Name: CARIP 和芯片序列: 鉴定胚胎干细胞中染色质相关 rna 和蛋白质-DNA 相互作用的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学习ChIP-Seq和CARIP-Seq技术，用于胚胎干细胞中蛋白质-DNA相互作用和染色质相关RNA的全基因组分析。这些方法可揭示表观遗传调控机制，助力癌症等疾病研究。

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本工作由韦恩州立大学、卡曼诺斯癌症研究所及美国国家心肺血液研究所（1K22HL126842-01A1）授予 B.L.K. 的资助项目支持。本研究利用了韦恩州立大学高性能计算网格提供的计算资源（&#60;https://www.grid.wayne.edu/&#62;）。我们感谢 Jiji Kurup 在 CARIP-Seq 数据分析方面提供的协助。
作者贡献：
B.L.K. 提出了 CARIP-Seq 方法，设计并实施了 ChIP-Seq 和 CARIP-Seq 实验，分析了测序数据，并起草了 manuscript。所有作者均已阅读并批准了该 manuscript 的最终版本。

1. 小鼠胚胎干细胞在无饲养层条件下的培养。
注意：小鼠胚胎干细胞（ES细胞）通常在培养基中培养，培养皿需预先包被明胶并铺有一层经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEFs）。然而，在进行下游的表观遗传学或表达分析之前，应去除MEFs，以避免MEF相关的染色质和RNA污染。
<ol>
	<li>饲养层的制备：向6孔细胞培养板中加入2 mL 0.1%明胶水溶液进行明胶包被，并在37 °C孵育20–30分钟。</li>
	<li>制备含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基，其中包含2 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素。</li>
	<li>从小鼠胚胎发育第13.5至14.5天（E13.5–E14.5）的胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）18,19，或从商业供应商处获取。使用丝裂霉素C处理或γ射线照射等标准方案对MEFs进行有丝分裂失活19。或者，可直接从商业供应商处购买有丝分裂失活的MEFs（iMEFs）。</li>
	<li>MEFs的培养：将MEF培养基预热至37 °C，解冻冻存的iMEFs细胞管，然后在37 °C、5% CO2条件下，使用含10% FBS的MEF培养基进行培养。以每孔约200,000个细胞的密度将MEFs接种至6孔培养板中。</li>
	<li>在饲养层细胞（iMEFs）上培养胚胎干细胞（ES细胞）。
	<ol>
		<li>接种iMEFs后12–24小时，将50 mL ES细胞培养基（高糖DMEM、含10 ng/mL白血病抑制因子LIF、15% ES细胞专用胎牛血清、1×细胞培养级2-巯基乙醇、1×谷氨酰胺、非必需氨基酸（NEAA）和1×青霉素/链霉素）预热至37 °C，并置于含5% CO2的培养箱中。</li>
		<li>吸除含iMEFs的细胞培养板中的培养基，将解冻后于37 °C复温的ES细胞用2 mL培养基重悬，接种至iMEFs层上。将培养皿放入培养箱时，应沿&#34;t&#34;字形轨迹移动培养皿，以使细胞均匀分布，并防止细胞聚集于培养皿中心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将ES细胞传代至无饲养层的明胶包被培养皿中。在ES细胞达到汇合前进行传代。若ES细胞克隆之间保持均匀间距且未发生汇合，则更有利于维持其自我更新能力。当大量ES细胞克隆相互接触时，表明细胞密度过高。
	<ol>
		<li>按上述方法用明胶包被6孔培养板。将0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液在37 °C预热约10–15分钟。</li>
		<li>随后进行ES细胞传代：首先用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。等待1–2分钟，直至细胞克隆脱落。使用1 mL移液枪头反复吹打约5次，使克隆解离为单细胞悬液。</li>
		<li>在显微镜下确认ES细胞已充分解离为单细胞。为终止反应，即&#34;中和&#34;胰蛋白酶活性，加入含10% FBS的MEF培养基。室温下以300 × g离心3–5分钟，吸除上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀用2 mL ES细胞培养基重悬，培养基中添加糖原合成酶激酶-3（GSK3）抑制剂（CHIR99021；GSK3i），或使用2i条件（MEKi/GSK3i）（2–3 µM GSK3i：CHIR99021；1 µM MEKi：PD0325901）。</li>
		<li>吸除培养皿中的明胶溶液，向皿中加入含ES细胞的2 mL培养基，置于37 °C培养箱中（图1A–D）。在无饲养层细胞（iMEFs）且无血清的条件下，同时抑制GSK3i和MEKi可促进ES细胞进入基础态原始多能性20。在进行交联实验前，应将ES细胞连续传代2–3次以彻底清除残留的MEFs。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. ChIP 和 CARIP 实验中 ES 细胞的交联
<ol>
	<li>用 PBS 洗涤 ES 细胞以收获细胞，然后加入预热至 37 °C 的 0.25% 胰蛋白酶。在室温下孵育数分钟。避免胰蛋白酶消化过度，否则会导致细胞死亡。使用显微镜评估单细胞解离情况。</li>
	<li>按照上述传代 ES 细胞的方法终止胰蛋白酶消化，并在室温下以 300 × g 离心 3–5 分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于预热（37 °C）的 MEF 培养基（10% FBS/DMEM）中，浓度为 2 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>为交联细胞，向细胞中加入 37% 甲醛溶液，使其终浓度为 1%，并在 37 °C 下于锥形管（15 mL 或 50 mL）中孵育 8 分钟。在 8 分钟内翻转管子数次，以实现均匀固定。 
	注意：CARIP 实验中交联时间可根据经验优化。若改变交联时间，超声破碎的循环次数也应相应调整。此外，与室温交联相比，37 °C 可提高交联效率。固定温度也可根据经验进行优化。</li>
	<li>为终止固定反应，加入预冷（4 °C）的 1.25 M 甘氨酸溶液，使其终浓度为 0.125 M。将管子置于旋转仪上，以 8 rpm 在室温下翻转 5 分钟。在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，并吸除上清液。</li>
	<li>用预冷的 PBS（4 °C）洗涤细胞沉淀，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，吸除 PBS。再次用 PBS 洗涤细胞。随后，将每份 15 × 106 个细胞分装至 15 mL 管中。</li>
	<li>通过将细胞沉淀置于液氮中 1 分钟、干冰上 5 分钟，或立即放入 -80 °C 环境中进行冷冻。 
	注意：固定的 ES 细胞沉淀可在不影响后续实验质量的前提下储存长达 6 个月。</li>
</ol>
3. 用于 ChIP 和 CARIP 的染色质超声处理
<ol>
	<li>将固定的 ES 细胞沉淀在冰上解冻。用超声破碎缓冲液（2.5 mL）重悬细胞沉淀。对于转录因子或表观遗传调控蛋白（蛋白因子），使用 1× TE、1 mM PMSF、1× 蛋白酶抑制剂混合液重悬沉淀。对于组蛋白修饰，使用 1× TE、0.1% SDS、1 mM PMSF、1× 蛋白酶抑制剂重悬沉淀。 
	注意：虽然添加 SDS 可提高超声破碎效率，但可能不利于某些染色质组分或转录因子的检测。</li>
	<li>进行染色质免疫沉淀（ChIP）时，以 40% 振幅进行 14–18 个循环（开启 30 秒，暂停 30 秒）超声破碎染色质。进行染色质相关 RNA 免疫沉淀（CARIP）时，减少超声循环次数（8–10 个循环）。由于细胞类型、固定条件及超声设备存在差异，超声条件应通过实验优化确定。</li>
	<li>向超声破碎缓冲液中加入 28 µL 10% SDS（用于蛋白因子）、28 µL 脱氧胆酸钠和 0.28 mL 10% Triton-X100，并充分混匀。 
	注意：向超声破碎缓冲液中添加这些成分后即形成 RIPA 缓冲液。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟，以预清除染色质。将上清液转移至新离心管中，随后进行染色质免疫沉淀。</li>
	<li>或者，超声破碎后的染色质可保存于 -80 °C，待后续使用。但需注意，超声破碎后的染色质在 -80 °C 保存可能导致蛋白因子 ChIP 的质量下降。</li>
</ol>
4. ChIP 和 CARIP 流程
<ol>
	<li>向一个1.5 mL低吸附离心管中加入40 µL蛋白A或G磁珠。加入600 µL PBS洗涤磁珠。将离心管置于含磁铁的支架上，室温孵育1 min，吸除PBS，再用100 µL PBS重悬磁珠。</li>
	<li>向含有磁珠的离心管中加入 2–4 µg 抗体。将离心管置于旋转仪上，室温下以 8 rpm 转速孵育并旋转 40 分钟，使抗体与磁珠充分结合。将离心管放入磁力架中，室温孵育 1 分钟，随后移除 PBS。</li>
	<li>加入 200 µL PBS 洗涤磁珠。PBS 洗涤用于去除游离的 IgG。每次洗涤步骤之间，在室温下孵育并旋转反应管 5 分钟。将反应管置于磁力架上，吸除 PBS。</li>
	<li>通过将超声处理后的染色质提取物（4 × 106 每轮免疫沉淀使用指定数量的细胞，与磁珠混合后，4 °C 旋转孵育（过夜）。</li>
	<li>洗涤磁珠。将样品在室温下与以下缓冲液孵育，并在每种缓冲液中旋转孵育10分钟：用1 mL RIPA缓冲液（TE（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA）pH 8.0，1% Triton X-100，0.1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS）洗涤两次，再用1 mL含0.3 M NaCl的RIPA缓冲液洗涤两次&#160;NaCl，用1 mL LiCl缓冲液（0.5% 脱氧胆酸钠，0.5% NP40，0.25 M LiCl）洗两次，用含0.2% Triton X-100的TE缓冲液洗一次，再用1 mL TE缓冲液洗一次。</li>
	<li>染色质免疫沉淀的去交联。将磁珠重悬于100 µL TE缓冲液中，加入3 µL 10% SDS和5 µL蛋白酶K（20 mg/mL）。将样品在65 °C孵育过夜。 
	注意：此步骤中必须使用帕拉菲膜（parafilm）或塑料封口膜覆盖管口，以防止蒸发。
	<ol>
		<li>次日，将离心管颠倒数次以混匀。接着，使用磁力架将上清液转移至新的离心管中。为洗涤磁珠，加入含0.5 M NaCl的TE缓冲液100 µL，并随后将两次所得上清液合并。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CARIP 脱交联。将磁珠重悬于 100 µL TE 缓冲液中，加入 3 µL 10% SDS 和 5 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL）。将样品在 65 °C 下孵育 4 至 12 小时。由于不同细胞类型、超声处理条件和固定条件等因素存在差异，65 °C 下的孵育时间需根据经验确定。
