Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

这种 CDNA 文库制备的总体目标是能够对储存在正式和固定石蜡包埋组织中的小 RNA 进行成功测序。该方法对于分析正式和固定石蜡包埋的标本非常有用。您可以从多达 18 个样本中提取 RNA，分析所有这些样本的含量，并获得所有样本的所有 microRNase 图谱。

要开始该方案，将 8.5 微升先前制备的连接预混液添加到 18 个单独等分的 FFPERNA 样品中。轻轻弹动试管，然后离心 2 秒钟。离心后，将试管存放在冰上。

使用 3 μL 移液器将每个接头的 1 μL 转移到含有 RNA 和连接预混液的相应 FFPERNA 样品中。不要上下移液，并在 FFPERNA 样品之间更换吸头。关闭每根试管，轻弹混合，然后离心 2 秒钟。

将试管放在冰上。将试管放在 90 摄氏度的加热块上 1 分钟，然后立即将它们放在冰上，使反应变性。接下来，使用 3 微升移液器将 1 微升稀释的连接酶转移到 18 个 RNA 样品中。

将连接物放在冰上，并将它们置于 4 摄氏度的冷藏室中孵育 18 小时。将试管放在 90 摄氏度的加热块上 1 分钟以停用连接反应，然后将它们放回冰中至少两分钟以冷却。将 1.2 μL 沉淀预混液转移到每管中。

加入 63 微升 100% 乙醇。关闭每根试管，轻弹试管进行混合，然后离心 2 秒钟。将试管放在冰上。

将所有 18 个试管的内容物混合到一个 1.5 ml 硅化试管中，倒置 3 次以混合。将试管离心 2 秒钟，然后将它们放在冰上 60 分钟以沉淀。沉淀后，离心 1.5 mL 试管与混合连接。

接下来，用 1 毫升移液器吸头去除上清液，但在底部留下一些液体。倾斜试管，并使用 20 微升移液器去除剩余的上清液。用带有 10 微升尖端的巴斯德移液管真空吸取上清液，然后轻弹试管将 RNA 沉淀重悬于 20 微升不含 RNase 的水中。

加入 20 μL PAA 凝胶上样溶液以重悬 RNA。轻弹试管，在室温下离心试管 2 秒钟，然后将试管置于冰上。用新鲜的 0.5 XTBE 替换先前制备的凝胶装置的 0.5 XTBE，并将后者、大小标记和连接的 RNase 加载到凝胶中心，在两侧留出两个空孔。

然后运行凝胶。运行凝胶后，通过移除其中一个玻璃板来取消 15%页面。用 10 μL 荧光染料溶液和 25 mL0.5 XTBE 轻轻喷洒玻璃板上的凝胶，并在黑暗中平放 5 分钟。

将装有凝胶的玻璃放在蓝光透射仪上，并用尺子对齐 19 个核苷酸和 24 个核苷酸大小的标记物，以指导连接的小 RNA 的切除。然后，切除凝胶。将切除的凝胶放入 0.5 mL 管中，该管旨在将凝胶切片成碎片，并牢固地定位在 1.5 mL硅化微量离心管中。

在室温下以 16000 倍 G 离心凝胶 3 分钟。用 300 微升 400 毫摩尔氯化钠溶液重悬碎片化的凝胶。关闭试管，并用石蜡膜密封。

4 摄氏度的冷藏室中，在热混合器上以 1100 RPM 的转速搅拌内容物，进行过夜孵育。第二天，从热混合器中取出试管，并使用 1 毫升移液器将溶液转移到 5 微米滤管上，插入 1.5 毫升不含硅化 RNase 的收集管中。在室温下以 2300 倍 G 离心管 3 分钟。

弃去过滤管，向含有过滤溶液的收集管中加入 950 微升 100% 乙醇，倒置管混合。将试管离心 2 秒钟，然后将其置于冰上 60 分钟。然后，沉淀 RNA 沉淀。

接下来，打开盖子，用 1 毫升移液管小心地去除上清液，同时在底部留下一些液体，以干燥 RNA 沉淀。使用 20 微升移液器去除所有剩余的上清液，而无需接触沉淀。倾斜试管，使任何剩余的溶液移动到沉淀的另一侧。

