Name: MALDI 质谱法测定小鼠组织提取物蛋白酶特异性: 操作 PH 值导致特异性改变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 了解如何使用MALDI-TOF质谱法测定小鼠肺组织粗提物中的蛋白酶特异性。该方法可在不同pH条件下同时分析多个样品，为研究蛋白酶活性提供高通量解决方案。

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本工作部分得到了日本药科大学研究基金（2016年）以及日本文部科学省科学研究费补助金（MEXT KAKENHI）项目编号JP17854179的支持。

动物实验方案已获日本药科大学伦理委员会批准，并依照日本药科大学《实验动物护理与使用指南》进行。该方案已针对ICR&#160;小鼠来源的组织提取物进行了调整。ICR小鼠购自日本Nippon SLC有限公司（静冈，日本）
1. 亚氨基生物素标记底物的制备
底物采用9-芴甲氧羰基（Fmoc）保护的氨基酸进行固相合成，具体方法如下所述11。根据目标氨基酸及合成阶段，参考表2确定所用的Fmoc化合物。
<ol>
	<li>在合成柱中，用 10 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）冲洗 0.2 g Fmoc-NH-SAL 树脂。</li>
	<li>加入 5 mL 含 30% 哌啶的 DMF 溶液。振荡反应液 10 分钟，以切除 Fmoc 保护基团。</li>
	<li>使用三硝基苯磺酸（TNBS）检测 Fmoc 去保护效果12：取 10 µL 1% TNBS 的 DMF 溶液和 10 µL 二异丙基乙胺（DIPEA）加入一支 10 × 75 mm2 玻璃试管中，然后转移少量树脂至该试管。若 Fmoc 已被成功切除，树脂应呈现橙色。
	<ol>
		<li>若检测结果为阴性，则重复步骤 1.2–1.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 5 mL DMF 洗涤树脂三次。</li>
	<li>加入 5 mL DMF 溶液，其中含 0.3 mmol 表 2 所列的 Fmoc 化合物（从第一阶段使用的化合物开始）、0.3 mmol O-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HCTU）、0.3 mmol 1-羟基-1H-苯并三唑一水合物（HOBt）以及 0.6 mmol 二异丙基乙胺（DIPEA）。振荡反应液 30 分钟，使化合物与树脂偶联。
	<ol>
		<li>使用 TNBS 法检测此步骤的偶联效果。若结果为阳性，表明反应未充分进行，需重复该步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 5 mL DMF 洗涤树脂三次。</li>
	<li>通过重复步骤 1.2–1.6 进行肽链延长，每次根据 表 2 更换步骤 1.5 中使用的 Fmoc 化合物。</li>
	<li>加入 1 mL 含 2.5% 水、1% 三异丙基硅烷（TIS）和 2.5% 乙二硫醇（EDT）的三氟乙酸溶液，以从树脂上裂解肽并去除保护基团。振荡反应液 60 分钟。</li>
	<li>过滤，并将滤液收集至 50 mL 离心管中。</li>
	<li>加入 40 mL 冷的乙醚，并于 -20 °C 静置过夜。</li>
	<li>在 -20 °C 下以 4,000 × g 离心 30 分钟，收集沉淀物。</li>
	<li>使用干燥器干燥 3 小时，以去除乙醚。</li>
	<li>加入 1 mL 50% 乙腈水溶液溶解粗肽。冷冻干燥以去除三氟乙酸。重复此步骤数次。</li>
	<li>使用 C18 柱对肽进行纯化。
	<ol>
		<li>用 3 mL 乙腈（ACN）活化 C18 柱中的树脂。</li>
		<li>用 5 mL 含 5% ACN 和 0.1% TFA 的 H2O 溶液平衡柱子。</li>
		<li>将粗合成肽样品加载至 C18 柱中。</li>
		<li>用 10 mL 含 5% ACN 和 0.1% TFA 的 H2O 溶液洗涤柱子。</li>
		<li>用 3 mL 含 60% ACN 和 0.1% TFA 的 H2O 溶液洗脱样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 MALDI-TOF 质谱法测定肽的分子量以进行鉴定。
	<ol>
		<li>取 1 µL 洗脱液点样于靶板上，立即加入饱和的 α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）溶液（溶于含 0.1% 三氟乙酸的 50% 乙腈中）。</li>
		<li>通过空气干燥使混合物结晶。</li>
		<li>按照仪器制造商的操作说明采集样品质谱数据。
		<ol>
			<li>手动将 MALDI-TOF 质谱仪设置为正离子反射模式。</li>
			<li>使用 CHCA、缓激肽片段 1-7（单一同位素分子量 = 756.3997 Da）和血管紧张素 II（单一同位素分子量 = 1,045.5423 Da）对质谱仪进行校准。</li>
			<li>采集合成肽的质谱图，并与理论分子量进行比对分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织提取物的制备
<ol>
	<li>将雄性ICR小鼠置于异氟烷吸入麻醉舱中进行麻醉，并通过夹趾反应确认麻醉深度。采用颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>使用剪刀沿腹中线剪开皮肤，切口向上延伸至剑突。</li>
	<li>剪开膈肌，取出全部肺组织，将组织剪成小块。</li>
	<li>用预冷的50 mM Tris缓冲盐水（pH 7.4）清洗组织三次。</li>
	<li>称量组织，取约100 mg转移至12 x 75 mm2玻璃试管中。</li>
	<li>加入0.3 mL提取缓冲液（50 mM Tris缓冲液，pH 7.4，含0.1%聚氧乙烯辛基苯基醚）。</li>
