Name: 流式细胞术对小鼠原发性胰腺导管腺癌原位同种异体 (自体) 免疫分型的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 了解如何使用流式细胞术对小鼠原位胰腺导管腺癌同种异体移植物进行免疫分型分析。该方法利用多免疫标记荧光激活细胞分选技术，成功分析肿瘤免疫微环境并识别关键免疫细胞亚群，为研究肿瘤免疫治疗策略提供可靠实验方案。

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作者谨此感谢 Jody Barbeau 博士对本文手稿的审阅与编辑，感谢 Ralph Manuel 为本文设计插图。作者同时感谢 Crown Bioscience 肿瘤学与肿瘤免疫学生物标志物团队以及肿瘤学 体内 团队所付出的大量技术支持。

所有涉及动物护理与使用的方案、修订或操作程序，均须在研究开始前提交至冠科生物机构动物护理与使用委员会（IACUC）进行审查和批准。动物的护理与使用通常将依照美国实验动物评估与认可协会（AAALAC）国际指南进行，该指南载于《实验动物护理与使用指南》（美国国家研究委员会，2011年）。所有动物实验操作均须在SPF（无特定病原体）设施的无菌条件下进行，并严格遵循来自不同政府机构（e.g. 美国国立卫生研究院）发布的《实验动物护理与使用指南》。相关方案必须获得实验设施所属机构动物实验伦理委员会（e.g. 机构IACUC委员会）的批准。
1. 肿瘤移植的准备工作
<ol>
	<li>动物饲养
	<ol>
		<li>从商业繁殖供应商处获取普通的 C57BL/6 小鼠。</li>
		<li>将小鼠（5只）饲养在独立通风笼具中，饲养条件如下：温度：20–26 °C；湿度：30–70%；光照周期：12 小时光照和 12 小时黑暗。</li>
		<li>使用玉米芯垫料，并每周更换一次。</li>
		<li>饮食方面，在整个研究期间提供经辐照灭菌的干颗粒饲料。</li>
		<li>饮水方面，为动物提供自由饮用的无菌饮用水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>供体肿瘤组织片段制备
	<ol>
		<li>首先通过电子天平称重监测荷瘤供体小鼠的体重（BW）和使用游标卡尺测量肿瘤体积（TV）。</li>
		<li>当肿瘤体积达到 500–1,200 mm3 时，按照实验方案在生物安全柜中实施安乐死。</li>
		<li>使用碘伏棉签对肿瘤周围皮肤进行消毒。</li>
		<li>手术切除肿瘤（具体步骤见第3节：剖检与肿瘤收获），并将肿瘤置于含有 20 mL PBS 的培养皿中（在对动物实施安乐死前，需将培养基或缓冲液预冷至 4 °C）。</li>
		<li>若存在污染血液，将肿瘤转移至另一培养皿中，并用 PBS 清洗肿瘤。</li>
		<li>将肿瘤切成两半，去除多余的皮肤、血管、钙化组织和/或坏死组织。</li>
		<li>仅选取完整的肿瘤组织块，放入无菌的 50 mL 离心管中，加入 20 mL PBS，随后将离心管转移至另一个动物房用于药理学研究。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 原位与皮下（SC）移植
<ol>
	<li>皮下接种
	<ol>
		<li>使用手术刀将肿瘤切成直径为2 mm的组织块，每块套管针中放入1块，用于皮下移植或后续原位移植（见下文）。</li>
		<li>使用5%异氟烷对受体动物进行麻醉，并通过鼻罩以1%浓度维持。动物将开始放松，失去翻正反射，最终变得不动。在此麻醉深度下，动物仍可轻易被疼痛刺激唤醒；需继续加深麻醉，直至对疼痛刺激的反应消失。</li>
		<li>麻醉后，将小鼠以右侧卧位固定于实验板上。使用碘伏棉签对小鼠进行消毒，尤其注意肿瘤周围区域。</li>
		<li>用手术刀在左侧腰部髋部前方稍偏头侧处做一道0.5至1.0厘米的皮肤切口。</li>
		<li>用钝头镊子在皮下向 forelimb 方向分离出一条长约两到三厘米的隧道。</li>
		<li>无菌地将一块肿瘤组织从培养基中取出，并置于皮下隧道深处。</li>
		<li>目视确认肿瘤位于隧道深部（而非皮肤切口处）。</li>
		<li>使用伤口夹闭合伤口。</li>
		<li>监测&#160;动物接种后应持续监测，直至其恢复足够的意识以维持胸卧姿势。只有在动物完全从麻醉中恢复后，方可将其放回笼中。填写麻醉记录表，并开始填写动物健康记录表。对受体动物进行连续三天的每日称重。</li>
		<li>标准操作中，每组接种5-10只小鼠用于肿瘤生长监测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胰腺原位移植
	<ol>
		<li>麻醉与镇痛
		<ol>
			<li>使用2 mL氯胺酮注射液与0.42 mL赛拉嗪注射液（20 mg/mL），溶于5.91 mL无菌注射用水或生理盐水中，按每20–25 g体重0.06–0.1 mL的剂量给药。 
			注意：根据动物福利要求，术前和术后均需进行镇痛处理&#160;术后：0.05–0.1 mg/kg 布托啡诺，皮下注射。首次给药在术前&#160;手术后每4小时给药1次，持续给药3次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>原位移植手术操作
		<ol>
			<li>通过肌肉注射（IM）使小鼠麻醉，具体步骤见2.2.1。</li>
			<li>动物完全麻醉后，将小鼠仰卧位固定于实验板上。</li>
			<li>将小鼠保持在右侧卧位。用碘酒消毒脾脏周围的皮肤，然后用75%乙醇脱碘。</li>
			<li>找到脾脏的中点，在腹部做一条1厘米的垂直切口以暴露脾脏。</li>
			<li>用平头镊子轻轻拉出脾脏下方的一部分胰腺组织，使用9-0可吸收手术缝线将来自供体小鼠的同系移植瘤组织块缝合至受体小鼠的胰腺上。</li>
			<li>用6-0丝线行双层缝合关闭腹腔。通过压迫实现止血。</li>
			<li>肿瘤植入完成后，若无出血或肿瘤组织渗漏，将动物置于保温笼中饲养。</li>
			<li>监测动物直至其恢复足够的意识以维持胸卧位；待动物完全从麻醉中恢复后，将其送回动物房。通过触诊脾脏附近的腹部来监测荷瘤小鼠，并筛选出携带原位肿瘤的小鼠。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荷瘤小鼠健康监测
	<ol>
		<li>每日检查饮水和食物消耗情况。</li>
		<li>检查小鼠外观是否存在毛发蓬乱、肿块、消瘦、呼吸异常或腹水。</li>
		<li>触诊腹部，检查肝脏或脾脏是否有自发性肿瘤。</li>
		<li>每周使用天平称量小鼠体重。</li>
		<li>若观察到以下任一临床症状，需对小鼠实施安乐死以采集样本并进行剖检：体重下降 &#62;20%；活动能力受损（无法进食或饮水）；由于明显腹水和腹部肿大而无法正常移动；呼吸费力。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 尸检与肿瘤组织采集
<ol>
	<li>在处死前，通过肉眼观察和触诊检查是否存在可触及的肿瘤。</li>
	<li>处死时，首先按照批准的方案对小鼠实施安乐死，打开腹腔，肉眼检查胰腺是否有肿瘤。</li>
	<li>通过死后手术切除肿瘤，并将其放入冷PBS中。将所有动物放入一个洁净、不带电、透明的安乐死舱内，舱盖上设有专门用于输送二氧化碳的接口。</li>
	<li>以能够快速使动物失去意识且尽量减少痛苦的气体流速将气体通入舱内。CO2 的最佳流速应约为2–2.5 L/min。</li>
	<li>在安乐死过程中目视观察每只动物，确保所有动物均接受足够的气体浓度，并在安乐死过程中不会恢复意识。</li>
	<li>在动物出现明显临床死亡后，继续维持气体流动至少1分钟，以最大限度降低动物可能复苏的风险（例如虽已无呼吸但尚未死亡）。</li>
	<li>切除邻近的非肿瘤组织。清理后的肿瘤可迅速拍照。 
