用于药物筛选的高通量三维肿瘤球体的生成
2018年9月5日
在多种疾病适应症中，越来越多具有更高生理相关性的模型正被开发并应用于药物发现项目。本文所述的新型模型系统展示了如何在高通量的1536孔板系统中培养和筛选三维肿瘤球体，以寻找新的肿瘤学药物。
该方法有助于回答药物发现领域中的关键问题，例如，在从苗头化合物到先导化合物的筛选过程中，最相关的组织培养条件是什么。该技术的主要优势在于，能够利用1536孔板以高通量的方式实现细胞的三维培养。本实验方案将由我实验室的高级科学家Kalyani Gampa进行演示。
建立三维肿瘤球体培养时，用三轮BBS洗涤，使目标癌细胞系从培养皿上脱离。随后，按每五平方厘米培养瓶面积加入一毫升胰蛋白酶。五分钟后，用五倍体积的含血清培养基中和各培养瓶中的胰蛋白酶，并对细胞进行计数。
使用经灭菌的小型不锈钢尖端卡带，结合基于蠕动泵的系统，将总共500个细胞以8微升类球体培养基接种至每孔，接种于经组织培养处理的1,536孔板的每个孔中。然后使用透气性粘性板封膜覆盖该板，并将该板置于旋转培养箱中，在37摄氏度、10转/分钟、5%二氧化碳和95%相对湿度条件下培养三天。
最关键的一步是在将培养板放入培养箱之前确保其密封良好。类球体需要三天时间形成，此步骤可防止培养基蒸发。培养结束后，将含有癌细胞的培养板在100 × g条件下短暂离心，以收集可能产生的冷凝液，并移除粘性密封膜。
将每块待处理的培养板置于声波分配仪上，设定为每种化合物总共递送八纳升。每孔用DMSO稀释至终浓度为0.1%，化合物最高浓度为10微摩尔。在将化合物加入相应培养板后，为防止蒸发，向每块培养板加盖定制的不锈钢细胞培养盖，并将培养板放回旋转培养箱中继续孵育五天。
孵育结束后，向每块细胞培养板的每个孔中加入3微升预热的细胞裂解试剂（其中添加了荧光素）。将培养板在室温下继续孵育至少15分钟。随后使用酶标仪检测ATP产生的发光信号。
当所有培养板分析完成后，从仪器中提取原始数据，并将含有待测化合物的各孔数据归一化，以仅含DMSO的孔作为中性对照，取其平均值进行标准化。随后可根据公式计算每种化合物的生长抑制率，并绘制剂量反应曲线，生成抑制IC50值。多种已知在二维培养条件下生长良好的癌细胞系，尽管其形态各异，但在如上所述的培养条件下同样能够形成三维结构。
在进行大规模筛选时，可观察到在二维培养与三维培养条件下，细胞对化合物的敏感性存在差异。每个数据点代表一种化合物在两种培养条件下均达到50%细胞杀伤效应时的抑制浓度。在此代表性实验中，两种测试的RAF激酶抑制剂在携带KRAS蛋白激活突变的非小细胞肺癌细胞系培养物中，在三维条件下表现出更强的抑制活性。
然而，这些化合物在含有 KRAS G13D 激活突变的 3D 球状体和 2D 结肠癌细胞系培养物中均表现出相似的效力。3D 检测还可观察到反常的生长激活现象，即在高度激活的 RAF 突变细胞系中，当 RAF 二聚体未被完全抑制时，会出现低浓度药物促进细胞生长、而高浓度药物则抑制生长的现象。该技术建立后，为癌症药物研发领域的研究人员探索替代性培养条件以发现针对已知靶点的新颖高效化合物开辟了道路。
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概述
本文介绍了一种利用在高通量1536孔板系统中培养的三维肿瘤球体进行药物发现的新方法。该方法旨在提高组织培养环境在筛选潜在肿瘤药物中的相关性。
关键研究组成部分
科学领域
- 肿瘤学
- 药物发现
- 细胞培养技术
背景
- 传统的二维细胞培养通常无法模拟肿瘤微环境。
- 三维培养为癌症研究提供了更具生理相关性的模型。
- 高通量筛选对于高效的药物发现至关重要。
- 本研究重点在于优化肿瘤类球体的培养。
研究目的
- 建立一种用于培养肿瘤类球体的高通量方法。
- 评估该模型在药物发现中的相关性。
- 促进新型肿瘤学药物的筛选与鉴定。
使用的方法
- 使用 BBS 清洗液解离癌细胞系。
- 使用胰蛋白酶进行细胞解离，并用含血清培养基中和。
- 以 1536 孔板格式培养细胞。
- 以高通量方式筛选潜在药物候选物。
主要结果
- 该方法可高效培养三维肿瘤球。
- 高通量能力可实现药物候选物的快速筛选。
- 已证实三维培养模型在药物发现中的相关性。