	<li>使用混匀式匀浆器对肺组织样本进行匀浆处理。
	<ol>
		<li>将样本置于冰上冷却。</li>
		<li>在搅拌器中以20,000 rpm速度匀浆30秒。重复此步骤直至样本完全均一。 
		注意：为避免温度升高，每次连续匀浆时间不得超过1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将1,000 µL匀浆液转移至1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以10,000 x g离心5分钟。</li>
	<li>将500 µL上清液转移至新的1.5 mL塑料离心管中。</li>
	<li>取10 µL样本，使用双辛可宁酸（BCA）法或考马斯亮蓝（CBB）法测定蛋白浓度。</li>
	<li>为防止冻结，向样本中加入80%甘油，使甘油终浓度为50%。</li>
	<li>将样本储存于-80 °C，待后续使用。</li>
</ol>
3. 模型蛋白酶和组织提取物中底物的消化
<ol>
	<li>将10 µL浓度为0.1 µg/µL的N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）-胰蛋白酶、0.1 µg/µL的金黄色葡萄球菌V8蛋白酶或10 µg/µL的组织提取物加入890 µL消化缓冲液中。
	<ol>
		<li>为阐明蛋白酶特异性随pH变化的差异，使用pH值分别为3、5、7和9的缓冲液。消化缓冲液的组成见表3。</li>
		<li>采用经沸水（或100 °C加热）处理10分钟灭活的蛋白酶制备组织提取物，作为阴性对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入10 µL亚氨基生物素标记的底物（溶于二甲基亚砜（DMSO），终浓度 = 100 pmol/10 µL）。</li>
	<li>在37 °C孵育3小时，以消化亚氨基生物素标记的底物。</li>
	<li>孵育结束后，将反应管置于沸水（或100 °C）中加热10分钟，终止底物消化反应。</li>
	<li>将消化后的底物在4 °C、10,000 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
</ol>
4. 亚氨基生物素标记底物的纯化
<ol>
	<li>加入 50 µL 50% 链霉亲和素 Sepharose 微珠，溶于含 0.1% 聚氧乙烯辛基苯基醚的 1 M Tris 缓冲液（pH 9）中。
	<ol>
		<li>使用 pH 试纸确认溶液 pH 值约为 9。若溶液 pH 值偏低，可加入含 0.1% 聚氧乙烯辛基苯基醚的 1 M Tris 缓冲液（pH 9）调节至约 pH 9。此步骤至关重要，因其涉及亚氨基生物素标记底物与链霉亲和素的结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 °C 下于旋转摇床中持续轻柔混匀，孵育过夜，以使亚氨基生物素标记底物与链霉亲和素结合。孵育期间应保持微珠悬浮状态。</li>
	<li>在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>按以下步骤洗涤微珠五次：
	<ol>
		<li>向微珠中加入 1,000 µL 洗涤缓冲液（50 mM Tris 缓冲液，pH 9）。</li>
		<li>在 4 °C 下于旋转摇床中持续轻柔混匀洗涤 10 分钟。孵育期间应保持微珠悬浮状态。</li>
		<li>在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向微珠中加入 100 µL 0.2% 三氟乙酸。
	<ol>
		<li>使用 pH 试纸确认溶液 pH 值低于 2。若溶液 pH 值偏高，可加入 1% 三氟乙酸将 pH 值调节至低于 2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下于旋转摇床中持续轻柔混匀孵育 30 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 1 分钟，然后将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。</li>
</ol>
5. 样品制备与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF 质谱）
注意：以下步骤中的所有溶液均应使用高效液相色谱（HPLC）级或氨基酸测序级水配制。
<ol>
	<li>用移液器将 500 µL 乙腈加到 C18 树脂上以活化树脂。去除使用过的乙腈。重复此步骤三次。</li>
	<li>用 100 µL 含 0.1% 三氟乙酸的溶液平衡 C18 树脂。去除洗脱液。重复此步骤三次。</li>
	<li>为上样，使用移液器将样品结合到树脂上。</li>
	<li>用 20 µL 含 0.1% 三氟乙酸的溶液洗涤树脂。重复此步骤五次。</li>
	<li>用 3 µL 含 0.1% 三氟乙酸的 60% 乙腈溶液洗脱样品。将洗脱液移取至 MALDI-TOF 质谱仪的目标板上。立即加入饱和的 α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）溶液（溶于含 0.1% 三氟乙酸的 50% 乙腈中）。</li>
	<li>通过空气干燥使混合物结晶。</li>
	<li>根据仪器制造商的操作规程采集样品的质谱图。
	<ol>
		<li>手动将 MALDI-TOF 质谱仪设置为正离子反射模式。</li>
		<li>使用 CHCA、缓激肽片段 1-7（单同位素分子量 = 756.3997 Da）和血管紧张素 II（单同位素分子量 = 1,045.5423 Da）校准质谱仪。</li>
		<li>采集样品的质谱图，特别注意 700 至 900 Da 范围内的质谱峰，以检测生物素标记底物的切割形式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 表 1 鉴定检测到的峰。检测到相应的分子量表明在相关氨基酸的 C 末端发生了切割。</li>
</ol>