	将肿瘤组织放入RPMI-1640培养基中，并置于冰上保存，待后续解离。 
	注：动物尸体应装袋并储存在指定冰箱中，等待统一处理。</li>
</ol>
4. 肿瘤组织解离与单细胞制备
<ol>
	<li>试剂准备 
	注意：肿瘤解离试剂盒包含 2 瓶酶 D（冻干粉）、1 瓶酶 R（冻干粉）、1 瓶酶 A（冻干粉）和 1 mL 缓冲液 A。
	<ol>
		<li>通过将每小瓶冻干粉溶解于3 mL RPMI-1640培养基中，制备酶D。分装成适当体积的 aliquot，以避免反复冻融循环。</li>
		<li>用 2.7 mL RPMI 1640 培养基重悬冻干粉，配制酶 R。分装成适当体积的 aliquot，以避免反复冻融。</li>
		<li>用试剂盒中提供的1 mL缓冲液A溶解冻干粉，配制酶A。切勿涡旋。分装成适当体积，以避免反复冻融循环。</li>
		<li>在每个gentleMACS C管中加入2.35 mL RPMI-1640、100 µL Enzyme D、50 µL Enzyme R和12.5 µL Enzyme A，配制酶混合液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肿瘤解离
	<ol>
		<li>为每个肿瘤准备一个含有肿瘤消化液的C管，请参见第4.1节了解消化缓冲液的稀释与配制方法。</li>
		<li>使用 3 mL 消化缓冲液处理肿瘤组织碎片 &#60;0.8 g，并确保肿瘤完全消化。</li>
		<li>使用研究编号、肿瘤类型、小鼠编号、处理组和肿瘤重量进行标记。</li>
		<li>从 小鼠体内收集肿瘤，用冷 PBS 清洗肿瘤，并清除附着在肿瘤上的其他组织（如血管、脂肪、筋膜， 等等.).</li>
		<li>将肿瘤组织放入无菌6孔板的一个孔中的消化液中。</li>
		<li>用无菌镊子/止血钳固定肿瘤，用手术刀进行切割。将肿瘤充分切碎成小块（约1 mm）。3).</li>
		<li>将肿瘤组织块放回C管中，用剩余的消化缓冲液冲洗培养板，然后将液体转移至置于冰上的C管中，直至消化完成。</li>
		<li>打开带有加热器的解离仪。</li>
		<li>将肿瘤解离C管倒置放入空位的套管中，并将管位状态从“Free”调整为“Selected”。选择解离程序（37_c_m_TDK_1），然后选择所需文件夹，程序列表将在此显示。</li>
		<li>程序结束后，从解离仪上取下C管，短暂离心（300 x g） g，4 °C）离心使样品沉淀。</li>
		<li>重悬样本，置于50 mL离心管上方的细胞筛中。用10 mL洗涤缓冲液冲洗细胞，使其通过细胞筛，获得单细胞悬液。</li>
		<li>将离心管在 300 x g 5分钟，弃去上清液，用5 mL洗涤缓冲液重悬细胞，使用台盼蓝和/或细胞计数仪计数活细胞，并将细胞浓度调整至1 × 106 每管或每份样品的细胞数。应包含正确类型的同型对照抗体，以确保染色的特异性</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 免疫组设计与流式数据采集
<ol>
	<li>面板设计
	<ol>
		<li>请参见 表1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫染色
	<ol>
		<li>Fc阻断样本细胞：将细胞重悬于含有1 µg/mL Fc阻断剂的200 µL染色缓冲液中，置于冰上或4 °C避光孵育15分钟。</li>
		<li>使用所需的抗体/荧光染料组合对细胞进行染色（例如T细胞检测 panel，巨噬细胞检测 panel 等等：将用Fc阻断缓冲液稀释的抗体混合物加入各样品中，置于冰上避光孵育至少30分钟。</li>
		<li>向每管中加入 1 mL 冰冷的 PBS，轻轻重悬细胞，随后在 300 x g 5 分钟。弃去上清液。
		<ol>
			<li>重复洗涤细胞两次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>如需染色细胞内标志物，请按照步骤6-10操作，否则直接跳至步骤10。</li>
		<li>通过脉冲涡旋重悬细胞沉淀，每份样品加入200 µL预先配制的固定/破膜工作液。再次脉冲涡旋，然后于4 °C避光孵育过夜（推荐）或室温避光孵育30分钟。</li>
		<li>离心细胞并弃去上清液。</li>
		<li>用1 mL 1×透化缓冲液（由10×透化缓冲液用蒸馏水稀释制备）洗涤两次2O），随后离心并弃去上清液。</li>
		<li>在1×破膜缓冲液中加入细胞内标志物抗体，室温避光孵育30分钟。</li>
		<li>用1 mL 1×透化缓冲液洗涤细胞两次，离心后弃去上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于150 µL染色缓冲液中，并在流式细胞仪上进行分析。由于经过固定和透化处理，细胞群体的FSC（前向散射光）/SSC（侧向散射光）分布将与活细胞不同，因此需要调整设门策略和电压参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FMO对照（荧光减一对照） 
	注意：多色流式分析对于肿瘤浸润免疫细胞的分析尤为重要。因此，需要找到一种方法，以应对由于特定抗体组合中存在多种荧光染料而导致的数据弥散问题，从而准确识别和设门目标细胞。FMO（减去一色荧光）对照是实现这一目的的重要方法。
	<ol>
		<li>为此，每组需额外增加小鼠用于FMO对照（每种处理至少2只），并进行相应处理&#160;每种组织单独处理。消化解离后，将组织混合。例如，在包含4个Rx组的研究中，应将另外8个肿瘤分别处理，然后混合为一个样本用于FMO对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式仪器设置
	<ol>
		<li>仪器预热期间（至少20分钟）制备补偿微珠。</li>
		<li>使用 CS&amp;#38;T 珠子以检测性能。</li>
		<li>电压和补偿设置：使用 UltraComp 微球，使用前充分涡旋混匀补偿微球。</li>
		<li>标记一个独立的 12 x 75 mm2 每种荧光染料标记的抗体分别使用一个样品管。</li>
		<li>向每管中加入 100 µL 染色缓冲液。向每管中加入 1 滴完整的珠子溶液（约 60 µL）。</li>
		<li>加入抗体，并严格按照第4节中所述的样本处理步骤进行染色操作。</li>
		<li>每管中加入 0.5 mL 染色缓冲液，通过涡旋充分重悬 bead 沉淀。</li>
		<li>根据给定实验的目标组织设定流式细胞仪的光电倍增管电压。</li>
		<li>通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）信号圈选单一群微球群体，使用流式细胞仪进行数据采集。</li>
		<li>将流速设定在每秒200–300个事件左右。</li>
		<li>为给定的荧光素[FITC]偶联抗体设置适当的补偿，使用FL1 与 FL2 点图</li>
		<li>将四象限门设置为使阴性微球位于左下象限，阳性微球位于右上或右下象限。调节补偿值，直至各群体的中位荧光强度（MFI）（如象限统计窗口所示）大致相等即 对于FL2-%FL1，两种微球的FL2 MFI应相似。</li>
		<li>对所有试管重复步骤 5.4.11 和 5.4.12。</li>
		<li>继续获取实际染色样本。运行补偿向导，并以指定格式保存设置 &#34;实验日期 你的姓名缩写&#34;.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 流式数据分析与展示
<ol>
	<li>使用 Flowjo 和/或 Kaluza 软件分析数据。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均为 Crown Bioscience, Inc. 的现任全职员工。