	<ol>
		<li>将离心管颠倒3-5次以混匀，置于磁力架上，随后将上清液转移至新的离心管中。</li>
		<li>加入100 µL含0.5 M NaCl的TE缓冲液洗涤磁珠，随后合并两次上清液。 
		注意：必须使用无核酸酶的试剂（例如．，TE缓冲液，SDS 等等以防止在去交联步骤中DNA或RNA的丢失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 200 µL 苯酚:氯仿:异戊醇（PCI）（25:24:1，v/v）提取 DNA/RNA。 
	注意：也可根据制造商说明书使用商业试剂盒提取RNA。振荡30秒，室温下以10,000 × g离心10分钟，将上清液转移至新离心管中。
	<ol>
		<li>加入 2 µL GlycoBlue、20 µL 3 M 醋酸钠和 600 µL 乙醇以沉淀 DNA/RNA。轻轻颠倒混匀约 5–8 次，将样品置于干冰或 -80 °C 条件下至少 1–2 小时。</li>
		<li>在4 °C下使用台式冷冻离心机以10,000 × g离心30分钟。将沉淀物空气干燥 &#60;1 分钟后重悬于 40 µL EB 缓冲液（10 mM Tris-HCl）中。进行 ChIP-Seq 文库构建时，继续执行步骤 6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用DNase去除染色质相关RNA免疫沉淀（CARIP）样品中的DNA。将10倍浓度的DNase缓冲液加入CARIP样品中至终浓度为1倍。每不超过10 µg RNA（50 µL反应体系）加入1 µL DNase。37 °C孵育30分钟。用苯酚-氯仿-异戊醇（PCI）抽提RNA样品。将RNA沉淀重悬于无核酸酶的H₂O中。2O.</li>
</ol>
5. 用于CARIP-Seq的双链cDNA合成
<ol>
	<li>第一链cDNA的合成。进行逆转录反应时，在适用于PCR仪的离心管中配制以下反应体系：10.5 µL RNA和1 µL随机六聚体引物（3 µg/µL）。</li>
	<li>将离心管在65 °C孵育5分钟以变性二级结构，随后置于冰上保存2分钟。混合以下组分：4 µL第一链缓冲液、2 µL 0.1 M DTT、1 µL dNTP和0.5 µL RNase OUT。接着，向PCR管中加入7.5 µL上述预混液。在25 °C孵育2分钟。加入1 µL Superscript II（200 U/µL），并按以下条件孵育：25 °C孵育10分钟，42 °C孵育50分钟，70 °C孵育15分钟，最后维持在4 °C。</li>
	<li>第二链cDNA合成。将离心管置于冰上。按顺序依次加入以下组分：91 µL经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水、30 µL 5×第二链反应缓冲液、3 µL dNTP混合液（10 mM）、1 µL E. Coli DNA连接酶（10 U/µL）、4 µL E. Coli DNA聚合酶（10 U/µL）和1 µL E. Coli RNase H（2 U/µL）。轻轻涡旋混匀，并在16 °C孵育2小时。 
	注意：通过弹击或翻转离心管的方式可能不足以充分混匀试剂。</li>
	<li>加入2 µL T4 DNA聚合酶，在16 °C孵育5分钟。使用PCR纯化试剂盒纯化cDNA（双链cDNA，dscDNA）。用40 µL EB缓冲液洗脱dscDNA。</li>
	<li>片段化双链cDNA。使用水浴超声仪和1.5 mL离心管将cDNA（dscDNA）超声剪切至250–500 bp大小。dscDNA的超声处理对于降低片段长度、促进完整RNA转录本的测序至关重要。</li>
	<li>当使用标准型号的水浴超声仪时，建议对样品进行3次×10分钟或4次×10分钟的超声处理。 
	注意：对于总量不超过1 µg的总RNA，应使用3个循环；对于1–5 µg的总RNA，建议使用4个循环。每次超声循环后短暂离心离心管，并通过添加新鲜冰块维持水浴低温。</li>
	<li>当使用Pico超声仪时，建议对1–5 µg总RNA采用6个循环，每个循环条件为（开启30秒，关闭90秒）。每进行2–3个超声循环后短暂离心离心管。可通过将部分剪切后的dscDNA（3–4 µL）上样至2%琼脂糖凝胶电泳来评估超声效率。由于不同超声仪之间存在差异，建议通过实验优化超声条件。</li>
	<li>按照步骤6所述方法进行文库构建，用于下一代测序。</li>
</ol>
6. ChIP-Seq 与 CARIP-Seq 文库构建
<ol>
	<li>使用DNA末端修复试剂盒修复DNA末端。该试剂盒用于生成平末端DNA。在1.5 mL低吸附离心管中配制以下反应体系：34 µL DNA、5 µL 2.5 mM dNTPs、5 µL 10 mM ATP、5 µL 10×末端修复缓冲液（含5 mM DTT、100 mM醋酸镁、660 mM醋酸钾、300 mM醋酸三羟甲基氨基甲烷，pH 7.8）以及1 µL末端修复酶混合物（T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶）。</li>
	<li>室温孵育样品45分钟。</li>
	<li>使用反应纯化试剂盒纯化DNA。用32 µL预热（65 °C）的EB缓冲液洗脱末端修复后的DNA。尽管在ChIP后或CARIP后进行文库构建前，我们通常不测定DNA或RNA的浓度，但仍建议起始量至少为5–10 ng的ChIP DNA或CARIP RNA。</li>
	<li>在末端修复后的DNA上添加3' &#34;A&#34;突出端。在1.5 mL低吸附离心管中加入以下组分：30 µL上述DNA、5 µL 10×NEB缓冲液2、1 µL 10 mM dATP储备液、11 µL H2O以及3 µL 5 U/µL Klenow片段（3'-5'外切酶缺陷型），用移液器轻轻混匀。</li>
	<li>37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>使用反应纯化试剂盒纯化DNA。用25 µL预热（65 °C）的EB缓冲液洗脱DNA。</li>
	<li>连接接头。在冰上加入以下组分：23 µL上述DNA、3 µL 10×T4 DNA连接酶缓冲液、1 µL退火后的PE接头或多重测序接头（4 µM）以及3 µL T4 DNA连接酶（400 U/µL），用移液器轻轻混匀。 
	注：接头序列也可从商业来源获得。 
	寡核苷酸序列： 
	PE接头 
	5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG 
	5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 
	多重测序接头 
	5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT 
	5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</li>
	<li>室温孵育30分钟。</li>
	<li>使用预制琼脂糖凝胶（2%）进行DNA片段大小选择。电泳运行10分钟。</li>
	<li>切取对应于250–450 bp的条带区域。 
	注：通过切取大于200 bp的凝胶区域，可降低未连接接头二聚体污染的可能性。在PCR步骤前必须去除所有未连接的接头。</li>
	<li>使用凝胶回收试剂盒纯化DNA。用20 µL EB缓冲液洗脱。</li>
	<li>对含有成对末端（PE）接头的连接产物进行PCR扩增及文库纯化。在PCR管中加入以下组分：12 µL上述DNA的50%、12 µL水、25 µL主混合液（Phusion HF）、1 µL PE PCR引物1.0和1 µL PE PCR引物2.0。 
	注：寡核苷酸序列也可从商业来源获得。 
	寡核苷酸序列： 
	PE PCR引物1.0 
	5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 
	PE PCR引物2.0 
	5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT</li>
	<li>对含有Index PE接头的连接产物进行PCR扩增及文库纯化。加入以下组分：12 µL上述DNA的50%、12 µL水、1 µL PCR引物InPE 1.0（1:2稀释）、1 µL PCR引物InPE 2.0（1:2稀释）以及1 µL PCR引物Index（1:2稀释）。 
	注：寡核苷酸序列也可从商业来源获得。 
	寡核苷酸序列： 
	多重测序PCR引物1.0 
	5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 
	多重测序PCR引物2.0 
	5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 
	PCR引物Index序列1–12 
	PCR引物，Index 1 
	5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC 
	PCR引物，Index 2 
	5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC 
	PCR引物，Index 3 
	5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC 
	PCR引物，Index 4 
	5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC 
	PCR引物，Index 5 
	5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC 
	PCR引物，Index 6 
	5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC 
	PCR引物，Index 7 
	5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC 
	PCR引物，Index 8 
	5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC 
	PCR引物，Index 9 
	5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC 
	PCR引物，Index 10 
	5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC 
	PCR引物，Index 11 
	5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC 
	PCR引物，Index 12 
	5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC</li>
	<li>采用以下条件进行PCR扩增循环（98 °C变性30秒，18个循环：98 °C 10秒、65 °C 30秒、72 °C 30秒，72 °C延伸5分钟，4 °C保存）。 
	注：PCR循环数应根据实验经验确定。</li>
	<li>对PCR产物进行片段大小选择。将DNA上样至预制E-Gel EX（2%）或自制2%琼脂糖凝胶，切取300–500 bp的条带区域。</li>
	<li>使用凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化DNA。用20 µL EB缓冲液洗脱最终PCR产物。</li>
	<li>使用荧光计测定文库浓度。进行下一代测序。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

