Name: 回顾性 MicroRNA 排序: 用福尔马林固定石蜡嵌入 RNA 标本补充 DNA 文库制备协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学习从福尔马林固定石蜡包埋组织中制备cDNA文库并进行小RNA测序的方法。该方案可从保存长达35年的存档样本中提取microRNA，用于生物标志物发现和疾病机制研究。

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我们感谢RNA分子生物学实验室负责人Thomas Tuschl博士及其实验室成员的支持，感谢他们分享其实验室开发的技术，以及提供对RNAworld分析流程的访问权限。我们还感谢Markus Hafner博士分享其实验方案，并对其初始实验流程中使用的所有生物化学和酶学步骤提供了详尽的说明。

<ol><li>Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows.+Arch%22%5BJournal%5D)">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li>
<li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excavation+of+a+buried+treasure--DNA%2C+mRNA%2C+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed%2C+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li>
<li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues%3A+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).</li>
<li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li>
<li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li>
<li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517(2013).</li>
<li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393(2013).</li>
<li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li>
<li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR%3A+the+strengths+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li>
<li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li>
<li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144(2011).</li>
<li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li>
<li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%3A+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li>
<li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671346/">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li>
<li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+targets+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li>
<li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500(2011).</li>
<li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li>
<li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627(2017).</li>
<li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+DNA%2FRNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs%2C+mRNAs%2C+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683(2012).</li>
<li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li>
<li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing%2C+selection%2C+extension+and+ligation+platform%3A+assessing+its+performance+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li>
</ol>

作者希望声明，包含本文所呈部分数据的一篇论文已由 Loudig et al.21 发表于《国际分子科学杂志》。

本方案介绍了一种高度可重复且稳健的cDNA文库构建方法，用于对存档于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本中的小RNA进行高通量测序（NGS），该方法是在Hafner et al.22所述方法基础上改进和优化的版本。
本方案的所有步骤均已针对从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中提取的陈旧、降解的总RNA进行优化。该方案处理少量FFPE来源RNA的关键步骤在于将所有RNA样本合并即在使用18种独特的3'端条形码接头对18个独立的100 ng FFPE RNA样本分别进行连接后，该关键步骤使得这18个FFPE RNA样本能够均一地经历小RNA cDNA文库构建所需的全部后续生化与酶促反应。此外，该步骤通过增强小RNA分子的载体效应以及便于观察沉淀物和凝胶筛选，最大限度地提高了在沉淀和凝胶纯化过程中参与反应的RNA量。本方案的另一重要特征是采用预实验PCR反应以确定cDNA文库的最佳扩增循环数，进一步凸显了该方法在处理微量FFPE RNA样本时的灵活性。此步骤还可揭示文库扩增与引物二聚体扩增之间的...

miRNA 在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本中保存极为完好1,2,3先前的研究表明，利用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本的总RNA可有效检测这些短链调控性非编码单链RNA分子的表达水平，并且与原始新鲜组织相比，能够提供具有相关性的基因表达数据4,5,6,7,8与大片段信使RNA相比，后者已被证实会受到福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织处理过程（甲醛、加热、干燥）的显著影响 等等。），内源性RNase以及样本保存时间的影响，miRNA分子较小（约18–24个核苷酸）的特性使其对降解具有较强抵抗力，并能耐受长期储存。这一优势已在存档样本的研究中得到证实，miRNA表达分析的表现优于高通量mRNA分析。9使用存档临床样本进行的miRNA表达研究大多为小规模分析，结果表明，在对这些检测方法进行优化后，可采用单重或多重定量PCR检测、不同类型的微阵列技术，以及最近应用的NGS来评估保存miRNA的表达水平10,11,12,13,14.
鉴于miRNA表达失调与多种人类恶性肿瘤的发生发展相关，且临床上存在大量带有注释信息的存档样本，这些小RNA分子已成为极具潜力的癌症生物标志物来源15,16,17,18。与PCR和/或微阵列等靶向技术相比，采用高通量基因表达技术（如NGS）的优势在于能够对所有miRNA转录本进行全局性评估19。因此，为支持大规模回顾性研究，已优化出一种适用于陈旧存档样本中小RNA的cDNA文库构建方案，该方法经济实惠且易于应用20。
我们此前建立了一种可同时提取RNA和DNA的实验方案，能够分别从较陈旧的存档样本中回收RNA和DNA，其效果优于当前的商业试剂盒21。利用该提取方法，为从长期存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中获得总RNA，我们优化了用于高通量测序（NGS）的cDNA文库构建流程，以检测在临床样本中保存长达35年的miRNA。此外，在最近发表的一项研究中，我们从经临床分类的导管原位癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）样本中构建了cDNA文库，鉴定出差异表达的miRNA，并通过定量PCR进行了验证。结果表明，相较于未发展为乳腺癌患者的DCIS病灶，发展为乳腺癌患者的DCIS病灶中可能存在特定的miRNA表达变化，且此类变化可被检测到。
考虑到商业小RNA cDNA文库制备试剂盒的成本、可能停产的风险，以及其中受版权或专利保护而无法优化的试剂，我们决定改进一种此前发表的、基于实验室且无需试剂盒的3'端条形码cDNA文库制备方案，用于对存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中的小RNA进行高通量测序，从而实现18个样本的并行分析22本方案提供了一套理想且可靠的分步操作流程，包含可视化和技术评估检查点，这对于适应福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本至关重要，并具有广泛应用于其他降解或难于使用的RNA材料来源的潜力。通过以荧光标记替代原方案中的放射性标记分子量标准，显著提升了原方案的适用性。例如，SYBR Gold）在大孔聚丙烯酰胺凝胶上筛选连接文库时所用的可检测RNA大小标记物。该优化方案依赖于将3'端条形码接头连接至18个独立的FFPE RNA样本，随后将这些样本混合，进行5'端接头连接、逆转录以及小规模PCR分析，以针对最终cDNA文库进行定制化扩增，再进行大规模PCR扩增、纯化，并在高通量测序仪上进行NGS分析。