尽管使用皮下肿瘤的研究更容易开展，但原位移植肿瘤模型在临床前药理学研究（特别是免疫肿瘤学研究）中可能更具相关性，能够提供更强的可转化性。本报告旨在帮助感兴趣的读者直接观察可在各自研究中使用的技术操作流程。我们的实验方案表明，胰腺导管腺癌（PDAC）的原位移植可实现高效的肿瘤生长，效果与皮下移植相似。我们的观察结果还提示，不同移植方式所产生的肿瘤微环境（TME）具有不同的免疫特征。与皮下移植相比，原位移植的主要挑战在于需要复杂的技术操作，过程耗时较长，移植手术本身劳动强度大，且在活体中监测原位肿瘤生长存在困难。
确保正位胰腺肿瘤实验成功进行的关键步骤有四个：1）移植手术操作；2）对肿瘤发育的仔细且及时的监测；3）在正式实验前先开展预实验，以熟悉操作流程，并评估成瘤率和肿瘤生长速度；4）采用解离肿瘤获得的单细胞悬液作为替代性的移植方法。本报告所述方案有助于读者开展此类同系移植研究，以及其他胰腺正位模型，甚至涉及开腹手术的其他正位模型的研究。
流式细胞术或荧光激活细胞分选（FACS）目前是进行免疫谱型分析最重要的工具。FACS 对肿...