<ol><li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+%28a+review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li>
<li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein%5BTitle%5D)+AND+%22Vopr+Med+Khim%22%5BJournal%5D)">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li>
<li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li>
<li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li>
<li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li>
<li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li>
<li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li>
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<li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li>
<li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li>
<li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00897a025">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li>
<li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2%2C4%2C6-trinitrobenzenesulphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li>
<li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+NeutraLite+avidin%3A+A+non-glycosylated%2C+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li>
<li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF质谱）鉴定来源于组织提取物的粗提样品中蛋白酶的特异性，并可轻松扩展用于多个样品的高通量处理。特别地，我们通过调节pH值来诱导底物特性的改变。
由于亲和素-生物素复合物（ABC）方法具有结合特异性，已在生物化学领域广泛应用，因此本实验方案采用了该方法。由于ABC具有很强的亲和力，亲和素与生物素的结合几乎不可逆，因此针对ABC的亲和纯化效率极低。基于此原因，我们预计生物素标记底物的回收率会较低。在本研究中，我们仅使用低pH条件进行洗脱；然而，去糖基化的亲和素树脂13或单体亲和素树脂14也可用于纯化生物素标记的底物。
本研究提出的方法可根据不同的实验体系和应用进行调整；但需注意，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）无法进行定量分析。一旦确定了底物特异性，可采用光谱分析法、荧光测定法或荧光共振能量转移（FRET）进行更准确的定量。
<p class=...

