Name: MicroRNA 移植成人骨髓造血干细胞促进细胞工程与磁性靶向结合的协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学习使用非病毒磁性多聚物转染技术对CD133+造血干细胞进行基因修饰的方法。该技术可在保留细胞特性的同时实现高效microRNA导入，并支持磁共振成像监测，为再生医学研究提供安全可靠的细胞工程方案。

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本工作由德国联邦教育与研究部（FKZ 0312138A 和 FKZ 316159）、梅克伦堡-前波美拉尼亚州政府及欧盟结构基金（ESF/IVWM-B34-0030/10 和 ESF/IVBM-B35-0010/12）、德国研究基金会（DFG，项目号 DA1296/2-1）、德国心脏基金会（F/01/12）、联邦教育与研究部（BMBF，项目号 VIP+ 00240）以及 DAMP 基金会资助。此外，F.H. 和 P.M. 还获得罗斯托克大学医学中心 FORUN 项目（889001）的支持。

用于细胞分离的胸骨人类骨髓取自知情捐赠者，这些捐赠者已签署书面同意书，同意根据《赫尔辛基宣言》将其样本用于科研。罗斯托克大学伦理委员会已批准本研究（注册编号：A 2010 23，2015年延期）。
1. 细胞制备
注意：使用肝素钠（250 IU/mL BM）以防止骨髓检查时发生凝血。
<ol>
	<li>CD133+ SC 分离
	<ol>
		<li>所需溶液的配制
		<ol>
			<li>配制磷酸盐缓冲液（PBS）/乙二胺四乙酸（EDTA）储存液（2 mM）：将996 mL的1×PBS与4 mL的EDTA（0.5 M）混合。充分混匀后，使用滤膜过滤溶液 0.45 µm 滤膜。室温（RT）保存。</li>
			<li>通过将995 mL的2 mM PBS/EDTA与5 g牛血清白蛋白（BSA）混合制备MACS缓冲液。充分混匀溶液，并使用滤器过滤 0.45 µm 滤器。储存于 4 °C.</li>
			<li>通过将500 mg胶原酶B（来自 Clostridium histolyticum) 加入 12.5 mL PBS 中，充分混匀，分装成等量 aliquot 350 µL，并于 -20 °C.</li>
			<li>制备脱氧核糖核酸酶（DNAse）I 储存液（10 mg/mL），将 100 mg 牛胰来源的 DNase I 溶于 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。充分混匀溶液，分装成若干等份 350 µL，并在 -20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>人骨髓的酶消化
		<ol>
			<li>将人淋巴细胞培养基预热至室温，并解冻酶溶液（每20 mL骨髓样本使用一份数量的胶原酶B和DNA酶）。</li>
			<li>将骨髓从注射器中收集到50 mL锥形管中，轻轻混匀。弃去任何已形成的凝块。 
			注意：转移 200 µL 将未稀释的骨髓液转移至1.5 mL离心管中，用于后续流式细胞术分析。储存于 4 °C 直至使用。</li>
			<li>将10 mL BM转移至新的50 mL锥形管中，加入6 mL PBS/EDTA（2 mM）和20 mL人淋巴细胞培养基， 175 µL 胶原酶B（40 mg/mL）以及 175 µL DNase I（10 mg/mL）。轻轻混匀溶液，在摇床中室温孵育30分钟。对剩余的骨髓样本重复此步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>密度梯度离心
		<ol>
			<li>用移液器将15 mL人淋巴细胞分离液加入一支50 mL密度梯度离心管中进行预处理。在1,000 x g 30 秒。</li>
			<li>小心地将35 mL稀释后的骨髓液加至密度梯度离心管滤膜上方，于445 x g条件下离心 g 室温下孵育35分钟。 
			注意：离心机设置为低加速度（3）且无刹车（1）。</li>
			<li>从离心机中小心取出离心管，避免振荡。小心弃去上层清液约 20 mL，注意不要触碰滤膜上方的浑浊层。</li>
			<li>小心地将浑浊层（位于滤膜正上方，含有单个核细胞（MNCs））转移至新的50 mL锥形管中，并用PBS/EDTA补至终体积50 mL。 
			注意：将一名骨髓（BM）患者样本中的所有单个核细胞（MNCs）合并至一个新离心管中。</li>
			<li>通过转移计数单个核细胞 10 µL 将50 mL细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。加入 10 µL 用3%乙酸与亚甲蓝混合液轻轻混匀并涂抹 10 µL 加入计数室。计算单个核细胞（MNC）的数量。</li>
			<li>将单个核细胞悬液在300 x g条件下离心 g 10 分钟后弃去上清液。 
			注意：离心期间，将离心机温度从室温降至 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>CD133 磁珠分选+ 使用人CD133抗体偶联的超顺磁性铁葡聚糖颗粒的SCs 
		注意：此步骤需在冰上操作。将溶液保存于冰上直至使用。 4 °C将MACS永久磁铁、分离柱和预分离滤器储存于 4 °C.
		<ol>
			<li>选择色谱柱尺寸。对于 &lt;1.2 × 108 单核细胞（MNCs），使用磁珠分选柱（MS columns），并用于 &gt;1.2 × 108 单核细胞（MNCs），使用LS柱（参见 材料表).</li>
			<li>为1 × 10⁶细胞的磁珠分选做准备8 总细胞数，小心重悬单个核细胞（MNCs）于 300 µL MACS 缓冲液（4 °C）。加入 100 µL FcR封闭试剂（4 °C）和 100 µL CD133抗体偶联的超顺磁性铁葡聚糖颗粒（4 °C).</li>
			<li>轻轻混匀细胞悬液，并在30分钟内于37°C孵育 4 °C孵育期间轻轻振荡细胞悬液（2–3次）。</li>
			<li>加入 2 mL MACS 缓冲液（4 °C) 每 1 × 108 总单个核细胞。轻柔混匀细胞悬液，于300 x g离心 g 10 min 4 °C.</li>
			<li>设置 MACS 磁力架并安装 MACS 永久磁铁。安装 MACS 分离柱，并将预分离滤器置于其顶部。</li>
			<li>使用0.5 mL（MS）或3 mL（LS）MACS缓冲液平衡第一根MACS MS/LS柱和预分离滤器（4 °C). 
			注意：MACS 柱经平衡后，切勿使其干燥。</li>
			<li>弃去上清液，将所得沉淀重悬于 500 µL MACS缓冲液4 °C) 每 1 × 108 总细胞量。将细胞悬液加入预分离滤器中。</li>
			<li>使用MACS缓冲液对MACS柱和分离前滤器进行三次洗涤，每次洗涤使用0.5 mL（MS）或3 mL（LS）MACS缓冲液（4 °C). 
			注意：在第三次洗涤步骤期间，将第二个MACS柱安装到MACS永磁体中，并用0.5 mL（MS）或3 mL（LS）MACS缓冲液平衡第二个MACS MS/LS柱（4 °C).</li>
			<li>弃去预分离滤器。</li>