胰腺导管腺癌（PDAC）每年在全球造成近五十万人死亡，是位居前五位的癌症致死原因之一。目前有效的治疗手段极为有限，且尚无获批的免疫疗法，因此迫切需要开发新的治疗方法。除了已知的遗传性疾病属性外，癌症正越来越多地被认识到也是一种免疫学疾病，包括胰腺导管腺癌（PDAC）在内。免疫学和遗传学因素可能共同决定疾病的预后以及治疗效果。肿瘤能够逃逸宿主的免疫监视，并最终进展导致死亡。许多此类免疫过程发生在肿瘤微环境（TME）1,2,3,4中，在该环境中，不同类型的免疫细胞通过细胞因子直接或间接地与肿瘤细胞、彼此之间以及其他肿瘤间质成分相互作用，最终决定疾病的发展结局。因此，对TME中肿瘤免疫组分的特征分析，即肿瘤免疫表型分析，包括对不同谱系免疫细胞的分型、计数和定位，对于理解抗肿瘤免疫反应至关重要。在PDAC的情况下，已有研究提出，肿瘤内浸润的抑制性巨噬细胞（TAM）和B细胞水平升高，可能导致T细胞无法浸润和/或活化，并伴随高水平的纤维化5,6。
实验性研究免疫肿瘤微环境（TME）的常用方法是使用替代性肿瘤临床前动物模型，主要是相关的小鼠肿瘤模型7，特别是小鼠同源移植（同系移植）模型或基因工程小鼠癌症模型（GEMM），其依据是假设小鼠与人类在肿瘤和免疫方面具有相似性8,9。然而实际上，人们已认识到这两个物种之间存在固有的差异10,11。
移植小鼠肿瘤相较于自发性肿瘤具有显著的操作优势7即肿瘤同步发展，与亲本GEMM的自发性肿瘤发展相对。自发性小鼠肿瘤的同源移植被视为从未经过操作的原发性肿瘤 体外，以及模拟原始小鼠肿瘤的组织病理学/分子病理学特征7以及可能的免疫特征。这些小鼠同系移植物通常被认为 &#34;一种小鼠来源的患者衍生异种移植模型（PDXs）&#34;因此，它们可能比传统同源细胞系衍生的小鼠肿瘤具有更好的可转化性12特别是许多同基因型移植物来源于特定的基因工程小鼠模型（GEMM），其中包含特定的人类疾病机制， 例如 致癌驱动突变被引入工程化同源移植物，因此这些同源移植物在临床相关性方面应具有优势。特别是KPC基因工程小鼠模型（GEMM）在出生后15至20周内发展出小鼠胰腺导管腺癌（PDAC），其形态学特征与人类疾病高度相似，主要表现为良好至中等分化的腺体结构以及高度丰富的间质成分。该模型还重现了人类PDAC最常见的遗传特征，即Kras激活突变和P53功能缺失突变，这两种改变分别出现在90%和75%的人类PDAC病例中。5,6.
移植部位也被认为在模型的可转化性中起重要作用。特定的周围组织环境，例如相应的原位环境，可能为特定肿瘤的进展提供微环境 niche，而不同于常用于移植肿瘤的均一皮下（SC）环境。特别值得关注的是，这两种移植部位在免疫微环境方面是否存在差异，以及这些差异与人类癌症的相关性，例如在胰腺导管腺癌（PDAC）中的情况。
免疫谱型分析（免疫表型分析）最重要的方面之一是确定不同谱系的肿瘤浸润性免疫细胞，包括其在肿瘤内的数量、相对百分比、活化状态及空间定位。这包括肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs，含T细胞和B细胞）、肿瘤浸润性巨噬细胞（TAMs）、肿瘤浸润性自然杀伤细胞（NKs）以及肿瘤驻留的树突状细胞。3,13,14,15,16,17以及某些细胞的亚细胞定位18,19,20, 等等荧光激活细胞分选（FACS）或流式细胞术是一种常用于测量细胞特定参数的单细胞检测技术。多色流式细胞术可检测单个细胞上的多个标志物。3,4,21 是确定不同免疫细胞亚群（包括肿瘤内免疫细胞）数量和相对百分比的最常用方法。
本报告描述了肿瘤浸润性免疫细胞分析的实验流程：1）原位移植胰腺导管腺癌（PDAC）小鼠肿瘤同系移植物，同时进行皮下移植；2）通过肿瘤解离获取肿瘤组织并制备单细胞悬液；3）对来源于肿瘤的全部细胞进行流式细胞术分析，以建立基线数据；4）比较两种移植方式的基线特征谱。