ChIP-Seq 是一种用于评估胚胎干细胞（ES 细胞）中全基因组范围内蛋白质-DNA 相互作用位置的有效方法（例如，转录因子、组蛋白修饰酶、组蛋白修饰与 DNA 的相互作用），而新开发的 CARIP-Seq 协议则适用于研究 RNA 与染色质组分在全基因组范围内的关联。ChIP-Seq 是评估 ES 细胞及其他细胞类型表观遗传景观的一项基础工具。ChIP-Seq 与 CARIP-Seq 文库的质量在很大程度上依赖于 ChIP 级别的抗体。可通过 ChIP-PCR 实验经验性地确定抗体是否适用于 ChIP-Seq，通常在阳性对照区域相对于无结合区域的富集倍数达到 ≥ 3 至 5 倍时，即可获得高质量的 ChIP-Seq 数据25。同样，可通过与 ChIP-Seq 类似的方法（稍作修改）测试抗体是否适用于 CARIP-Seq。在按照上述方法部分所述完成 CARIP 协议中的 RNA 免疫沉淀（IP）步骤后，应进行逆转录 PCR 以生成 cDNA，并以此为模板进行定量逆转录 PCR（Q-RT-PCR）。建议在多个基因组区域评估 ChIP 或 CARIP 后的富集情况。在评估用...