			<li>将细胞组分直接洗脱至第二个MACS柱上：加入1 mL（MS）或5 mL（LS）MACS缓冲液（4 °C) 上样至第一根MACS柱，并将MACS柱从MACS永磁体上取下。立即将第一根MACS柱移至第二根MACS柱上方，使用提供的推杆将细胞悬液通过MACS柱。</li>
			<li>用0.5 mL（MS）或3 mL（LS）MACS缓冲液洗涤MACS柱，共洗涤三次（4 °C).</li>
			<li>通过加入1 mL（MS）或5 mL（LS）MACS缓冲液从柱子中洗脱细胞组分（4 °C) 转移至第二个MACS柱，并将MACS柱从MACS永磁体上取下。立即将第二个MACS柱置于1.5 mL离心管（MS）或15 mL锥形管（LS）上方，使用配套推杆将细胞悬液推过MACS柱。</li>
			<li>300 x g 离心 g 10 分钟 4 °C小心弃去上清液，并将获得的沉淀重悬于 100 µL MACS 缓冲液4 °C).</li>
			<li>计数CD133+ 细胞：转移 6 µL 将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。加入 6 µL 0.4% 台盼蓝溶液。轻轻混匀并应用 10 µL 放入计数室。计算CD133的数量+ 细胞</li>
			<li>储存CD133+ 将细胞置于冰上直至接种。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CD133新鲜分离细胞的表征+ SCs 
	注意：以下操作应在避光环境（仅微弱光线）中进行。除非另有说明，所有离心管、缓冲液和抗体均需置于冰上保存。
	<ol>
		<li>用于流式细胞术分析的SCs制备
		<ol>
			<li>使用两个样本（每个 10 µL骨髓等分试样和一份 freshly isolated CD133 样本+ SCs（至少，1 x 104 细胞）用于分析。将细胞转移至1.5 mL离心管中。加入 10 µL FcR封闭试剂，并用MACS缓冲液定容至（4 °C) 至一体积 33 µL.</li>
			<li>将以下抗体分别加入相应试管的内侧（参见 表1：抗-CD34-异硫氰酸荧光素（FITC）（克隆：AC136），抗-CD133/2-藻红蛋白（PE）（克隆：293C3），同型对照小鼠IgG2b-PE，抗-CD45-别藻青蛋白（APC） (APC)-H7（克隆号：2D1）和7-氨基放线菌素（AAD）。所有抗体添加完毕后，轻弹管壁使抗体溶液集中于管底，轻轻混匀溶液（终体积 50 µL）并在该温度下孵育10分钟 4 °C.</li>
			<li>加入1 mL 1×红细胞（RBC）裂解缓冲液，轻轻混匀悬浮液，冰上孵育10 min。将悬浮液在300 x g 10 分钟 4 °C.</li>
			<li>弃去上清液，将所得沉淀重悬于 100 µL PBS（4 °C). 置于冰上保存，直至进行流式细胞术分析。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>CD133的流式细胞术分析+ SCs
		<ol>
			<li>为了检测CD133细胞的活力和纯度+ SC，采用改良的国际血液治疗与移植物工程学会（ISHAGE）流式细胞术设门策略41 （参见代表性示意图） 图1）。使用以下顺序： 
			步骤1：细胞群体的选择（图1A) 
			步骤2：CD45的筛选+ 细胞（图1B) 
			第3步：活CD45阳性细胞的筛选+ 细胞（图1C) 
			第4步：活CD45阳性细胞的筛选+/CD34+ 细胞（图1D) 
			第5步：活CD45阳性细胞的筛选+/CD34+/CD133+ 细胞（图1E) 
			运行流式细胞仪（参见 材料表按照制造商的说明进行操作。</li>
			<li>使用以下公式计算细胞活力和纯度：</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="细胞活力公式，活力 [%] = (有活力的 CD45+ 细胞 / CD45+ 细胞) × 100，方程。" src="/files/ftp_upload/57474/57474eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 1">   公式 1
<img alt="细胞分析纯度计算公式，细胞群体百分比计算公式，CD标志物。" src="/files/ftp_upload/57474/57474eq2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 2">   公式 2
<ol start="3">
	<li>新鲜分离的 CD133+ 造血干细胞的细胞培养
	<ol>
		<li>将100倍浓度的重组人细胞因子补充剂分装为每份100 µL，于-20 °C保存。在配制培养基前，取出一份100倍浓度的分装液进行解冻。</li>
		<li>配制CD133+ 造血干细胞培养基：无血清造血细胞扩增培养基，添加重组人细胞因子补充剂（终浓度为1倍）和1%青霉素/链霉素。</li>
		<li>在24孔板中，每孔加入500 µL培养基，接种5 × 104个新鲜分离的CD133+ 造血干细胞用于转染。将细胞置于37 °C、5% CO2 和20% O2 条件下培养。 
		注意：另设一组5 × 104个新鲜分离的CD133+ 造血干细胞作为对照，用于流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 转染复合物的制备
注意：在此步骤中，使用RNA酶去污染溶液保持整个工作区域无RNA酶（RNAse），并仅使用无RNA酶的一次性耗材。
<ol>
	<li>miR 的制备 
	注意：以下操作应在避光环境（仅微弱光照）中进行。 
	注意：对于 miR 样本：使用 Cy3 荧光素标记的前体 miR 和未标记的前体 miR。
	<ol>
		<li>配制 miR 储存液（50 µM），将所需量的 miR 溶解于适量无核酸酶水中（例如，将 5 nmol miR 溶于 100 µL 水中）。轻轻混匀溶液，分装 miR 储存液（每份 5 µL），并于 -20 °C 以下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PEI 的制备
	<ol>
		<li>按照标准操作流程制备 PEI，并记录 PEI 储存液浓度31,42。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MNP 的制备
	<ol>
		<li>按照标准操作流程制备 MNPs，并记录 MNP 储存液浓度31,42。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>miR/PEI 复合物的制备
	<ol>
		<li>将 D-(+)-葡萄糖溶于无核酸酶水中，配制 5% 葡萄糖溶液。轻轻混匀溶液，分装储存液（每份 1.5 mL），并于 4 °C 保存。 
		注意：以下操作应在避光环境（仅微弱光照）中进行。</li>
		<li>每孔 24 孔板使用 20 pmol miR30。将 miR 用 5% 葡萄糖溶液稀释至终浓度为 0.25 pmol miR/µL。</li>
		<li>根据 miR 用量（20 pmol，步骤 2.3.1）和最佳氮（PEI 中的 N）与磷酸根（miR 中的 P）摩尔比（N/P 比），结合 PEI 储存液浓度（步骤 2.2.1；本实验采用 7.5 的比例）30，计算所需 PEI 用量。根据以下公式，将 PEI 用等体积的 5% 葡萄糖溶液稀释： 