<table><tbody><tr><td>1% Triton x-100</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>10 mM ATP</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10X dNTPs</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>14M 巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>O3445I-100</td><td></td></tr><tr><td>20 nt DNA 标准分子量标记物</td><td>Jena Bioscience</td><td>M-232S</td><td></td></tr><tr><td>20 mg/ml 牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>B8894-5ML</td><td></td></tr><tr><td>50X Titanium Taq</td><td>Clontech Laboratories</td><td>639208</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>BRL 垂直凝胶电泳系统（含玻璃板和梳子）</td><td>GIBCO</td><td>V16</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D9170-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 微型离心机 5424R</td><td>USA scientific</td><td>4054-4537Q</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 恒温混匀仪</td><td>USA scientific</td><td>4053-8223Q</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;trade; 硅化低吸附微型离心管 1.5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 凝胶破碎管</td><td>IST Engineering Inc,</td><td>3388-100</td><td></td></tr><tr><td>7 cm × 10 cm 小型凝胶电泳装置 Mini-sub Cell GT（含凝胶托盘和梳子）</td><td>Biorad</td><td>1704446</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Jersey-Cote</td><td>LabScientific, Inc</td><td>1188</td><td></td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl₂</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge 双转子个人离心机</td><td>USA scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Model V16 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置（含玻璃板、梳子和垫片）</td><td>Ciore Life Science</td><td>21070010</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸</td><td>IDT</td><td>订购时确定序列</td><td></td></tr><tr><td>Owl EasyCast B2 小型电泳系统（含凝胶托盘和梳子）</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶 PmeI</td><td>NEB</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>无RNase水</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 蓝光透射仪</td><td>Thermofisher</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE 琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50002</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III 反转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA 连接酶 1</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA 连接酶 2 截短型 K227Q</td><td>NEB</td><td>0351L</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>带加热盖的PCR仪</td><td>Applied Biosystem</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris，pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris，pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Sequagel 系统浓缩液、稀释液和缓冲液</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td></td></tr></tbody></table>

回顾性 microrna 测序：使用福尔马林固定石蜡包埋 rna 标本的互补 dna 文库制备方案

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

——存档的、经临床分类的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织可为癌症发生发展的回顾性分子研究提供核酸。通过分析那些后续发展为侵袭性疾病的患者所采集的非侵袭性或癌前病变组织，基因表达分析可能有助于识别出易感癌症风险的早期分子改变。已有充分报道指出，从 FFPE 组织中提取的核酸经历了严重的物理损伤和化学修饰，导致其分析困难，通常需要采用经过优化的检测方法。然而，微小 RNA（miRNA）是一类长度仅约 18–24 个核苷酸的小 RNA 分子，已被证明能够耐受长期储存，并已在 FFPE 样本中成功实现分析。本文介绍一种专为从存档组织中提取的小 RNA 分析而优化的 3' 端条形码互补 DNA（cDNA）文库构建方案，该方法在使用储存时间长达 35 年的存档临床样本时，已被证明具有良好的稳健性和高度可重复性。该文库构建方法适用于降解或质量较差样本的多重分析：可将最多 18 个 RNA 样本分别连接带有独特 3' 端条形码的接头，随后合并进行后续的酶学和生化处理，再进入分析流程。所有纯化步骤均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）完成，从而实现对条形码标记的小 RNA 物种进行特异性大小筛选和富集。该 cDNA 文库构建方法适用于极微量的 RNA 起始量，通过预实验聚合酶链式反应（PCR）可确定最佳扩增循环数，以获得适用于下一代测序（NGS）的适量产物。该方法针对储存时间长达 35 年的 FFPE 降解 RNA 进行了优化，可提供高度可重复的 NGS 数据。

