小鼠骨髓源性巨噬细胞 Inflammasome 活化和 Pyroptotic 细胞死亡的检测

该方案的总体目标是通过荧光显微镜检查单细胞水平的炎性小体活化，并通过乳酸脱氢酶或 LDH 释放测定测量焦亡过程中的裂解。这种方法可以帮助回答炎性小体领域的关键问题，例如 Caspase-1 激活是如何调节的。这些技术的主要优点是它们允许用户检查炎性小体激活和焦亡途径的多个步骤。

演示该程序的是我实验室的研究科学家 Andreas den Hartigh。首先用每孔 290 微升补充有 5 微摩尔黑牙菌素和 5 毫摩尔甘氨酸的 DMEM 5 培养基替换接种在玻璃盖玻片上的 LPS 引发的骨髓衍生巨噬细胞的培养基。将 24 孔板放回细胞培养箱中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下放置 60 分钟，并在前 15 分钟后加入 10 微升 30X FAM-YVAD-FMK。

孵育结束时，用每孔 1 毫升冷 PBS 洗涤细胞，每次洗涤 3 次，每次 5 分钟，然后用每孔 250 微升 2% 多聚甲醛在避光冰上固定细胞 30 分钟，最后 5 分钟内用适当的荧光核染料标记细胞。在孵育结束时，如前所述，用冷 PBS 洗涤细胞 3 次，并在每张载玻片上加载 7 微升抗褪色封固剂。将盖玻片放在每个载玻片上，让安装介质硬化过夜，然后用指甲油密封盖玻片。

为了通过荧光共聚焦显微镜对细胞进行成像，将未处理的对照玻片放在显微镜载物台上并手动聚焦在细胞上。使用显微镜查找台设置，调整偏移量，直到在未处理的细胞中未观察到阳性探针染色。接下来，使用尼日利亚菌素处理的样品，找到包含探针染色阳性和阴性细胞的区域，并将探针通道的成像平面调整到具有最高阳性染色强度的平面。

然后调整增益，直到在具有浓缩细胞核的细胞中可以看到病灶，并以 100 倍的总放大倍率获得每张载玻片上随机选择的五个视野的图像。对于尼日利亚菌素处理的细胞的免疫荧光化学分析，如刚才所示洗涤 prop 标记的细胞，并将细胞在每孔 250 μL 固定和透化溶液中避光孵育 30 分钟。用新鲜的洗涤缓冲液再洗涤巨噬细胞 3 次，并用 250 微升针对上睑下垂相关斑点样蛋白的一抗标记细胞，该蛋白含有 C 末端 caspase 募集结构域或 ASC，每孔在冰上放置 1 小时。

孵育结束时洗涤细胞，并在冰上用 250 μL 适当的荧光染料偶联的二抗标记样品一小时，在最后 5 分钟内加入 4 μL 适当的荧光核染色染料。在冷洗涤缓冲液中洗涤细胞 3 次后，如图所示，用 7 微升抗褪色封固剂将盖玻片安装到载玻片上，并通过荧光共聚焦显微镜对巨噬细胞进行成像。要进行 LDH 释放测定，向每个实验孔中加入 50 微升补充有 10 微摩尔黑蔹菌素的 DMEM 5 培养基，向自发和 100% 裂解对照孔中加入 50 微升 DMEM 5，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下放置 60 分钟。

30 分钟后，向 100% 裂解对照孔中加入 10 μL 10X 裂解缓冲液，向其他孔中加入 10 μL 培养基。孵育结束时，离心板并将每个孔中的 50 μL 上清液转移到透明的平底板中。接下来，向每个孔中加入 50 微升新鲜解冻和制备的底物，在黑暗中孵育 30 分钟，15 分钟后检查板，确认信号不会超过读板器的检测限。

在孵育结束时，向每个孔中加入 50 μL 终止液，并在适当的读板器上测量 OD 490 ，以计算每孔的细胞裂解百分比。而暴露于尼日利亚菌素的类型巨噬细胞表明在核周区域形成 ASC 病灶，其中也含有活性 Caspase-1，表明这些细胞正在经历焦亡。虽然来自 Caspase-111 缺陷小鼠的巨噬细胞也会产生 ASC 病灶，但这些细胞没有任何与该病灶相关的活性 Caspase-1，如不存在 FAM-YVAD-FMK 染色所示。

这些细胞的细胞核也没有浓缩，表明没有焦亡细胞死亡。此外，通过其培养上清液的 LDH 释放分析测量，很大一部分野生型巨噬细胞在黑合菌素暴露后发生细胞死亡，而缺乏 Caspase-1 的巨噬细胞不会将 LDH 释放到上清液中，表明细胞仍然完整。观看本视频后，您应该对如何通过荧光显微镜观察炎性小体的形成以及通过测量 LDH 释放来确定细胞裂解水平有很好的了解。

该程序可以修改以使用其他炎性小体刺激或改变炎性小体激活或焦亡的干预措施。