		<img alt="基因递送效率优化的 N/P 比公式；公式涉及 PEI 和 miR 浓度。" src="/files/ftp_upload/57474/57474eq3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 3"> 
		该公式可重排为： 
		<img alt="PEI 体积公式，数学方程，用于基因转染的生化计算。" src="/files/ftp_upload/57474/57474eq4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 4">    公式 3 
		其中 PEI 体积单位为 µL，[PEI] 单位为 mM，N/P 比（本方案已优化）为 0.75，0.12 是 miR 特有的换算系数。</li>
		<li>将预先稀释的 PEI 加入预先稀释的 miR 中，涡旋混匀 30 秒。</li>
		<li>将 miR/PEI 复合物在室温下孵育 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>miR/PEI/MNP 复合物的制备 
	注意：以下操作应在避光环境（仅微弱光照）中进行。
	<ol>
		<li>在孵育 miR/PEI 复合物的同时，将 MNPs 置于室温超声水浴中，以 35 kHz 超声处理 20 分钟，确保颗粒充分悬浮且不发生聚集。</li>
		<li>根据 MNP 储存液浓度（步骤 2.3.1），计算所需 MNPs 的数量（3 µg 铁/mL）。</li>
		<li>将超声处理后的 MNPs 加入 miR/PEI 复合物中，涡旋混匀 30 秒。将 miR/PEI/MNP 复合物在室温下孵育 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于 SIM 四色标记的转染复合物的制备 
	注意：使用未标记的前体 miR。
	<ol>
		<li>使用 Cy5 荧光素 miR 标记试剂盒（见材料表），按照制造商说明书对 miR 进行标记。使用所列分光光度计（见材料表），根据制造商提供的预设条件（核酸，RNA-40）测定最终 miR 浓度。分装 miR（每份 5 µL），避光保存于 -80 °C。</li>
		<li>使用合适的蛋白质标记试剂盒（见材料表），按照制造商说明书用强绿色荧光染料对 PEI 进行标记。通过茚三酮法（步骤 2.2.1）确定最终 PEI 浓度。将 PEI 分装（体积根据公式 3计算），避光保存于 4 °C。</li>
		<li>以 1:1,000（w/w，染料:MNP）的比例，使用与生物素偶联的罗丹明染料对 MNPs 进行标记。在 miR/PEI 复合物形成的同时，将罗丹明染料与 MNPs 混合，并在避光条件下孵育 30 分钟。标记后的 MNPs 可直接使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. CD133+ 干细胞的转染
注意：此步骤中，需使用RNA酶去污染溶液保持整个工作区域无RNA酶，并仅使用无RNA酶的一次性耗材。 
注意：以下操作应在避光房间内进行（仅使用昏暗照明）。
<ol>
	<li>将制备好的miRNA/PEI/MNP复合物逐滴直接加入含有 freshly isolated CD133+ SCs 的培养基的相应孔中。</li>
	<li>轻轻来回摇动培养板以混匀。将细胞在37 °C、5% CO2 和20% O2 条件下孵育18小时。</li>
</ol>
4. miR 转染的分析
<ol>
	<li>检测miR摄取效率及转染复合物的细胞毒性 
	注意：用于miR样本时，采用Cy3荧光标记的miR前体进行摄取评估，并以未转染的CD133+干细胞作为流式细胞术对照门控样本。 
	注意：以下操作应在避光环境中进行（仅保留弱光照明）。 
	注意：除非另有说明，所有离心管、缓冲液和抗体均需置于冰上保存。
	<ol>
		<li>通过将4 g多聚甲醛（PFA）溶于100 mL PBS中，并加热至80 °C，配制4% PFA储存液。充分搅拌溶液，并将pH值调节至7.3。分装PFA储存液（每份1.5 mL），于-20 °C保存。</li>
		<li>转染后18 h，将每孔细胞分别收集至1.5 mL离心管中。每孔用500 µL PBS洗涤一次，并将洗涤液转移至同一离心管中。</li>
		<li>在4 °C条件下以300 x g离心10 min。弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL、4 °C的MACS缓冲液中。</li>
		<li>加入0.5 µL胺反应性染料以区分活细胞与死细胞，轻轻混匀后于4 °C孵育10 min。加入1 mL（4 °C）PBS，于4 °C以300 x g离心10 min。</li>
		<li>弃去上清液，将所得沉淀重悬于100 µL PBS中，加入33 µL PFA（4%），冰上或4 °C保存，直至进行流式细胞术分析。</li>
		<li>根据图2所示代表性示意图设置门控策略。按照制造商说明，在流式细胞仪（见材料表）上运行样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>miR转染后CD133+干细胞的表征 
	注意：使用未标记的miR前体以及未转染的CD133+干细胞作为流式细胞术对照门控样本。
	<ol>
		<li>将每孔细胞分别收集至1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以300 x g离心10 min。</li>
		<li>采用步骤1.2中所述的门控策略。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用SIM技术检测转染复合物的细胞内分布
	<ol>
		<li>按照第2节和第3节所述方法制备复合物并进行细胞转染。</li>
		<li>转染后18 h，将每孔细胞分别收集至1.5 mL离心管中。每孔用500 µL PBS洗涤一次，将洗涤液转移至对应离心管中。在4 °C条件下以300 x g离心10 min。</li>
		<li>弃去上清液，将所得沉淀重悬于含2%胎牛血清（FBS）的1 mL PBS中，轻轻混匀后，在4 °C条件下以300 x g离心10 min。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL PBS中，加入33 µL PFA（4%），固定20 min。</li>
		<li>将细胞悬液转移至含有无菌玻璃盖玻片的新24孔培养板中，在4 °C条件下以300 x g离心10 min。</li>
		<li>弃去上清液，加入500 µL PBS，轻轻振荡培养板后弃去PBS。</li>
		<li>使用水性封片剂将制备好的盖玻片置于显微镜载玻片上，室温干燥至少1 h以保持荧光信号。</li>
		<li>使用100X油镜采集图像。SIM设置参数如下：激发波长为405、488、561和633 nm；z轴层扫深度为16位，每个角度采集3相位图像，平均次数为4；各激光线对应的光栅周期分别为：23 µm（405 nm）、34 µm（488 nm）、42 µm（561 nm）、51 µm（633 nm）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