胚胎干细胞（ES细胞）的命运决定受到细胞外信号与多种转录调控因子（包括组蛋白修饰酶以及组蛋白尾部的翻译后修饰）之间相互作用的调控。这些相互作用促进了染色质的可及性，并将染色质包装成两种状态之一：具有开放结构且转录活跃的常染色质（euchromatin），以及结构紧密且通常转录失活的异染色质（heterochromatin）。具有DNA序列特异性结合能力的转录因子和表观遗传修饰因子可结合于常染色质区域，参与基因表达的调控。新一代测序技术，如ChIP-Seq1，在绘制全基因组范围内的转录调控网络方面发挥了关键作用，这些网络对于ES细胞的自我更新和多能性至关重要2,3,4,5,6。此外，尽管RNA免疫共沉淀结合新一代测序（RIP-Seq）7对RNA-蛋白质相互作用的研究表明，DNA结合蛋白可通过与RNA相互作用来调控转录事件7,8,9,10,11,12，但目前仍鲜有研究探讨与染色质相关联的RNA在全基因组范围内的定位12，或RNA与组蛋白修饰之间的全局性相互作用。长链非编码RNA（lncRNAs）是一类已被发现可调控染色质相关蛋白活性的RNA13,14,15。例如，Xist是一种lncRNA，可在雌性哺乳动物细胞中通过招募表观遗传抑制因子，介导其中一条X染色体的失活16,17。然而，与染色质相关联的RNA的完整谱系在很大程度上仍不清楚。本文中，我们描述了一种新颖的实验流程：染色质相关RNA免疫沉淀（CARIP）结合新一代测序（CARIP-Seq），用于在全基因组范围内鉴定ES细胞中与染色质相关的RNA，包括用于新一代测序的文库构建，以及通过ChIP-Seq绘制组蛋白修饰、转录因子和表观遗传修饰因子的全基因组占据图谱。与其它RIP-Seq方法7不同，CARIP-Seq包含交联和超声处理步骤，从而能够直接鉴定与染色质相关联的RNA。综上所述，ChIP-Seq是一种强大的用于识别全基因组范围内蛋白质-DNA相互作用的工具，而CARIP-Seq则是一种有效用于系统分析与染色质组分相关联的RNA的方法。