<table><tbody><tr><td>麻醉机</td><td>\</td><td>SAS3119</td><td>\</td></tr><tr><td>穿刺器 20</td><td>\</td><td>\</td><td>2 mm</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>\</td><td>\</td><td>20 mm</td></tr><tr><td>100倍抗生素和抗真菌剂</td><td>\</td><td>\</td><td>\</td></tr><tr><td>碘伏棉签</td><td>\</td><td>\</td><td>每日药房采购</td></tr><tr><td>酒精棉签</td><td>\</td><td>\</td><td>每日药房采购</td></tr><tr><td>液氮</td><td>Air chemical</td><td>\</td><td>\</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>AIRTECH</td><td>BSC-1300IIA2</td><td>\</td></tr><tr><td>FACS 机器 LSRFortessa X-20</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>\</td></tr><tr><td>抗体</td><td>BD</td><td>\</td><td>\</td></tr><tr><td>Trevigen MD 或 BD Matrigel 基底膜基质 高浓度</td><td>BD</td><td>354248</td><td>\</td></tr><tr><td>FACS 缓冲液</td><td>BD</td><td>554656</td><td>剪碎缓冲液</td></tr><tr><td>Brilliant 染色缓冲液</td><td>BD</td><td>563794</td><td>\</td></tr><tr><td>小鼠 BD Fc 封闭剂</td><td>BD</td><td>553142</td><td>\</td></tr><tr><td>细胞滤器</td><td>BD-Falcon</td><td>352350</td><td>70 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>常规采血管</td><td>BD-Vacutainer</td><td>365974</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Kaluza</td><td>Beckman</td><td></td><td>vs 1.5</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>\</td></tr><tr><td>Foxp3 固定/破膜试剂盒</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>\</td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>ebioscience</td><td>01-2222-42</td><td>\</td></tr><tr><td>离心机</td><td>eppendorf</td><td>5810R,5920R</td><td>\</td></tr><tr><td>FlowJo 软件</td><td>FlowJo LLC</td><td>\</td><td>vs 10.0</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30809.01</td><td>\</td></tr><tr><td>一次性无菌手术刀片</td><td>Jin zhong</td><td>J12100</td><td>11#</td></tr><tr><td>刀柄</td><td>Jin zhong</td><td>J11010</td><td>\</td></tr><tr><td>眼科剪和镊子</td><td>Jin zhong</td><td>Y00030</td><td>眼科剪 10 cm</td></tr><tr><td>眼科剪和镊子</td><td>Jin zhong</td><td>JD1060</td><td>带齿眼科镊 10 cm</td></tr><tr><td>便携式液氮罐</td><td>Jinfeng</td><td>YDS-175-216</td><td>\</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Metter Toledo</td><td>AL204</td><td>0-100 g</td></tr><tr><td>Miltenyi C 管</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-334</td><td>\</td></tr><tr><td>Miltenyi Gentle MACS 配加热模块</td><td>Miltenyi</td><td>120-018-306</td><td>\</td></tr><tr><td>肿瘤解离试剂盒</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-730</td><td>\</td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer</td><td>Cellometer Auto T4</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Nunc</td><td>375418</td><td>1.8 mL</td></tr><tr><td>Cultrex 高蛋白浓度 (HC20+) BME</td><td>PathClear</td><td>3442-005-01</td><td>\</td></tr><tr><td>注射器</td><td>上海 MIWA 医疗工业</td><td>\</td><td>1-5 mL</td></tr><tr><td>Studylog 软件</td><td>Studylog</td><td>\</td><td>软件</td></tr><tr><td>Studylog-电子天平及配套 USB</td><td>OHAUS</td><td>SE601F</td><td>电子天平及配套 USB</td></tr><tr><td>Studylog-游标卡尺数据线</td><td>Sylvac</td><td>926.6721</td><td>游标卡尺数据线</td></tr><tr><td>游标卡尺</td><td>Sylvac</td><td>910.1502.10</td><td>Sylvac S-Cal pro</td></tr><tr><td>无菌离心管</td><td>Thermo</td><td>339653</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>无菌离心管</td><td>Thermo</td><td>339651</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>冰桶</td><td>Thermo</td><td>KLCS-288</td><td>4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>冰桶</td><td>Thermo</td><td>PLF-276</td><td>-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>冰桶</td><td>Thermo</td><td>DW-862626</td><td>-80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermo</td><td>am7021</td><td>\</td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术对小鼠原位同系移植（同源性）kpc 胰腺导管腺癌进行免疫表型分析