近年来，CD133+ 干细胞（SCs）已成为基于干细胞治疗的一种有前景的细胞群体，这一点已得到多项 I 期、II 期和 III 期临床试验的支持43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54</sup...

CD133+ 间充质干细胞代表了一类具有再生医学应用前景的异质性干细胞与祖细胞群体。其具有造血、内皮和肌源性分化潜能1,2,3 能够实现CD133+ 细胞 例如通过分化为新生血管以及通过旁分泌机制激活促血管生成信号，参与血管新生过程4,5,6,7.
尽管在30多项已批准的临床试验（ClinicalTrails.gov）中显示出巨大的潜力，但其治疗效果仍存在争议4。事实上，干细胞（SCs）的临床应用受到其在靶器官中滞留率低和移植后大量细胞早期死亡的限制5,8,9。在移植前对CD133+干细胞进行额外的工程化改造，可能有助于克服这些挑战。
高效细胞治疗的一个先决条件是减少大量初始细胞死亡，以增强治疗相关细胞的植入效果10近期研究表明，在移植后的最初1—2小时内，无论移植细胞类型或给药途径如何，高灌注器官（如脑和心脏）中均出现高达90%—99%的细胞大量丢失11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21利用磁性纳米颗粒（MNPs）对干细胞进行标记，可实现一种创新的非侵入性细胞靶向递送策略22,23,24,25,26 并可同时利用 MRI 进行细胞监测27 以及磁性粒子成像（MPI）。最有效的 体内 采用磁化细胞靶向的研究更倾向于在局部给药后实现细胞滞留，而非静脉注射后的细胞导向23,24,28因此，我们课题组设计了一种由超顺磁性氧化铁纳米颗粒组成的递送系统29. 利用该技术，CD133+ SCs 和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）可被高效靶向，如所示 体外 尝试30,31.
干细胞治疗面临的另一个障碍是移植后受损组织中存在的不利炎症环境，这种环境会导致移植后的初始细胞死亡32除了多项预处理研究外，还测试了具有治疗相关性的miRs的应用33；已成功证明抗凋亡miRs可抑制细胞凋亡 体外 并增强细胞植入效果 体内33这些小分子由20–25个核苷酸组成，在信使RNA（mRNA）的转录后调控中发挥关键作用，从而影响干细胞的命运和行为。34此外，外源性引入miRs可避免其在宿主基因组中发生非预期的稳定整合34.
目前，将核酸（NAs）高效导入原代干细胞（SCs）的主要方法大多基于重组病毒8,35尽管转染效率较高，重组病毒的操作仍是从实验室到临床转化的主要障碍。 例如，不可控的基因表达、致病性、免疫原性以及插入突变35,36因此，开发基于聚合物等非病毒递送系统至关重要。其中，聚乙烯亚胺（PEI）是一种有效的递送载体，可为miRs提供多种优势，包括核酸缩合以防止降解、促进细胞摄取，以及通过内体逃逸实现细胞内释放37,38此外，miR-PEI 复合物在临床试验中表现出良好的生物相容性39因此，我们的递送系统由一种生物素化的支化25 kDa PEI与链霉亲和素包被的MNP核心结合而成30,31,40.
在本论文中，我们提供了一项全面的实验方案，描述了（i）从人骨髓（BM）捐献样本中手动分离CD133+干细胞（SC），并对干细胞产物进行详细表征；以及（ii）采用基于磁性非病毒聚合物递送系统对CD133+干细胞进行microRNA（miR）基因工程改造的高效且温和的转染策略。CD133+干细胞通过表面抗体依赖的磁性激活细胞分选（MACS）系统，从人胸骨骨髓抽吸物中分离并进行磁性富集。随后，采用流式细胞术分析细胞活力及细胞纯度。接着，制备miR/PEI/MNP复合物，并对CD133+干细胞进行转染。转染后18小时，检测转染的摄取效率以及转染对干细胞标志物表达和细胞活力的影响。此外，通过四色标记和结构照明显微镜（SIM）对转染复合物组分的细胞内分布情况进行评估。

