小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体激活与细胞焦亡的检测

本实验方案的总体目标是通过荧光显微镜在单细胞水平上检测炎性小体的活化，并通过乳酸脱氢酶（LDH）释放实验来测量焦亡过程中的细胞裂解。该方法有助于回答炎性小体研究领域中的关键问题，例如Caspase-1的活化是如何被调控的。这些技术的主要优势在于，它们使研究者能够同时观察炎性小体活化和焦亡通路中的多个步骤。

本实验操作由本实验室的研究科学家 Andreas den Hartigh 演示。首先，将接种在玻璃盖玻片上的脂多糖（LPS）预刺激骨髓来源巨噬细胞的培养基更换为每孔 290 微升的 DMEM 5 培养基，其中添加 5 微摩尔尼日利亚菌素（nigericin）和 5 毫摩尔甘氨酸。将 24 孔板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的细胞培养箱中孵育 60 分钟，并在孵育开始 15 分钟后加入 10 微升 30X FAM-YVAD-FMK。

孵育结束后，每孔加入一毫升预冷的 PBS，洗涤三次，每次五分钟。将细胞置于冰上避光环境中，每孔加入 250 微升 2% 多聚甲醛固定 30 分钟，并在最后五分钟加入适当的荧光核染料对细胞进行标记。孵育结束后，按上述方法用预冷 PBS 洗涤细胞三次，每张载玻片加入七微升抗荧光淬灭封片剂。将盖玻片覆盖在每张载玻片上，室温静置过夜使封片剂固化，随后用指甲油密封盖玻片。

为了通过荧光共聚焦显微镜观察细胞，将未经处理的对照玻片放置在显微镜载物台上，并手动对焦至细胞。根据显微镜的查找表设置，调节偏移值，直至在未经处理的细胞中未观察到探针阳性染色。接下来，使用经尼日霉素处理的样本，寻找一个同时包含探针染色阳性与阴性细胞的视野，并调整探针通道的成像平面，使其对准阳性染色强度最高的层面。

然后调节增益，直至在细胞核凝聚的细胞中可见焦点，并在每张载玻片上随机选取五个视野，以100倍总放大倍数获取图像。对于经尼日霉素处理细胞的免疫荧光化学分析，按照上述方法洗涤Prop标记的细胞，随后每孔加入250 µL固定和透化溶液，冰上孵育30分钟，避光。用新鲜洗涤缓冲液再洗涤巨噬细胞三次，每孔加入250 µL针对含C末端半胱天冬酶募集结构域的凋亡小体相关斑点样蛋白（ASC）的一抗，冰上孵育1小时。

孵育结束后洗涤细胞，每样本加入250微升相应的荧光标记二抗，冰上避光孵育1小时，并在最后5分钟内加入4微升合适的荧光核染色染料。用预冷的洗涤缓冲液洗涤细胞3次后，取7微升抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于载玻片上（如图所示），通过荧光共聚焦显微镜观察巨噬细胞。为进行乳酸脱氢酶（LDH）释放实验，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，向各实验孔中加入50微升添加了10微摩尔尼日利亚菌素的DMEM 5培养基，向自发释放对照孔和100%裂解对照孔中各加入50微升DMEM 5培养基，孵育60分钟。

30分钟后，向100%裂解对照孔中加入10微升10X裂解缓冲液，向其他孔中加入10微升培养基。孵育结束后，离心培养板，并将每孔中的50微升上清液转移至透明平底板中。接着，向每孔加入50微升新鲜解冻并配制好的底物，避光孵育30分钟，在15分钟后检查培养板，以确认信号不会超出酶标仪的检测限。

孵育结束后，向每孔加入 50 微升终止液，并使用合适的酶标仪测定 OD490，以计算每孔细胞裂解的百分比。暴露于尼日尔菌素的巨噬细胞显示出在核周区域形成 ASC 聚焦点，且该聚焦点包含活化的 Caspase-1，表明这些细胞正在经历焦亡。而 Caspase-11 缺陷小鼠的巨噬细胞虽也能形成 ASC 聚焦点，但该聚焦点未见任何活化的 Caspase-1，这由 FAM-YVAD-FMK 染色缺失所证实。

这些细胞的细胞核也未发生浓缩，表明不存在细胞焦亡。此外，通过检测培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）的释放量可知，大量野生型巨噬细胞在尼日里辛处理后发生细胞死亡，而Caspase-1缺陷的巨噬细胞则不会将LDH释放到上清液中，说明这些细胞仍保持完整。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用荧光显微镜观察炎症小体的形成，以及如何通过检测LDH释放量来评估细胞裂解程度。

该方案可根据其他炎性小体刺激物或影响炎性小体活化或细胞焦亡的干预措施进行调整。