<table><tbody><tr><td>小鼠白血病抑制因子（ESGRO LIF）</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>10&lt;sup&gt;6 &lt;/sup&gt;或 10&lt;sup&gt;7 &lt;/sup&gt;单位</td></tr><tr><td>GSK3&amp;beta; 抑制剂 CHIR99021（GSK3i）</td><td>Stemgent</td><td></td><td>溶剂：DMSO 10 mM</td></tr><tr><td>MEK 抑制剂 PD0325901（MEKi）</td><td>Stemgent</td><td></td><td>溶剂：DMSO 10 mM</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），高糖</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲盐水）</td><td>Invitrogen</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（50 mM）</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液（100X）</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 胚胎干细胞级胎牛血清，500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% 明胶溶液</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>G7126-500G</td><td>水溶液储存浓度为 1.25 M</td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TE（Tris EDTA）pH 8.0 1X</td><td>Quality Biological</td><td>351-011-131</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液</td><td>Sigma</td><td>93482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠溶液（20%）</td><td>Quality Biological</td><td>A611-0837-10</td><td></td></tr><tr><td>Q125 超声破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 溶液</td><td>Sigma</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G 免疫沉淀磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A 免疫沉淀磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A/Protein G 及磁力架起始套装</td><td>Invitrogen</td><td>10015D</td><td></td></tr><tr><td>氯化锂</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA 纯化试剂盒（用于从总RNA样品中纯化mRNA）</td><td>Invitrogen</td><td>61006</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript 双链 cDNA 合成试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>11917010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>End-It DNA 末端修复试剂盒</td><td>Lucigen</td><td>ER81050</td><td></td></tr><tr><td>Klenow 片段（3&#039;&amp;rarr;5' 外切酶缺陷型）</td><td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dATP（10 mM）</td><td>Invitrogen</td><td>18252015</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA 标准品</td><td>Invitrogen</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>E-gel EX 琼脂糖凝胶，2%</td><td>Invitrogen</td><td>G402002</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 2X 预混液（含 HF 缓冲液）</td><td>Thermo Fisher</td><td>F531LPM</td><td></td></tr><tr><td>ChIPAb+ 三甲基化组蛋白 H3（Lys4）— 经 ChIP 验证的抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>17-614</td><td></td></tr><tr><td>抗组蛋白 H3（二甲基化 K4）抗体 [Y47] — ChIP 级（ab32356）</td><td>Abcam</td><td>ab32356</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 平底细胞培养板（6 孔）</td><td>Fisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 标准组织培养皿（10 cm）</td><td>Fisher</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor pico</td><td>Diagenode</td><td>B01010001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 氟光计 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>MinElute 反应纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>MinElute 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td></td></tr><tr><td>抗组蛋白 H4（三甲基化 K20）抗体 — ChIP 级（ab9053）</td><td>Abcam</td><td>ab9053</td><td></td></tr><tr><td>Labquake 旋转混合仪</td><td>Thermo Fisher</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 测序平台</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