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>含亚甲蓝的乙酸</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td>3%</td></tr><tr><td>抗CD133/2-PE抗体（克隆号：293C3）</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>抗CD34-FITC抗体（克隆号：AC136）</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-081-001</td><td></td></tr><tr><td>抗CD45-APC-H7抗体（克隆号：2D1）</td><td>BD Biosciences</td><td>560178</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明染料；与生物素偶联的Atto 565染料</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 软件 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CD133抗体偶联的超顺磁性铁葡聚糖颗粒；CD133 MicroBead试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-049</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶B</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>计数板</td><td>Paul Marienfeld GmbH &amp; Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氰基3染料标记的前体miR；Cy3染料标记的Pre-miR阴性对照#1</td><td>Ambion</td><td>AM17120</td><td></td></tr><tr><td>氰基5染料miR标记试剂盒；Cy5染料Label IT miRNA标记试剂盒</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10104159001</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人FcR阻断试剂</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>亮绿色蛋白标记试剂盒；Oregon Green 488蛋白标记试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O10241</td><td></td></tr><tr><td>水性封片剂；Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>密度梯度离心管；Leukosep离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89048-932</td><td></td></tr><tr><td>MACS磁铁架；MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS预分离滤器</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td>30 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>MACS分离柱（MS / LS）</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-201 / 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS永磁体；MACS分选器</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDF滤膜</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0.45 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>小鼠IgG 2b-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-215</td><td></td></tr><tr><td>胺反应性染料；近红外LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>人淋巴细胞分离液；Pancoll</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-60500</td><td>密度：1.077 g/mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-53500</td><td>不含Ca和Mg</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>408727</td><td>支化；25 kDa</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Schuchardt OHG</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>未标记前体miR；Pre-miR miRNA前体阴性对照#1</td><td>Ambion</td><td>AM17110</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RNase去污染溶液；RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>人淋巴细胞培养基；Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>重组人细胞因子添加剂；StemSpan CC100</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>无血清造血细胞扩增培养基；StemSpan H3000</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9800</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素磁性微球</td><td>Promega Corporation</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>T8154</td><td>0.4 %</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>0.5 M；pH 8.0</td></tr><tr><td>ZEN2011软件</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonorex RK 100 SH超声水浴器</td><td>Bandelin electronic</td><td></td><td>超声额定输出：80 W；超声频率：35 kHz</td></tr></tbody></table>

