流式细胞术对小鼠原发性胰腺导管腺癌原位同种异体 (自体) 免疫分型的研究

此消息可以帮助回答 Murine 模型中的免疫现象分析中的关键问题，例如用于识别不同免疫血统和老化策略的标记。该技术的主要优势是，标记和老化状态，当免疫现象，可以应用于各种喃自分模型。使用平衡监测C57黑6小鼠的体重。

此外，通过口径测量监测肿瘤变化供体小鼠的肿瘤体积。按照协议，在生物危害罩中对动物进行安乐死后，使用Iodophor拭子对肿瘤周围的皮肤进行消毒。手术切除肿瘤后，如文本协议中详述，将肿瘤放在含有20毫升PBS的培养皿中，该培养皿已预冷却至4摄氏度。

如果有污染血液，将肿瘤转移到另一个培养皿中，用PBS清洗肿瘤。把肿瘤切成两半。去除任何多余的皮肤、血管、钙化和坏死。

只选择完整的肿瘤片，并把它们放在无菌的50毫升离心管。在将管子运送到单独的动物室进行药理学研究之前，先加入20毫升的PBS。要准备正畸植入，请将完全麻醉的鼠标固定到右侧的实验板上。

用伊碘消毒脾脏周围的皮肤，然后用75%乙醇去碘。找到脾脏的中位点，并在腹部进行1厘米的垂直切口，以暴露脾脏。轻轻地，用扁平的尖端钳子从脾脏下抽出部分胰腺组织。

和苏特罗小鼠同体肿瘤片从C小鼠到接受小鼠的胰腺通过9-O可操作缝合。用双缝用 6-O 丝缝关闭腹部。通过压缩实现平衡。

完成肿瘤植入后，只要不出血或肿瘤组织泄漏，就将动物关在温暖的笼子里。监测动物，直到他们恢复足够的意识，以保持胸骨的隐用。麻醉后，将动物返回到动物室。

通过使腹部靠近脾脏，然后选择具有正畸肿瘤的小鼠来监测肿瘤变化。对于每个肿瘤，准备一个C管与肿瘤消化缓冲液。使用3毫升消化缓冲液对肿瘤片段小于0.8克，以确保肿瘤完全消化。

用研究代码、肿瘤、小鼠ID、治疗组和肿瘤重量标记肿瘤。从老鼠那里收集肿瘤。在冷PBS中清洗肿瘤并清除肿瘤上的组织。

将肿瘤放在消化介质中，放在无菌6井板的一个井中。用无菌钳子或钳子将肿瘤放在原位，用手术刀切片。将肿瘤切成小块。

现在，将肿瘤片放回C管中，用剩余的消化缓冲液清洗盘子。将液体转移到C管中，放在冰上直到消化。然后打开带加热器的分离器。

将肿瘤分离C管倒置到空位套筒中。将管位置的状态从"自由"调整为"选定"。选择一个分离程序，然后选择显示程序列表所需的文件夹。

程序终止后，将 C 管从分离器上拿开，然后短暂旋转以托盘样品。现在，重新悬浮样品，并把它们放入50毫升管上方的细胞过滤器中。用10毫升的洗涤缓冲液通过细胞过滤器清洗细胞，以提供单个细胞悬浮液。

在300 G下离心管5分钟后，丢弃上经液，用5毫升洗涤缓冲液重新悬浮细胞。计算可行细胞，将细胞浓度调整为每管或每个样本100万个细胞。执行免疫面板设计、免疫污点和荧光减去一个控制作为文本协议中的细节。

准备 UltraComp 珠子，同时在流动仪器预热时，在使用前彻底旋转它们。为每个氟化物结合抗体标记单独的 12 x 75 毫米样品管。在每个管子中加入100微升的染色缓冲液，然后滴一滴珠子。

添加抗体并执行文本协议中描述的染色过程。然后向每个珠子颗粒添加0.5毫升染色缓冲液，通过涡流完全重新悬浮。现在，为给定实验设置每个目标组织的流式细胞仪 PMT 电压。

通过 Flow cytometry 运行样本以进行数据采集，通过获取每个正向散射和侧散射读数的单个珠子比例。将流速设置为大约 200 到 300 个事件/秒。使用 FL1 与 FL1 点图为给定荧光素 FITC 结合抗体设置适当的补偿。

放置象限栅门，使负珠位于左下象限内，正磁珠位于右下象限的上部或右下限内。调整补偿值，直到每个总体的荧光强度中位数大致相等。对所有管重复这些步骤。

现在，继续获取实际的污渍样品。运行补偿向导，并保存设置格式:日期、实验和首字母缩写。胰腺导管腺癌的正畸植入导致肿瘤快速生长，类似于皮下植入。

显示代表性的赤氧林和 eosin 染色图像，并展示皮下和正畸植入物的类似生长。从两种植入的肿瘤样本中获得合理的高可行细胞产量。代表性的 FACS 飞溅显示从从死细胞和细胞碎片分离的肿瘤中存活的细胞。

这里显示，是一个肿瘤渗透免疫配置文件比较的主要和分子细胞群体的几个关键子集的肿瘤免疫细胞。显示胰腺癌的皮下与正畸同。数据清楚地表明，与健康小鼠的胰腺相比，肿瘤的免疫细胞渗透显著增加。

此外，在正畸与皮下同体发现不同比例的肿瘤渗透免疫细胞子集。例如，正畸的 B 细胞明显比皮下细胞多。在尝试此过程时，必须记住提前准备所有相关的材料和试剂。

观看此视频后，您应该对如何对 Murine 模型执行 FACS 分析有一个很好的了解。