carip-seq 与 chip-seq：在胚胎干细胞中鉴定染色质相关 rna 及蛋白质-dna 相互作用的方法

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

胚胎干细胞（ES细胞）的自我更新&#160;和分化受到外源性信号以及转录因子、表观遗传调控因子和组蛋白翻译后修饰等内在网络的共同调控，这些因素协同影响邻近基因的基因表达状态。RNA也被证实可与多种蛋白质相互作用，调控染色质动态&#160;和基因表达。染色质相关RNA免疫沉淀结合高通量测序（CARIP-Seq）是一种用于系统鉴定与染色质蛋白结合的RNA的新方法；而染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-Seq）则是一种强大的基因组学技术，可用于在全球范围内绘制胚胎干细胞中组蛋白翻译后修饰、转录因子和表观遗传修饰因子的定位图谱。本文中，我们描述了CARIP-Seq和ChIP-Seq的实验方法，包括高通量测序文库的构建，以获得胚胎干细胞中染色质相关RNA和表观基因组的全局图谱。

我们利用该ChIP-Seq方案成功检测了ES细胞中H3K4me3、H3K4me2和KDM5B的全基因组结合情况6. 胚胎干细胞在无饲养层条件下培养（图1），并按上述方法进行交联。随后按照ChIP-Seq方案第3.2步所述进行超声处理，并通过2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化效果图2。接下来，按照步骤4所述进行ChIP实验，并按照步骤6所述进行文库构建。ChIP-Seq文库在新一代测序平台上进行测序。代表性定制的UCSC浏览器视图显示，在核心多能性基因处存在H3K4me3、H3K4me2和KDM5B的富集 POU5F1 (图 3A），以及 HOXC 基因簇（图 3B）。CARIP-Seq 按照步骤 4-6 所述方案进行。代表性 UCSC 浏览器视图显示，在 ES 细胞中某一...

本文介绍了进行 ChIP-Seq 和 CARIP-Seq 的方法，包括用于下一代测序的文库构建，以在胚胎干细胞中生成全基因组表观遗传学和染色质相关 RNA 图谱。