将microrna导入成年骨髓来源造血干细胞的方案：实现细胞工程与磁性靶向的结合

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

尽管CD133+造血干细胞（SCs）已被证实具有在再生医学领域中的巨大应用潜力，但其在注射至受损组织后滞留率低，且伴随大量细胞死亡，导致治疗效果极为有限。为克服这些局限性，我们致力于建立一种非病毒性的细胞工程化方案，用于细胞给药前的优化处理。本研究针对载有microRNA（miR）的磁性多聚复合物对人源表达CD133+的干细胞进行修饰，评估其摄取效率、安全性以及细胞靶向能力。基于本实验方案，可实现80–90%的高效miR摄取率，同时CD133+干细胞特性不受影响。此外，这些经修饰的细胞具备磁性靶向的潜力。本文介绍了一种安全且高效的CD133+干细胞修饰方法。我们预期该技术可成为优化治疗性干细胞效应的标准手段，并可通过磁共振成像（MRI）对所给予的细胞产品进行实时监测。

本方案描述了一种从人骨髓来源的CD133细胞中进行手动分离及磁珠富集的方法+ 非侵入性技术，用于病毒非依赖性细胞工程策略的SCs 体外 细胞操作与 体内 监测工具
这种三步分离技术可通过密度梯度离心法从预消化的胸骨骨髓中分离出单个核细胞（MNCs）。随后，可利用相应的分离技术通过磁性富集获得CD133+细胞组分。该方法可实现CD133+干细胞（SCs）的富集，其存活率和纯度均高于80%，可通过流式细胞术进行测定（图1）。此后，仅使用符合要求的干细胞产品进行后续实验。
本文所述转染方法可高效地将miR导入新分离的人CD133+干细胞中，活细胞摄取率约为8...

本方案介绍了一种安全且高效的CD133+造血干细胞修饰方法。所展示的非病毒性、基于磁性多聚复合物（polyplex）的技术，可为优化治疗性干细胞效应以及通过磁共振成像监测所给予的细胞产品提供基础。