如本方法所述，将总共18份独立的FFPE RNA样本（每份100 ng）分别置于不同的离心管中，进行3'端腺苷酸化条形码寡核苷酸的T4连接酶过夜连接反应。次日，将酶促反应通过加热灭活后合并，并在单个离心管中进行沉淀。将RNA沉淀重悬，并在15%变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上分离连接后的RNA分子，通过PAGE凝胶相邻泳道中迁移的RNA寡核苷酸大小标记物，选择适当大小的3'端条形码小RNA（图2）。将切下的凝胶条置于NaCl溶液中过夜孵育，以洗脱连接的RNA分子。次日，对洗脱的RNA进行沉淀，并进行5'端接头连接反应。随后，将连接了5'端接头的小RNA分子在12%丙烯酰胺凝胶上电泳分离，此时再次利用迁移的RNA大小标记寡核苷酸，对同时含有3'端条形码寡核苷酸和5'端接头的小RNA进行按大小切胶回收（图3）。切下的凝胶条再次在NaCl溶液中过夜孵育，以实现RNA的洗脱。次日，将洗脱后的连接小RNA沉淀，将沉淀重悬于无RNase的水中，随后进行逆转录；取部分...

福尔马林固定石蜡包埋的标本是人类疾病分子生物标志物的重要来源。本文介绍一种基于实验室的cDNA文库构建方案，该方案最初针对新鲜冷冻RNA设计，并已优化用于分析储存时间长达35年的组织中存档的微小RNA（microRNA）。

回顾性 microRNA 测序：使用福尔马林固定石蜡包埋 RNA 标本的互补 DNA 文库制备方案

- 归档的、经临床分类的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织可为回顾性分子研究提供核酸……