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

同基因型移植物（同系）肿瘤是当今肿瘤免疫学（I/O）临床前研究的主要模型。肿瘤微环境（TME），尤其是其免疫组分，对预后及治疗效果（特别是免疫治疗）的预测至关重要。TME的免疫组分由多种肿瘤浸润性免疫细胞亚群构成，可通过多色流式细胞术（FACS）进行分析。胰腺导管腺癌（PDAC）是致死率最高的恶性肿瘤之一，目前缺乏有效的治疗手段，存在迫切而未被满足的临床需求。PDAC对多种疗法（化疗、靶向治疗、免疫治疗）不敏感的重要原因之一在于其富含纤维母细胞和白细胞的复杂TME，这些成分可保护肿瘤细胞免受治疗攻击。与传统的皮下（SC）移植模型相比，原位移植的PDAC模型被认为能更真实地模拟人类胰腺癌的肿瘤微环境。
同系移植肿瘤（KPC）来源于基因工程KPC小鼠（KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-Cre）自发产生的胰腺导管腺癌（PDAC），并将其移植到小鼠体内（KPC-GEMM）。将原发肿瘤组织切成小片段（约2 mm3），皮下（SC）移植至同系受体小鼠（C57BL/6，7–9周龄）。随后，将这些同系移植瘤通过手术原位移植到新的C57BL/6小鼠的胰腺上，同时进行皮下植入，17天后肿瘤体积达到300–1,000 mm3。根据批准的解剖程序，仅采集体积为400–600 mm3的肿瘤，并清除周围非肿瘤组织。按照方案使用组织解离仪将肿瘤解离为单细胞悬液，随后用针对不同免疫细胞（淋巴细胞、髓系细胞、NK细胞、树突状细胞）多种标志物的荧光标记抗体组合进行染色。染色后的样本通过多色流式细胞术（FACS）分析，以确定不同谱系免疫细胞的数量及其在肿瘤内的相对比例。随后将原位移植肿瘤的免疫谱型与皮下移植肿瘤进行比较。初步数据显示，位于胰腺上的肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）显著升高，且原位移植肿瘤中B细胞的浸润程度高于皮下移植肿瘤。

PDAC的原位移植导致肿瘤快速生长，其生长速度与皮下移植相似。根据步骤2.1和2.2中所述方案，将供体肿瘤组织片段分别皮下和原位移植至受体小鼠后，所移植的KPC同源移植物肿瘤均表现出类似的快速生长趋势，如图1A所示。在不同时间点收获的KPC同源移植物肿瘤如图1B所示，代表性H&amp;E染色图像见图1C。我们的数据表明，皮下移植与原位移植的肿瘤生长情况相似。
无论是原位移植还是皮下移植来源的活体肿瘤细胞以及肿瘤微环境（TME）中的细胞（包括肿瘤浸润性免疫细胞）均可被高效回收。肿瘤组织经收获并消化后，按照第4步所述方案，使用商用组织解离仪制备单细胞悬液，用于后续的流式细胞术（FACS）分析（图2A）。通常情况下，两种移...