将microRNA导入成年骨髓来源造血干细胞的方案：实现细胞工程与磁性靶向的结合

尽管CD133+造血干细胞（SCs）已被证实具有较高的再生医学应用潜力，但其较低的滞留率……

我们的方案可以回答再生医学领域的一些关键问题，例如细胞的有益特性是否能够得到改善，以及是否能够将细胞靶向至特定部位。本方案的主要优势在于，可通过我们的非病毒转染方法对细胞进行瞬时的遗传改造，从而保留细胞原有的特性。Sauter 的方法有助于深入了解造血干细胞的修饰过程，该方法也可应用于其他用于移植的细胞类型，例如间充质干细胞。开始实验方案时，将人淋巴细胞培养基预热至室温，并解冻胶原酶B和DNase。将骨髓（BM）收集至50毫升锥形管中。弃去任何已形成的凝块。取200微升骨髓样本用于后续流式细胞术分析。将样本储存于4摄氏度，待用。接着，将10毫升骨髓转移至一个新的50毫升锥形管中，加入6毫升PBS EDTA、20毫升人淋巴细胞培养基、175微升胶原酶B以及175微升DNase。轻轻混匀溶液，在摇床中于室温孵育30分钟。通过向50毫升密度梯度离心管中加入15毫升人淋巴细胞分离液进行预处理，并以1,000 × g离心30秒。小心地将35毫升稀释后的骨髓液分层加至密度梯度离心管滤膜上方，然后以445 × g离心35分钟。从离心机中轻轻取出离心管，避免振荡。小心弃去上层澄清液体最多20毫升，注意不要触碰位于滤膜上方的浑浊层。小心将含有单个核细胞（MNCs）的浑浊层转移至一个新的50毫升锥形管中，并用PBS EDTA补至终体积50毫升。将50毫升细胞悬液中的10微升转移至1.5毫升离心管中，加入10微升含亚甲蓝的3%醋酸溶液。轻轻混匀管内液体，取10微升加入计数板中，对单个核细胞（MNCs）进行计数。计算单个核细胞（MNC）的数量。将MNC悬液以300 × g离心10分钟，弃去上清液。为准备一亿个细胞的磁选，将单个核细胞（MNCs）小心地重悬于300 µL MACS缓冲液中。加入100 µL FcR阻断试剂和100 µL连接有超顺磁性氧化铁葡聚糖颗粒的CD133抗体。然后轻轻混匀细胞悬液，并在4°C下孵育30分钟。孵育期间轻柔振荡细胞悬液两到三次。孵育结束后，每1×10个细胞加入2毫升MACS缓冲液。轻柔混匀细胞悬液，并在4°C下以300×g离心10分钟。安装 MACS 磁铁架并固定 MACS 永久磁铁。安装 MACS 分离柱，并在上方放置预分离滤器。用 MACS 缓冲液平衡第一根 MACS 分离柱和预分离滤器。弃去上清液，将沉淀重悬于500微升MACS缓冲液中。将细胞悬液加入预分离滤器中。用MACS柱和预分离滤器各洗涤三次，然后弃去预分离滤器。将细胞组分直接洗脱到第二个MACS柱上。立即将第一个MACS柱转移至第二个MACS柱上方，并使用提供的推杆将细胞悬液推过MACS柱。用MACS缓冲液洗涤MACS柱3次。通过将MACS缓冲液加入第二个MACS柱并将其从MACS永磁体上取下，洗脱细胞组分。立即将第二个MACS柱置于一支离心管上方，推动细胞悬液通过MACS柱。离心该离心管。小心弃去上清液，并将沉淀重悬于 100 µL MACS 缓冲液中。取 1 × 10⁴ 个细胞用于后续流式细胞术分析。将剩余细胞重悬于培养基中，并将 5 × 10⁴ 个细胞接种至 24 孔板中用于转染。在37摄氏度、5% CO2和20% O2条件下培养细胞。取两份10微升骨髓（BM）等分试样以及一份 freshly isolated CD133阳性干细胞（SCs）用于分析。将细胞转移至1.5毫升离心管中。加入10 µL FcR封闭试剂，并用MACS缓冲液补足至总体积为33 µL。将抗体加至试管内壁一侧。待所有抗体均加入后，轻弹试管，使抗体溶液沉降至管底。轻轻混匀溶液，终体积为 50 微升，在 4 摄氏度下孵育 10 分钟。加入 1 毫升 1× 红细胞（RBC）裂解缓冲液。轻轻混匀悬浮液，并将溶液置于冰上孵育 10 分钟。然后离心该悬液。弃去上清液，并将获得的沉淀重悬于100 µL PBS中。通过流式细胞术检测细胞纯度和活力。每24孔板的每个孔使用20皮摩尔的MIR。将MIR用5%葡萄糖溶液稀释，使其终浓度为每微升0.25皮摩尔MIR。用等体积的5%葡萄糖溶液稀释PEI。接下来，将预稀释的PEI加入预稀释的MIR中，涡旋振荡30秒。在室温下孵育MIR-PEI复合物30分钟的同时，将磁性纳米颗粒（MNPs）置于室温超声水浴中，以35千赫兹超声处理20分钟。确保颗粒保持悬浮状态，不发生聚集。将超声处理的磁性纳米颗粒（MNPs）加入MIR PEI复合物中，涡旋振荡溶液30秒。在室温下孵育MIR PEI MNP复合物30分钟。将MIRNA PEI MNP复合物逐滴直接加入含有 freshly isolated CD133阳性干细胞（SCs）的培养孔中，孔内已预加培养基。轻轻晃动培养板，使溶液混合均匀。孵育细胞。转染后18小时，将每孔中的内容物分别收集至1.5毫升离心管中。用 500 微升 PBS 每孔洗涤一次，并将该细胞悬液转移至同一离心管中。然后，在 4 摄氏度下以 300 × g 离心 10 分钟。离心结束后，弃去上清液，并将沉淀重悬于 100 微升 MACS 缓冲液中。加入0.5微升胺反应性染料以区分活细胞与死细胞。轻轻混匀细胞悬液，并在4摄氏度下孵育10分钟。加入1毫升PBS，于4摄氏度下以300 × g离心10分钟。弃去上清液，将获得的沉淀重悬于 100 µL PBS 中，加入 33 µL 4% PFA，充分混匀。通过流式细胞术检测 MIR 摄取效率及转染介导的细胞毒性。根据本方案所述方法，流式细胞术分析表明，经磁珠富集的 CD133 阳性细胞组分的存活率和纯度均高于 80%。此处描述的转染方法可高效地将 MIR 导入这些新分离的人 CD133 阳性干细胞中。转染效率约为80%的活细胞。此外，与对照细胞相比，在转染后18小时未观察到明显的细胞毒性作用。而且，通过结构照明显微镜（SIM）可在细胞胞质内观察到转染复合物的有效递送和正常分布。完成此操作后，可进一步开展其他方法，例如将经修饰的干细胞应用于体内。这将有助于在动态条件下研究细胞的实际存活情况及其效应。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用基于聚合物和磁性纳米颗粒的转染技术，高效地将微小RNA（microRNA）导入新鲜的造血干细胞中。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