CARIP-Seq 与 ChIP-Seq：在胚胎干细胞中鉴定染色质相关 RNA 及蛋白质-DNA 相互作用的方法

胚胎干细胞（ES细胞）的自我更新与分化受到外源性信号以及转录因子内在调控网络的共同调控，……

CARIP-Seq 的总体目标是全面检测与染色质相关的全基因组RNA。ChIP-Seq 的目标是在胚胎干细胞中全局性地评估蛋白质与DNA的相互作用。这些方法有助于回答表观遗传学和干细胞领域中的关键科学问题，识别转录因子或表观遗传调控因子在基因组上的结合位点、组蛋白修饰的占据情况，以及胚胎干细胞中与染色质相关的RNA。这些技术的主要优势在于能够无偏倚地在全基因组范围内检测与染色质组分相关的RNA，并实现蛋白质与DNA相互作用的全局鉴定。尽管这些方法可为胚胎干细胞生物学研究提供深入见解，但也可应用于其他哺乳动物细胞类型，以研究癌症生物学或其他人类疾病。为获取胚胎干细胞，首先需用磷酸盐缓冲液洗涤细胞。然后，使用预热至37摄氏度的0.25%胰蛋白酶消化细胞。胰酶处理后，将细胞重悬于预热的MEF培养基中，培养基中添加10%胎牛血清。接着，向锥形管中的细胞加入37%甲醛，使其终浓度为1%，于37摄氏度孵育8分钟，以交联细胞。为终止固定反应，向样品中加入预冷至4摄氏度的1.25摩尔甘氨酸，使其终浓度为0.125摩尔。然后将离心管置于旋转仪上，在室温下以每分钟8转的速度翻转5分钟。5分钟后，在室温下以300×g离心5分钟。离心结束后，弃去上清液。然后用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤沉淀，再次离心样品。接着，移除磷酸盐缓冲液，并将细胞在液氮中冷冻一分钟。将胚胎干细胞在冰上解冻后，用 2.5 毫升超声破碎缓冲液重悬细胞沉淀。若需研究转录因子或表观遗传因子，请将细胞沉淀重悬于不含十二烷基硫酸钠的超声破碎缓冲液中；若研究组蛋白修饰，则将细胞沉淀重悬于含有十二烷基硫酸钠的缓冲液中。接下来，进行染色质免疫沉淀时，在40%的振幅下超声处理染色质14至18个循环，每个循环为30秒开启、30秒暂停。为使染色质在蛋白因子ChIP中溶解，在超声缓冲液中加入28 µL的10%十二烷基硫酸钠。对于组蛋白修饰相关的蛋白因子，加入28 µL脱氧胆酸钠和0.28 mL的10% Triton X-100，并充分混匀。然后，在 4 摄氏度条件下，以 10,000g 离心样品 10 分钟，以预清除染色质。在 1.5 毫升低吸附离心管中，加入 40 微升 A 或 G 磁珠。随后，用 600 微升磷酸盐缓冲液洗涤磁珠，并将含有磁珠的离心管置于带有磁铁的支架上，室温孵育 1 分钟。然后，去除磷酸盐缓冲液，并再次将珠子重悬于100微升磷酸盐缓冲液中。向离心管中加入2至4微克抗体，置于旋转仪上，以每分钟8转的速度孵育40分钟，以促进抗体与珠子的结合。随后，加入200微升磷酸盐缓冲液洗涤珠子。洗涤后，将超声处理的染色质提取物置于4摄氏度下，在旋转仪上孵育过夜，以免疫沉淀染色质结合的蛋白质。次日，依次用RIPA缓冲液、含盐RIPA缓冲液、氯化锂缓冲液、含Triton X-100的Tris-EDTA缓冲液以及Tris-EDTA缓冲液洗涤磁珠，每种缓冲液均在旋转仪上孵育10分钟。为进行ChIP的解交联，将磁珠重悬于100微升Tris-EDTA缓冲液中。然后加入 3 µL 10% 十二烷基硫酸钠和 5 µL 20 mg/mL 蛋白酶 K，将磁珠在 65 °C 下孵育过夜。孵育结束后，次日将离心管颠倒数次，置于磁力架上，转移上清液至新的离心管中。随后，加入 100 µL 含 0.5 mol/L 氯化钠的 Tris-EDTA 缓冲液洗涤磁珠，并将两次获得的上清液合并。为了进行CARIP的去交联，将磁珠重悬于100微升Tris-EDTA缓冲液中。然后加入3微升10%十二烷基硫酸钠和5微升20毫克/毫升蛋白酶K，将磁珠在65摄氏度孵育4至12小时。再次轻轻倒置离心管数次，置于磁力架上，将上清液转移至新的离心管中。然后，加入含有 0.5 摩尔氯化钠的 100 微升 Tris-EDTA 缓冲液洗涤磁珠，随后合并两次上清液。最后，使用酚-氯仿-异戊醇按 25:24:1 的体积比抽提 RNA 样品。接下来，用 DNase 去除与染色质结合的免疫沉淀 RNA 样品中的 DNA。然后，向CARIP样品中加入10X DNase缓冲液，并将终浓度调整至1X。随后，将样品在37摄氏度孵育30分钟。接下来，通过加入10.5微升RNA和1微升浓度为3微克/毫升的随机六聚体引物，配制PCR反应体系，以合成互补DNA的第一条链。为了变性二级结构，首先将离心管在65 °C下孵育5分钟，然后置于冰上2分钟。接着，向PCR管中加入预混液，在25 °C下孵育2分钟。随后，加入1 µL浓度为200单位/µL的Superscript II反转录酶，并运行热循环程序。为了合成互补DNA的第二条链，先在冰上加入试剂、缓冲液和酶来配制反应体系。然后轻轻涡旋混匀，并在16摄氏度孵育2小时。DNA合成完成后，使用PCR纯化试剂盒纯化互补DNA。然后，对双链DNA进行片段化处理，使用水浴超声破碎仪和1.5毫升离心管，将DNA打断至250至500个碱基对的大小，超声处理三次，每次10分钟，或四次，每次10分钟。随后，构建文库并进行下一代测序。此处，通过相差显微镜拍摄了胚胎干细胞的图像，以观察干细胞集落。在本实验方案中，将细胞培养在含有或不含经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基中，并添加白血病抑制因子（LIF）和/或GSK3抑制剂（GSK3i），以防止细胞发生分化。随后，为了观察交联的胚胎干细胞染色质超声处理的效率，将超声处理后的双链DNA上样至2%琼脂糖凝胶。凝胶图像显示染色质被剪切为200至500个碱基对的片段。接下来，利用下一代测序平台构建并测序了ChIP-Seq文库，以评估组蛋白修饰酶及组蛋白修饰在胚胎干细胞中的全基因组占据情况。从自定义的UCSC浏览器视图中可见，在核心多能性调控基因POU5F1以及HOXC基因簇处，富集了H3K4三甲基化、H3K4二甲基化以及KDM5B信号。此外，还进行了CARIP-Seq分析，以评估胚胎干细胞中与染色质相关的RNA。自定义的 UCSC 浏览器视图显示了与 H4K20 三甲基化相关的 RNA 以及在胚胎干细胞中 H4K20 三甲基化的占据情况。根据 CARIP-Seq 的结果可以解读出，尽管该 RNA 与 H4K20 三甲基化相关，但它可能并不与特定的基因座发生相互作用。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四天内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用CARIP-Seq技术对染色质相关RNA进行分析，并在胚胎干细胞中全局范围内鉴定蛋白质与DNA的相互作用。