使用巴斯德移液管吸出上清液并使用真空干燥沉淀。将 RNA 沉淀重悬于 5.6 μL 不含 RNase 的水中。将逆转录试剂在冰上解冻 15 分钟。

通过添加 3 μL 5X 缓冲液、4.2 μL 10X 二氧核苷酸三磷酸 （DNTP） 和 1.5 μL 二硫苏糖醇 （DTT） 来构建逆转录反应。轻轻弹动试管以混合反应物，然后离心 2 秒钟以收集溶液。反应在 90 摄氏度的加热块上整好 30 秒后，将其直接转移到 50 摄氏度的热混合器中 2 分钟以平衡温度。

0.75 μL 逆转录酶直接加入溶液中。轻轻轻弹混合，然后立即将试管放回热混合器上，在 50 摄氏度下放置 30 分钟。30 分钟后，将试管转移到 95 摄氏度的加热块中 1 分钟，以停止逆转录。

将 95 μL 不含 RNase 的水直接添加到逆转录中。轻弹试管混合，然后直接放在冰上 2 分钟。组装中试 PCR 反应并在热循环仪上设置两个 PCR 循环。

在热循环仪上设置中试 PCR 反应并启动文件 1。在文件 1 的末尾，使用 20 μL 移液器将 12 μL 从中导 PCR 反应转移到含有 3 μL 5X 凝胶上样染料的 1.5 mL 微量离心管中。通过上下移液混合。

并标记它 10 个周期。关闭中试 PCR 管并在热循环仪上启动文件 2。在文件 2 的末尾，使用 20 μL 移液器将 12 μL 溶液转移到装有 3 μL 5X 凝胶上样染料的 1.5 mL 微量离心管中，并标记 12 个循环。

重复上述步骤，在 PCR 循环 14、16、18 和 20 从中试 PCR 反应中收集 12 μL PCR 产物。然后向 12 μL PCR 等分试样中的每一个中加入 3 μL 5X 凝胶上样染料，并向包含 3 μL 分子量标准和 9 μL 不含 RNase 的水的 20 核苷酸分子量标准中加入。在含有 0.5 XTBE 的琼脂糖凝胶上运行样品后，在 UV 盒上评估凝胶以确定最佳 PCR 循环。

然后设置用于琼脂糖凝胶文库纯化的大规模 PCR 反应。PCR 扩增后，将每个 PCR 管中的 9 μL 转移到 6 个 1.5 mL 微量离心管中，其中含有 3 μL 5X 凝胶上样染料。准备一个 20 个核苷酸的分子量标准。

将分子量标准、阴性 PCR 对照品和 6 个 PCR 产物上样到琼脂糖凝胶上，并在 120 伏特下电泳 30 分钟。验证 UV 盒上泳道之间 PCR 含义的一致性，并拍摄图像。将 3 次 PCR 反应合并到两个 1.5 mL 硅化微量离心管中，加入 27 μL 5 摩尔氯化钠和 950 μL 100% 乙醇。

倒置试管混合，并将其在 20 摄氏度下放置过夜以沉淀 PCR 产物。使用该方案，确定了两种新鲜冷冻肿瘤 RNA 与其特异性 FFPERNA 标本对应物之间的 micro RNA 表达相关性。匹配的新鲜冷冻 micro RNA 和 FFPE micro RNA 之间的曲线表明，CDNA 文库制备具有良好的可重复性，因为在不同处理的样本中检测到的 microRNA 之间存在高度相关性。

为了确定优化的 CNDA 文库制备方案是否适用于越来越老的 FFPE 标本且可重现，我们获得了存档 18 、 20 、 22 、 27 、 30 和 35 年的 FFPE 组织的 micro RNA 表达谱。无论标本的年龄或文库制备周如何，相关系数都保持在 0.96 以上。因此，优化的 CDNA 文库制备方案为 FFPE 标本的可重现分析提供了强大的工具，无论其存档时间如何。

因此，在观看此视频后，您应该对如何制备小 RNA 文库以及获得所有珍贵的正式和固定石蜡包埋标本的完整微表达谱有一个很好的了解。