蛋白酶通过切割蛋白质来调控生理过程，而蛋白酶活性在特定时间和空间上的启动受到调控1。因此，确定在局部受调控的组织中蛋白酶的表达与活性至关重要，并且需要开发一种检测蛋白酶的新方法。本研究提出的方法旨在在检测蛋白酶的同时，平行鉴定其底物特异性。
检测蛋白酶特异性有多种方法。偶氮酪蛋白法因其在蛋白酶检测中的应用而广为人知2，但在获取进一步信息方面存在局限性。Zymography 是另一种全面的蛋白酶检测方法，可用于确定蛋白酶的分子量3，但无法用于研究底物特异性。蛋白酶特异性可通过分光光度法测定，例如使用对硝基苯胺（p-nitroanilide）类底物4；也可通过荧光测定法，使用香豆素类底物5或荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）检测法6。这些方法可在单个孔中实现对单一底物特异性的检测。在本研究中，我们在不同条件下检测组织提取物中的蛋白酶特异性，因为这些提取物含有多种蛋白酶。蛋白酶活性受多种因素调控，包括 pH、辅酶、辅基和离子强度。近年来，基于蛋白质组学的方法已被用于鉴定蛋白酶特异性；例如，Biniossek et al.7 报道的方法利用蛋白质组来确定粗提物中的底物特异性，并能够准确测定识别多个氨基酸序列的蛋白酶的切割活性8。然而，该方法不适用于大量样本的分析。相比之下，我们的方法可同时处理多个样本，并采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight, MALDI-TOF）质谱技术进行样本分析，从而实现对切割底物的快速、简便检测。
本文介绍了一种利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF质谱）测定特异性底物分子量来评估蛋白酶特异性的方法。被切割底物的分子形式及其理论分子量如图1和Table 1所示。以往的研究使用了含有聚甘氨酸间隔序列和生物素的底物9；然而，这些底物存在缺陷，因为聚甘氨酸序列可能被识别甘氨酸序列的酶切割。此外，亲和素与生物素之间的高亲和力可能导致回收率较低。为了克服这些缺点，本研究合成了一种独特的底物，该底物由聚乙二醇（PEG）、亚氨基生物素以及一个可识别切割位点的氨基酸组成（图1）。为了区分分子量相近的氨基酸，在PEG间隔序列与切割位点的氨基酸之间加入了D-丝氨酸。
底物的N端用亚氨基生物素（iminobiotin）标记，从而能够从粗提样品中进行亲和纯化。使用亚氨基生物素而非生物素至关重要，因为生物素与亲和素（avidin）具有极强的结合力，导致生物素标记底物在亲和素树脂上的回收率较低；而亚氨基生物素与亲和素的结合能力可随pH变化而调节。在pH高于9的条件下，亚氨基生物素标记的底物可与亲和素结合；而在pH低于4的条件下，亲和素会释放亚氨基生物素标记的底物。因此，本研究采用亚氨基生物素进行亲和纯化10。综上所述，本文描述了一种利用特异性底物检测蛋白酶特异性的详细实验方案。

<table><tbody><tr><td>Fmoc-NH-SAL 树脂（-[2,4-二甲氧基苯基-N-(9-芴甲氧羰基)&lt;br/&gt;氨甲基]苯氧基树脂）</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00102</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00185</td><td></td></tr><tr><td>哌啶</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00176</td><td></td></tr><tr><td>三硝基苯磺酸（TNBS）</td><td>WAKO Chemical</td><td>209-1483</td><td></td></tr><tr><td>O-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HCTU）</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00067</td><td></td></tr><tr><td>1-羟基-1H-苯并三唑一水合物（HOBt）</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00014</td><td></td></tr><tr><td>二异丙基乙胺（DIPEA）</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00030</td><td></td></tr><tr><td>三异丙基硅烷（TIS）</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00170</td><td></td></tr><tr><td>乙二硫醇（EDT）</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00057</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Millipore</td><td>S6612278 403</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>国産化学（Kokusan Chemical）</td><td>2153025</td><td></td></tr><tr><td>C18固相萃取小柱</td><td>Waters</td><td>WAT051910</td><td></td></tr><tr><td>聚氧乙烯辛基苯基醚</td><td>WAKO Chemical</td><td>168-11805</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>混合型匀浆器</td><td>Kinematica</td><td>PT3100</td><td>polytron匀浆器</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝G-250（CBB-G250）</td><td>中和化学（Nakarai Chemical）</td><td>094-09</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>中和化学（Nakarai Chemical）</td><td>170-18</td><td></td></tr><tr><td>N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）-胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>WAKO Chemical</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素琼脂糖</td><td>GE Healthcare</td><td>17-511-01</td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2020</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF质谱分析</td><td>Bruker Daltonics, Germany</td><td>autoflex</td><td></td></tr><tr><td>2-亚氨基生物素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4632</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-氨基酸</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定小鼠组织提取物中蛋白酶特异性的方法：调控ph值以诱导特异性改变