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基因转录的精细调控是胚胎细胞命运决定的基础。本文描述了染色质免疫沉淀实验，用于研究干细胞向心肌细胞分化以及小鼠胚胎心脏发育过程中的表观遗传调控机制。...

胚胎干细胞和组织心肌分化的表观遗传调控

我们描述了染色质内源性切割联合高通量测序技术（ChEC-seq），这是一种与染色质免疫沉淀（ChIP）正交的方法，利用微球菌核酸酶（MNase）融合蛋白在全基因组范围内定位蛋白质结合位点。...

全基因组范围内利用 ChEC-seq 技术在 Saccharomyces cerevisiae 中绘制蛋白质-DNA 相互作用图谱

本文介绍了一种染色质免疫沉淀（ChIP）及ChIP-seq文库构建方案，用于从稀有鸡胚样本中生成全基因组表观基因组谱图。...

低丰度胚胎样本的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案

我们描述了一种串联染色质免疫沉淀测序（tChIP-Seq）的逐步实验方案，该方法可用于分析特定细胞类型的全基因组组蛋白修饰。...

TChIP-Seq：细胞类型特异性表观基因组分析

精确测定蛋白质在整个基因组上的结合位点对于理解基因调控至关重要。本文描述了一种 基因组定位方法，该方法对染色质免疫沉淀获得的DNA进行外切酶消化处理（ChIP-exo），随后进行高通量测序。该方法可在哺乳类神经元中以接近单碱基对分辨率和高信噪比检测蛋白质-DNA相互作用。...

利用染色质免疫沉淀-外切酶技术（ChIP-Exo）在小鼠干细胞来源的神经元中进行蛋白质-DNA相互作用的高分辨率作图

本方案提供了一条简化的计算流程，用于定量新生增强子转录本。通过整合染色质可及性、染色质特征和转录数据，该方法能够在复杂的基因内区域实现对增强子活性的准确检测和链特异性分析，同时适用于不具备深入生物信息学训练背景的研究人员。...

小鼠胚胎干细胞中基因间/基因内增强子RNA定量的计算分析流程

本文介绍了一种用于捕获与RNA相关的染色质DNA-DNA相互作用的实验方案，以绘制RNA相关的三维基因组结构图谱。...

RNA相关染色质DNA-DNA相互作用方法

一种基于紫外光的 ChIRP 方法用于鉴定长链非编码 RNA...

一种基于紫外光的 ChIRP 方法用于可验证地鉴定与长链非编码 RNA 直接相互作用的蛋白质：从培养细胞到小鼠睾丸

学习ChIP-Seq和CARIP-Seq技术，用于胚胎干细胞中蛋白质-DNA相互作用和染色质相关RNA的全基因组分析。这些方法可揭示表观遗传调控机制，助力癌症等疾病研究。

CARIP-Seq 与 ChIP-Seq：在胚胎干细胞中鉴定染色质相关 RNA 及蛋白质-DNA 相互作用的方法

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