- 有望改进苗头化合物到先导化合物的筛选过程。
结论
- 这种三维肿瘤类球体培养方法可增强药物发现的研究工作。
- 它能更准确地模拟肿瘤生物学特性。
- 该方法有助于发现新的肿瘤治疗策略。
常见问题
行业重要性概要
该方法通过在具有生理相关性的三维肿瘤球体模型中实现高通量筛选，弥补了肿瘤学药物发现中的转化鸿沟。通过揭示二维与三维培养条件下药物反应的差异，该方法可提高靶点验证的预测可信度。该策略有助于在基因定义的癌症模型中增强MAPK通路抑制剂的苗头化合物向先导化合物的筛选与鉴定。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在可模拟三维细胞相互作用和空间结构的疾病相关体系中，验证治疗假设。
- 操作价值：通过比较化合物在二维与三维培养体系中的药效，识别依赖特定微环境的活性，从而支持作用机制层面的风险评估。
- 预测价值：在三维条件下，通过检测KRAS突变型非小细胞肺癌模型中的差异敏感性，促进先导化合物的筛选与鉴定。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供一种标准化、可重复的3D培养系统，兼容1536孔板格式，适用于大规模化合物筛选。
- 操作价值：通过基于ATP的定量发光检测，测量生长抑制效果，并生成剂量-反应曲线和IC50值。
- 检测就绪性：采用声波分配技术实现纳升级化合物的精确递送，并通过密封培养防止蒸发，确保检测的完整性。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过在可扩展的体系中模拟肿瘤-间质相互作用和类似细胞外基质的条件，连接发现研究与临床前研究流程。
- 风险调控的推进：允许观察RAF二聚体突变体中矛盾性的生长激活现象，从而指导联合治疗策略并降低临床候选药物的风险。
- 生物标志物匹配：支持在基因背景明确的模型中评估通路特异性抑制剂（如MAPK通路抑制剂），以关联基因型与药物反应。
流程与工作流整合
该方法可融入从靶点验证到先导化合物发现的整个研究流程，能够在临床前投入之前，在更接近生理相关性的环境中对化合物的药效进行早期评估。
- 发现生物学：通过揭示三维培养如何改变致癌基因驱动模型（如KRAS突变型非小细胞肺癌）中的药物敏感性，支持假设验证。
- 筛选：通过在1536孔板中采用标准化的类球体形成方法，并结合受控的孵育和封板流程，实现检测的即用性和可重复性。
- 分析：通过将ATP发光信号相对于DMSO对照进行归一化，实现因变量的定量测量，从而支持IC50计算和化合物效价的比较分析。
- 转化研究：通过模拟二维系统中所缺乏的肿瘤空间结构和克隆间相互作用，衔接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于筛选靶向保守通路（如MAPK通路）的多种癌细胞系和化合物文库。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接比较二维和三维药物反应，减少机制上的不确定性，从而提高预测的可信度。
- 操作价值：采用与机器人兼容的1536孔板工作流程和密封培养，实现标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过识别具有特定环境活性的化合物，优化“推进/终止”决策，降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于在生理相关模型中表现出的差异性疗效，实现对候选药物的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备三维细胞培养技术的专业知识，包括胰蛋白酶中和、细胞计数和无菌铺板。
- 依赖于特定仪器设备，如基于蠕动泵的卡匣系统、声波移液器、旋转培养箱和微孔板化学发光检测仪。
- 需要跨团队对封板方案、培养参数（37°C、10 rpm、5% CO2、95% 湿度）和数据归一化流程进行标准化。
- 需考虑不同癌细胞系的适应性差异，因为尽管在已建立的细胞系中可成功形成类球体，但其成球效率可能有所不同。
- 存在实际限制因素，例如在长时间培养过程中需防止蒸发，以及在纳升级体积中优化化合物给药方案。