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

蛋白酶具有多种生物学功能，包括蛋白质的激活/失活以及食物消化。确定蛋白酶的特异性对于揭示其功能至关重要。本研究提出的方法通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法测定特异性底物的分子量，从而确定蛋白酶的特异性。该底物包含氨基生物素，其被切割位点由氨基酸组成，间隔序列由聚乙二醇构成。当底物被特定氨基酸残基切割后，将产生具有独特分子量的片段。该方法的优点之一是可在单个反应体系中直接使用粗提样品，并适用于多个样品的并行分析。本文描述了一种经过优化的简易实验方法，所用样品提取自小鼠肺组织，包括组织提取、将消化底物加入样品、在不同pH条件下纯化消化后的底物，以及利用MALDI-TOF质谱法测定底物分子量。总之，该技术可利用MALDI-TOF质谱法在组织粗提物中鉴定蛋白酶的特异性，且易于扩展用于高通量的多样品处理。

利用模式蛋白酶评估蛋白酶特异性鉴定方法
通过使用底物特异性已知的 TPCK-胰蛋白酶和 V8 蛋白酶，对该系统的效率进行了评估。TPCK-胰蛋白酶和 V8 蛋白酶分别预计在赖氨酸和精氨酸残基的羧基端，以及天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基侧切割氨基酸序列。表 1 显示了由特定蛋白酶切割的底物及其消化片段的理论分子量。使用 TPCK-胰蛋白酶对底物进行消化后产生了可检测的片段，其中两个片段的分子量分别为 839.81 Da 和 796.76 Da（图 2A）。这些片段的分子量与分别从赖氨酸和精氨酸残基羧基端切割产生的片段的理论分子量高度一致。此外，V8 蛋白酶将前体底物转化为其切割产物，分子量分别为 769.78 Da 和 755.62 Da（图 2B），与谷氨酸和天冬氨酸残基的理论 m/z 值相符。这些结果表明，该...

本文介绍了一种利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF）测定粗鼠组织提取物中蛋白酶特异性的实验方案。

通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定小鼠组织提取物中蛋白酶特异性的方法：调控pH值以诱导特异性改变

