓冲液与特定的DNA寡聚体结合。
- 将混合物分装到聚合酶变化反应管中。
- 在组装过程中利用整合酶的酶活性。
- 纯化生成的整合体以供进一步分析。
主要结果
- 成功组装了整合体。
- 纯化方法产生了高质量的整合复合物。
- 展示了进行详细动力学研究的潜力。
- 提供了对逆转录病毒整合动力学的洞察。
结论
- 该协议使有效研究逆转录病毒整合成为可能。
- 整合体可用于各种生物化学分析。
- 此方法增强了对逆转录病毒机制的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Assembly and purification of prototype foamy virus (PFV) intasomes enables precise interrogation of retroviral integration mechanisms, a critical inflection point in antiviral target validation. Isolated intasomes provide a standardized, reproducible platform for biochemical, structural, and kinetic studies, supporting predictive confidence in early discovery and mechanistic de-risking. This capability underpins portfolio decisions by clarifying integration dynamics and informing downstream assay development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct study of retroviral integration mechanics for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by isolating functional integration complexes.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of integrase activity and DNA interactions.
- Provides a platform for comparative analysis of integration efficiency under varied conditions.
Screening & Assay Development
- Delivers purified, homogeneous intasome complexes for assay standardization.
- Enables reproducible quantitative measurement of integration activity.
- Supports development of robust biochemical and kinetic assays for compound evaluation.
- Improves screening reliability by minimizing background from heterogeneous mixtures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro integration models with in vivo retroviral processes for translational relevance.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of integration inhibitors.
- Supports risk-adjusted advancement by providing quantitative integration efficiency data.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions PFV intasome assembly and purification at the interface of early discovery and assay development, enabling seamless transition to preclinical research when evaluating integration-targeted interventions.
- Discovery Biology: Provides a controlled system for hypothesis testing and pathway clarification in retroviral integration.
- Screening: Supplies standardized, reproducible integration complexes for downstream biochemical assays.
- Analytics: Enables quantitative measurement of integration efficiency and activity across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic studies with disease-relevant integration models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for integration studies across retroviral systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in integration studies.
- Operational Value: Standardizes intasome preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying integration mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of integration-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein-DNA complex assembly and purification.
- Demands access to ultracentrifugation, dialysis, and size exclusion chromatography infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of integration efficiency assays and quantitation methods.
- Adaptation may be needed for different retroviral integrases or DNA substrates.
- Labeling strategies can impact assembly efficiency and must be empirically validated.