构建cDNA文库的总体目标是实现对保存在福尔马林固定石蜡包埋组织中的小RNA进行成功测序。该方法对于分析福尔马林固定石蜡包埋样本非常有用。您可以从最多18个样本中提取RNA，分析所有这些样本的内容，并获得所有样本中全部微小RNA的表达谱。开始实验方案时，向18份预先分装好的FFPERNA样品中每份加入8.5微升预先配制好的连接反应主混合液。轻轻弹击离心管，短暂离心两秒。离心后，将离心管置于冰上保存。使用三微升移液器将每种接头各一微升转移至含有 RNA 和连接主混合液的相应 FFPERNA 样品中。不要反复吹打，且在不同 FFPERNA 样品之间需更换吸头。盖紧每个管子，轻轻弹动以混匀，并离心两秒钟。将离心管置于冰上。将离心管放入90摄氏度的加热块中孵育1分钟以使反应变性，然后立即放回冰上。接着，使用3微升移液器将1微升稀释后的连接酶转移至18个RNA样品中的每一个样品中。将连接反应置于冰上，然后放入4摄氏度的冷室中，4℃过夜孵育18小时。将离心管置于加热块上，在90摄氏度加热1分钟以终止连接反应，随后放回冰上冷却至少2分钟。向每个离心管中加入1.2 µL的沉淀预混液。加入 63 µL 的 100% 乙醇。盖紧各管，轻轻弹动试管以混匀，然后离心两秒钟。将试管置于冰上。将全部18个管中的内容物合并至一个1.5毫升硅化管中，轻轻颠倒混匀三次。离心2秒后，置于冰上60分钟以沉淀。沉淀完成后，对含有混合连接产物的1.5毫升管进行离心。接下来，使用1毫升移液枪头吸走上清液，但底部需留少量液体。倾斜离心管，用20微升移液枪吸除剩余的上清液。再用带有10微升枪头的巴氏移液管通过真空抽吸除去上清液，然后通过轻弹离心管，将RNA沉淀重悬于20微升无RNase的水中。加入 20 微升 PAA 上样缓冲液以重悬 RNA。轻弹离心管，于室温下离心 2 秒，然后将离心管置于冰上。将凝胶装置中先前配制的 0.5 XTBE 更换为新鲜的 0.5 XTBE，并将重悬产物、分子量标记物以及连接后的 RNase 加样至凝胶中央，两侧各留两个空孔。然后运行凝胶电泳。电泳结束后，通过移除其中一块玻璃板来卸下15% PAGE凝胶。将留在玻璃板上的凝胶用10 µL荧光染料溶液和25 mL 0.5× TBE轻轻喷洒，置于黑暗处静置5分钟。将带有凝胶的玻璃板置于蓝光透射仪上，使用尺子对齐19个核苷酸和24个核苷酸的大小标记，以准确定位连接的小RNA片段并进行切胶。随后，切下目标凝胶区域，并将切下的凝胶置于专用于破碎凝胶片的0.5毫升离心管中，再将该管牢固地插入1.5毫升硅化微量离心管内。在室温下，以16,000 ×g离心凝胶3分钟。用300微升400毫摩尔氯化钠溶液重悬碎片化凝胶。盖紧管盖，并用石蜡膜密封。将内容置于4 °C冷室中，以1100 rpm在恒温混匀仪上振荡过夜孵育。次日，从恒温混匀仪中取出离心管，使用1 mL移液器将溶液转移至插入1.5 mL硅化无RNase收集管中的5 µm滤膜管。在室温下以2300 ×g离心3分钟。弃去滤管，向含有滤液的收集管中加入 950 微升 100% 乙醇，倒置混匀。离心 2 秒，将管置于冰上 60 分钟。然后沉淀 RNA 粒状物。接下来，打开管盖，用1 mL移液器小心吸除上清液，底部留少量液体。使用20 µL移液器将剩余的上清液完全吸除，注意不要触碰沉淀。倾斜离心管，使残留的液体移至沉淀的对侧。使用巴斯德移液管吸除上清液，并用真空泵干燥沉淀。将RNA沉淀重悬于5.6 µL无RNase的水中。将逆转录试剂在冰上解冻15分钟。加入3微升5X缓冲液、4.2微升10X脱氧核苷三磷酸（dioxynucleotide triphosphate，DNTPs）和1.5微升二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）以建立反转录反应体系。轻轻弹击离心管以混匀反应液，离心2秒使溶液沉降至管底。将反应体系置于90摄氏度金属浴中精确加热30秒后，立即转移至50摄氏度恒温混匀仪中孵育2分钟，以平衡温度。将0.75 µL逆转录酶直接加入溶液中。轻轻振荡混匀，立即将离心管放回50 °C的恒温混匀仪中反应30分钟。30分钟后，将离心管转移至95 °C的加热块中加热1分钟，以终止逆转录反应。向逆转录反应中直接加入95微升无RNase的水。轻轻弹击离心管以混匀，然后立即置于冰上孵育2分钟。配制初步PCR反应体系，并在热循环仪上设置两个PCR循环。在热循环仪上设置预实验PCR反应并启动程序一。程序一结束后，使用20微升移液器将12微升预实验PCR反应产物转移至含有3微升5X凝胶上样缓冲液的1.5毫升微量离心管中。通过上下吹打混匀。并标记为10个循环。关闭试点PCR管，然后在热循环仪上启动程序二。程序二结束后，使用20微升移液器将12微升溶液转移至含有3微升5X凝胶上样染料的1.5毫升微量离心管中，并标记为12个循环。重复上述步骤，从第14、16、18和20个PCR循环的预实验PCR反应中分别收集12微升PCR产物。然后向每个12微升的PCR等分试样中加入3微升5X凝胶上样染料，同时向含有3微升分子量标记物和9微升无RNase水的20碱基对分子量标记物中也加入3微升5X染料。将样品在含有0.5 XTBE的琼脂糖凝胶上电泳后，置于紫外灯箱中观察凝胶，以确定最佳PCR循环数。然后为琼脂糖凝胶文库纯化设置大规模PCR反应。PCR扩增后，从每个PCR管中转移九微升至六个含有三微升5X上样缓冲液的1.5毫升微量离心管中。制备一个20个核苷酸的DNA标记物。将DNA分子量标记、阴性PCR对照以及六个PCR产物上样至琼脂糖凝胶中，在120伏电压下电泳运行30分钟。在紫外成像仪中观察各泳道PCR扩增产物的均一性，并拍照记录。将三管PCR反应产物合并至两支1.5毫升硅化微量离心管中，每管加入27微升5摩尔/升氯化钠溶液和950微升100%乙醇。将试管倒置混匀，于20摄氏度放置过夜，以沉淀PCR产物。根据该方案，确定了两份新鲜冷冻肿瘤RNA与其相应的特异性FFPE RNA样本之间的微小RNA（micro RNA）表达相关性。配对的新鲜冷冻样本与FFPE样本的微小RNA对比图显示，cDNA文库制备具有良好的可重复性，因为在不同处理方式制备的样本中检测到的微小RNA之间具有高度相关性。为了确定优化的cDNA文库制备方案是否适用于且可重复地用于年代日益久远的FFPE样本，获取了分别存档18、20、22、27、30和35年的FFPE组织的微小RNA表达谱。无论样本的保存年限或文库制备周次如何，其相关系数均保持在0.96以上。因此，优化后的cDNA文库制备方案为FFPE样本的可重复性分析提供了一种可靠的工具，不受其存档时间的影响。因此，在观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备小RNA文库，并获得所有珍贵的福尔马林固定及石蜡包埋样本的完整微小RNA表达谱。

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遗传学

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