蛋白酶具有多种生物学功能，包括蛋白质的激活/失活以及食物消化。鉴定蛋白酶的特异性具有重要意义……

本实验的总体目标是确定多种粗提物中的蛋白酶特异性。该方法有助于回答关键问题，以确定蛋白酶的特异性。该技术的主要优势在于，能够同时鉴定多个样品的蛋白酶特异性。将从雄性ICR小鼠获取的肺组织样本置于冰上冷却。在搅拌器中以20,000 RMP均质化30秒。重复此步骤，直至样本完全均匀。为避免温度升高，匀浆时间不得超过连续一分钟。取1,000微升匀浆液转移至1.5毫升离心管中，在4摄氏度条件下以10,000 × g离心5分钟。将500微升上清液转移至新的1.5毫升塑料离心管中。使用 10 微升样品测定蛋白质浓度。可采用双辛可宁酸法（bicinchoninic acid assay）或 Bradford 法。为防止冻结，向样品中加入 80% 甘油，使甘油的终浓度为 50%。为了阐明蛋白酶特异性在不同 pH 条件下的差异，使用 pH 为 3、5、7 和 9 的消化缓冲液。在 890 微升消化缓冲液中，加入 10 微升浓度为 0.1 微克/微升的 TPCK 胰蛋白酶、0.1 微克/微升的金黄色葡萄球菌 V8 蛋白酶，或 10 微克/微升的组织提取物。通过将组织提取物中的蛋白酶在沸水中孵育 10 分钟使其失活，制备阴性对照。接下来，向样品中加入10 µL MNO生物素标记底物，在37°C下孵育3小时以进行消化。孵育结束后，将样品置于沸水中加热10分钟以终止底物消化反应。随后在4°C、10,000 ×g条件下离心5分钟，收集消化后的底物。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中。加入50毫升含0.1%聚氧乙烯辛基苯基醚的1摩尔Tris缓冲液中的50%链霉亲和素Sepharose微珠。使用pH试纸检测，确保溶液pH值约为9。调节至合适的 pH 值至 9 或更高非常重要。只有在 pH 值为 9 或更高时，氨基生物素才能与珠粒结合。如果溶液的 pH 值较低，可通过加入更多缓冲液将其调节至约 pH 9。如有需要，可加入 1 M Tris 缓冲液以调节 pH 值。将悬浮液在 4°C 条件下于旋转摇床上持续温和混匀孵育过夜，使 MNO 生物素标记的底物与链霉亲和素结合。孵育过程中，磁珠应始终保持悬浮状态。第二天，在 4°C 条件下以 10,000 × g 离心样品 1 分钟。去除上清液后，加入 1,000 µL 洗涤缓冲液洗涤磁珠。然后在 4°C 条件下于旋转仪上持续轻柔混匀孵育 10 分钟。在4°C条件下，以10,000 × g离心珠子1分钟。弃去上清液，并重复此洗涤步骤四次。接着，向珠子中加入100微升0.2%三氟乙酸。使用 pH 试纸确保溶液的 pH 值低于 2。如果溶液的 pH 值较高，通过加入 1% 三氟乙酸将 pH 值调节至 2 以下。将悬浮液在室温下孵育 30 分钟，并在旋转轮上持续轻柔混合。按照之前的方法离心磁珠后，将上清液转移至新的1.5毫升离心管中。用移液器吸取20微升乙腈加入C18树脂以活化树脂。去除使用过的乙腈，并重复此活化步骤三次。然后，用 20 微升 0.1% 三氟乙酸平衡 C18 树脂。去除洗脱液，并重复此平衡步骤三次。加载样品时，使用移液器将样品与树脂结合。用20微升0.1%三氟乙酸洗涤树脂。重复此步骤五次。用3微升含0.1%三氟乙酸的60%乙腈溶液洗脱样品。将洗脱液移取至用于MALDI-TOF质谱分析的目标板上。立即加入CHCA溶液，该溶液为在含0.1%三氟乙酸的50%乙腈中饱和的溶液。通过空气干燥使混合物结晶。根据仪器制造商的方案获取样品的质谱数据，特别关注700至900道尔顿范围内生物素标记底物裂解形式的质谱信号。此处展示了合成底物的质谱图。在850至1,050范围内检测到对应于前体分子量的峰。切割后的片段在700至850范围内被检测到。图中显示的是经TPCK胰蛋白酶处理的MNO生物素标记底物的质谱图。839.81道尔顿和796.76道尔顿的峰分别对应于从赖氨酸和精氨酸的C末端切割产生的片段。图中显示了经V8蛋白酶消化的合成底物的质谱图。769.78 道尔顿和 755.62 道尔顿的峰分别对应于从谷氨酸和天冬氨酸的C末端切割产生的片段。此处展示了在不同pH条件下，用肺组织提取物处理的MNO生物素标记底物的质谱图。在酸性条件（pH 5）下，切割片段的分子量为 770.13 道尔顿和 826.66 道尔顿，表明切割发生在谷氨酸和色氨酸的 C 末端。在中性和碱性条件（pH 7 和 pH 9）下，切割片段的分子量在 767 道尔顿和 840 道尔顿处出现峰值，表明切割发生在精氨酸和赖氨酸的 C 末端。相反，谷氨酸和色氨酸的峰强则降低。此外，该方法无法检测经失活提取物处理的裂解片段。只要操作得当，除底物合成外，掌握该技术后可在两天内完成。另外，一旦底物合成完成，便可用于多个样品的测定。为什么？进行该实验操作时，重要的是要记住在缓冲液 pH 值约为 9 的条件下进行。通常，这是亲和素氨基与生物素形成复合物的反应。按照本方法，可通过进行化学发光检测（CMS）来定量酶活性。该方法将使蛋白质组学领域的研究人员能够探索在多种条件下蛋白酶的表达，从而为相关研究开辟道路。

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