小鼠原位胰腺导管腺癌同种移植瘤免疫表型分析的实验步骤旨在对肿瘤免疫微环境进行特征分析。通过手术将肿瘤原位植入小鼠体内。收获体积为200–600 mm3的肿瘤组织并进行解离，制备单细胞悬液，随后使用不同荧光标记抗体进行多免疫标志物的流式细胞术分析。

通过流式细胞术对小鼠原位同系移植（同源性）KPC 胰腺导管腺癌进行免疫表型分析

同基因型（同系）肿瘤是当今肿瘤免疫学（I/O）临床前研究的主要模型。肿瘤微环境（TME），特别是……

该方法可帮助解答小鼠模型免疫表型分析中的关键问题，例如用于识别不同免疫谱系的标志物以及衰老研究策略。该技术的主要优势在于，免疫表型分析中所使用的标志物和衰老策略可应用于多种小鼠模型。使用天平监测C57 Black 6小鼠的体重。同时，通过卡尺测量监测不同供体小鼠的肿瘤体积变化。按照实验方案，在生物安全柜中对动物实施安乐死后，使用碘伏棉签对肿瘤周围皮肤进行消毒。按照文本方案中详述的步骤进行手术切除肿瘤后，将肿瘤置于含有20毫升预冷至4°C的磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。如果有血液污染，将肿瘤转移至另一个培养皿中，并用 PBS 清洗肿瘤。将肿瘤切成两半，去除多余的皮肤、血管、钙化组织和坏死组织。仅选择完整的肿瘤组织块，并将其放入无菌的50毫升离心管中。在将离心管转运至单独的动物房进行药理学研究前，加入20毫升PBS。为准备原位移植，将完全麻醉的小鼠固定在实验板上，呈右侧卧位。用碘伏消毒脾脏周围的皮肤，然后用75%乙醇脱碘。找到脾脏的中点，在腹部做一道1厘米长的垂直切口以暴露脾脏。使用平头镊子轻轻牵出脾脏下方的部分胰腺组织。使用9-O可吸收外科缝线，将来自C小鼠的Sutro小鼠同系移植瘤组织块缝合到受体小鼠的胰腺上。用6-O丝线以双层缝合方式关闭腹腔。通过压迫实现止血。完成肿瘤植入后，将动物置于温暖的笼子中，直至无出血或肿瘤组织渗漏。持续监测动物，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。待动物从麻醉中完全恢复后，将其送回动物房。通过触诊脾脏附近的腹部来监测荷瘤小鼠，并筛选出携带原位肿瘤的小鼠。针对每个肿瘤，准备一根含有肿瘤消化缓冲液的C管。对于重量小于0.8克的肿瘤组织碎片，使用3毫升消化缓冲液，以确保肿瘤组织充分消化。用研究编号、肿瘤名称、小鼠编号、处理组和肿瘤重量标记肿瘤。从小鼠体内取出肿瘤，用冷的PBS清洗肿瘤，并清除附着在肿瘤上的组织。将肿瘤组织放入无菌6孔板的一个孔中的消化液中。用无菌镊子或止血钳固定肿瘤组织，并用手术刀进行切割，充分切碎肿瘤至形成较小的组织块。现在，将肿瘤组织块放回C管中，并用剩余的消化缓冲液冲洗培养板。将液体转移至C管中，置于冰上直至进行消化。然后开启带有加热器的组织解离仪。将肿瘤解离C管倒置放入空位的套管中。将管子位置状态从“Free”调整为“Selected”。选择解离程序，然后选择显示程序列表所需的文件夹。程序结束后，从解离仪上取下C管，短暂离心以沉淀样本。随后重新悬浮样本，并将其转移至置于50毫升离心管上方的细胞筛中。用10毫升洗涤缓冲液冲洗细胞，使其通过细胞筛，从而获得单细胞悬液。将离心管在300 G条件下离心5分钟后，弃去上清液，并用5毫升洗涤缓冲液重悬细胞。计数活细胞，并将细胞浓度调整至每管或每份样品1×10⁶个细胞。按照文本方案中的详细说明进行免疫 panel 设计、免疫染色以及荧光减一对照实验。在流式仪器预热的同时，使

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

流式细胞术对小鼠原发性胰腺导管腺癌原位同种异体 (自体) 免疫分型的研究

癌症干细胞（CSCs）已在多种恶性肿瘤中被发现。本方案描述了一种流式细胞术方法，利用醛脱氢酶活性以及CD44和CD24的表达，从人胰腺导管腺癌异种移植瘤中分离癌症干细胞。这些活细胞随后可用于功能性和分析性研究。...