MicroRNA 移植成人骨髓造血干细胞促进细胞工程与磁性靶向结合的协议

组合使用5种荧光蛋白标记造血干细胞和祖细胞可实现 体内 通过共聚焦和双光子显微镜进行克隆追踪，揭示造血再生过程中骨髓造血结构的动态变化。该方法可在移植后长期、非侵入性地对光谱编码的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）来源的细胞在完整组织中进行命运图谱绘制。<br...

体内 克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

靶向细胞递送在多种生物医学应用中具有重要意义。本实验方案旨在利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）标记细胞，从而实现磁性细胞靶向，以高度可控的方式进行细胞递送与定位。...

使用超顺磁性氧化铁纳米颗粒进行细胞标记与靶向

干细胞向软骨分化需要精细调控培养条件。本文介绍一种利用磁力方法聚集细胞的技术，这是启动软骨分化的关键步骤。此外，我们还表明，在生物反应器中进行动态成熟培养可对细胞构建物施加机械刺激，从而增强软骨样细胞外基质的生成。...

三维磁性干细胞聚合并结合生物反应器成熟化用于软骨再生

本论文描述了一种利用PEI/MNP载体高效、非病毒性地将miR递送至内皮细胞并实现其磁化的方法。因此，该方法除了可实现遗传修饰外，还可实现磁性细胞导向和磁共振成像（MRI）检测。该技术可用于改善治疗性细胞产品的特性。...

制备与 体外 磁化miR修饰内皮细胞的表征

本方案描述了对从人牙囊中提取的牙源性干细胞进行瞬时基因工程改造的方法。所采用的非病毒性修饰策略可为改进治疗用干细胞产品提供基础。...

人牙囊干细胞的分离、鉴定及基于微小RNA的遗传修饰

我们描述了利用造血干细胞移植（HSCT）评估基因工程改造的造血细胞的恶性潜能。HSCT可用于评估多种恶性造血细胞 体内...

利用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

本方案的目的是从预处理的非人灵长类动物骨髓中分离CD34+细胞，利用慢病毒载体对这些细胞进行基因修饰，并制备可用于回输至自体宿主的产品。整个方案耗时约48小时。...

非人灵长类造血干细胞与祖细胞的制备及基因修饰

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

本方案描述了一种优化的造血干细胞和祖细胞（HSPC）培养程序，用于高效移植基因编辑细胞 体内.

用于基因治疗应用的造血干细胞和祖细胞CRISPR/Cas9基因编辑

本方案描述了利用组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物对小鼠骨髓来源巨噬细胞进行基因组编辑的操作步骤 体外...

利用电穿孔递送Cas9-sgRNA复合物在原代骨髓来源巨噬细胞中实现高效基因敲除

本方案描述了在小鼠异种移植模型中向股骨内注射少量造血干细胞或白血病干细胞（包括基因编辑细胞）的方法，该方法不仅能够实现细胞的快速安全移植，还可进行骨髓的系列分析。...

利用活体小鼠进行简化的股骨内注射以实现连续骨髓分析

学习使用非病毒磁性多聚物转染技术对CD133+造血干细胞进行基因修饰的方法。该技术可在保留细胞特性的同时实现高效microRNA导入，并支持磁共振成像监测，为再生医学研究提供安全可靠的细胞工程方案。

将microRNA导入成年骨髓来源造血干细胞的方案：实现细胞工程与磁性靶向的结合

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