从人胰腺癌异种移植瘤中分离干细胞

该视频介绍了一种逐步手术方法，用于将癌性供体小鼠的肿瘤组织片段原位移植到无癌受体小鼠的胰腺中，以建立胰腺癌模型。与传统的皮下（SC）模型相比，原位移植的胰腺导管腺癌（PDAC）模型能更准确地模拟人类胰腺癌的组织微环境。...

原位同系移植瘤模型构建：一种建立胰腺肿瘤小鼠模型的技术

介绍了一种通过将II-45间皮瘤细胞植入免疫功能正常大鼠的胸膜腔来建立胸膜恶性间皮瘤原位大鼠模型的方法。同时还描述了一种流式细胞术方法，可用于从25...

II-45同系大鼠间皮瘤模型中的原位移植及外周免疫细胞监测

我们概述了一种通过流式细胞术检测原代急性髓系白血病细胞上白血病干细胞标志物共表达的实验方案。我们展示了如何定量分析三种具有不同程度成熟特征的前体细胞群以及一个假定的白血病干细胞（LSC）群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中证实了这些细胞群的存在。...

通过流式细胞术在初诊及随访时评估原发性急性髓系白血病和患者来源异种移植模型中的白血病干细胞

本文介绍一种微创的同基因型小鼠肺腺癌细胞原位移植模型，该模型可节省时间和成本，用于研究非小细胞肺癌。...

同基因型肺癌腺癌细胞的原位移植用于研究PD-L1表达

我们描述了一种在超声引导下将小鼠来源的胰腺导管腺癌细胞系直接植入原位肿瘤部位的实验方案。该方法在注射后2至4周内即可通过超声扫描检测到胰腺肿瘤，且与手术原位植入相比，显著减少了肿瘤细胞在腹膜壁上的种植比例。...

超声引导下小鼠胰腺导管腺癌原位移植

本方案描述了原位胰腺肿瘤的手术建立方法以及新鲜分离的小鼠胰腺肿瘤的快速消化过程。消化后，可获取具有活性的免疫细胞群体，用于后续分析，包括 离体...

原位胰腺肿瘤的构建与 离体 肿瘤浸润性T细胞毒性的表征

本文介绍了一种用于在小鼠肿瘤模型中表征肿瘤固有及外周来源的肿瘤浸润淋巴细胞的肿瘤移植方案。通过流式细胞术特异性追踪受体来源免疫细胞的浸润，可揭示这些细胞在抗肿瘤免疫应答过程中表型与功能变化的动力学特征。...

小鼠肿瘤浸润性CD8+ T细胞动态评估的肿瘤移植方法

胰腺导管腺癌（PDAC）的同系小鼠原位异种移植模型能够重现疾病亚型的生物学特性、表型特征及治疗反应。由于其肿瘤进展迅速且可重复性高，这类模型被广泛应用于临床前研究。本文介绍了构建此类模型的常用方法，即将同系小鼠来源的PDAC细胞系接种至胰腺中。...

同基因小鼠原位异体移植模型构建胰腺癌模型

我们描述了一种利用流式细胞术从小鼠肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中分离细胞并进行过继性细胞转移的方法。该方案旨在验证TILs在同基因型胰腺癌小鼠模型中对肿瘤的特异性细胞毒性，为胰腺癌的过继性细胞治疗开发提供依据。...

基于流式细胞术分离及在胰腺癌小鼠模型中对肿瘤浸润淋巴细胞进行治疗效果评估

本文描述了一种基于磷酸化流式细胞术的方法，用于分析移植到小鼠体内并从骨髓穿刺液中获取的人急性髓系白血病细胞中 mTORC1、JAK/STAT5 和 MAPK 信号通路下游的信号传导。利用新一代光谱流式细胞仪，可同时高灵敏度地检测 p-STAT5、p-4EBP1、p-RPS6 和 p-ERK1/2...

急性髓系白血病患者来源异种移植模型的细胞内磷酸流式细胞术

了解如何使用流式细胞术对小鼠原位胰腺导管腺癌同种异体移植物进行免疫分型分析。该方法利用多免疫标记荧光激活细胞分选技术，成功分析肿瘤免疫微环境并识别关键免疫细胞亚群，为研究肿瘤免疫治疗策略提供可靠实验方案。

通过流式细胞术对小鼠原位同系移植（同源性）KPC 胰腺导管腺癌进行免疫表型分析

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