CARIP-Seq 与 ChIP-Seq：在胚胎干细胞中鉴定染色质相关 RNA 及蛋白质-DNA 相互作用的方法

CARIP-Seq 的总体目标是全面检测与染色质相关的全基因组RNA。ChIP-Seq 的目标是在胚胎干细胞中全局性地评估蛋白质与DNA的相互作用。这些方法有助于回答表观遗传学和干细胞领域中的关键科学问题，识别转录因子或表观遗传调控因子在基因组上的结合位点、组蛋白修饰的占据情况，以及胚胎干细胞中与染色质相关的RNA。

这些技术的主要优势在于能够无偏倚地在全基因组范围内检测与染色质组分相关的RNA，并实现蛋白质与DNA相互作用的全局鉴定。尽管这些方法可为胚胎干细胞生物学研究提供深入见解，但也可应用于其他哺乳动物细胞类型，以研究癌症生物学或其他人类疾病。为获取胚胎干细胞，首先需用磷酸盐缓冲液洗涤细胞。

然后，使用预热至37摄氏度的0.25%胰蛋白酶消化细胞。胰酶处理后，将细胞重悬于预热的MEF培养基中，培养基中添加10%胎牛血清。接着，向锥形管中的细胞加入37%甲醛，使其终浓度为1%，于37摄氏度孵育8分钟，以交联细胞。

为终止固定反应，向样品中加入预冷至4摄氏度的1.25摩尔甘氨酸，使其终浓度为0.125摩尔。然后将离心管置于旋转仪上，在室温下以每分钟8转的速度翻转5分钟。5分钟后，在室温下以300×g离心5分钟。

离心结束后，弃去上清液。然后用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤沉淀，再次离心样品。接着，移除磷酸盐缓冲液，并将细胞在液氮中冷冻一分钟。

将胚胎干细胞在冰上解冻后，用 2.5 毫升超声破碎缓冲液重悬细胞沉淀。若需研究转录因子或表观遗传因子，请将细胞沉淀重悬于不含十二烷基硫酸钠的超声破碎缓冲液中；若研究组蛋白修饰，则将细胞沉淀重悬于含有十二烷基硫酸钠的缓冲液中。

接下来，进行染色质免疫沉淀时，在40%的振幅下超声处理染色质14至18个循环，每个循环为30秒开启、30秒暂停。为使染色质在蛋白因子ChIP中溶解，在超声缓冲液中加入28 µL的10%十二烷基硫酸钠。对于组蛋白修饰相关的蛋白因子，加入28 µL脱氧胆酸钠和0.28 mL的10% Triton X-100，并充分混匀。

然后，在 4 摄氏度条件下，以 10,000g 离心样品 10 分钟，以预清除染色质。在 1.5 毫升低吸附离心管中，加入 40 微升 A 或 G 磁珠。随后，用 600 微升磷酸盐缓冲液洗涤磁珠，并将含有磁珠的离心管置于带有磁铁的支架上，室温孵育 1 分钟。

然后，去除磷酸盐缓冲液，并再次将珠子重悬于100微升磷酸盐缓冲液中。向离心管中加入2至4微克抗体，置于旋转仪上，以每分钟8转的速度孵育40分钟，以促进抗体与珠子的结合。随后，加入200微升磷酸盐缓冲液洗涤珠子。

洗涤后，将超声处理的染色质提取物置于4摄氏度下，在旋转仪上孵育过夜，以免疫沉淀染色质结合的蛋白质。次日，依次用RIPA缓冲液、含盐RIPA缓冲液、氯化锂缓冲液、含Triton X-100的Tris-EDTA缓冲液以及Tris-EDTA缓冲液洗涤磁珠，每种缓冲液均在旋转仪上孵育10分钟。为进行ChIP的解交联，将磁珠重悬于100微升Tris-EDTA缓冲液中。

然后加入 3 µL 10% 十二烷基硫酸钠和 5 µL 20 mg/mL 蛋白酶 K，将磁珠在 65 °C 下孵育过夜。孵育结束后，次日将离心管颠倒数次，置于磁力架上，转移上清液至新的离心管中。随后，加入 100 µL 含 0.5 mol/L 氯化钠的 Tris-EDTA 缓冲液洗涤磁珠，并将两次获得的上清液合并。

为了进行CARIP的去交联，将磁珠重悬于100微升Tris-EDTA缓冲液中。然后加入3微升10%十二烷基硫酸钠和5微升20毫克/毫升蛋白酶K，将磁珠在65摄氏度孵育4至12小时。再次轻轻倒置离心管数次，置于磁力架上，将上清液转移至新的离心管中。

然后，加入含有 0.5 摩尔氯化钠的 100 微升 Tris-EDTA 缓冲液洗涤磁珠，随后合并两次上清液。最后，使用酚-氯仿-异戊醇按 25:24:1 的体积比抽提 RNA 样品。接下来，用 DNase 去除与染色质结合的免疫沉淀 RNA 样品中的 DNA。

然后，向CARIP样品中加入10X DNase缓冲液，并将终浓度调整至1X。随后，将样品在37摄氏度孵育30分钟。接下来，通过加入10.5微升RNA和1微升浓度为3微克/毫升的随机六聚体引物，配制PCR反应体系，以合成互补DNA的第一条链。

为了变性二级结构，首先将离心管在65 °C下孵育5分钟，然后置于冰上2分钟。接着，向PCR管中加入预混液，在25 °C下孵育2分钟。随后，加入1 µL浓度为200单位/µL的Superscript II反转录酶，并运行热循环程序。

为了合成互补DNA的第二条链，先在冰上加入试剂、缓冲液和酶来配制反应体系。然后轻轻涡旋混匀，并在16摄氏度孵育2小时。DNA合成完成后，使用PCR纯化试剂盒纯化互补DNA。

然后，对双链DNA进行片段化处理，使用水浴超声破碎仪和1.5毫升离心管，将DNA打断至250至500个碱基对的大小，超声处理三次，每次10分钟，或四次，每次10分钟。随后，构建文库并进行下一代测序。此处，通过相差显微镜拍摄了胚胎干细胞的图像，以观察干细胞集落。

在本实验方案中，将细胞培养在含有或不含经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基中，并添加白血病抑制因子（LIF）和/或GSK3抑制剂（GSK3i），以防止细胞发生分化。随后，为了观察交联的胚胎干细胞染色质超声处理的效率，将超声处理后的双链DNA上样至2%琼脂糖凝胶。凝胶图像显示染色质被剪切为200至500个碱基对的片段。

接下来，利用下一代测序平台构建并测序了ChIP-Seq文库，以评估组蛋白修饰酶及组蛋白修饰在胚胎干细胞中的全基因组占据情况。从自定义的UCSC浏览器视图中可见，在核心多能性调控基因POU5F1以及HOXC基因簇处，富集了H3K4三甲基化、H3K4二甲基化以及KDM5B信号。此外，还进行了CARIP-Seq分析，以评估胚胎干细胞中与染色质相关的RNA。

自定义的 UCSC 浏览器视图显示了与 H4K20 三甲基化相关的 RNA 以及在胚胎干细胞中 H4K20 三甲基化的占据情况。根据 CARIP-Seq 的结果可以解读出，尽管该 RNA 与 H4K20 三甲基化相关，但它可能并不与特定的基因座发生相互作用。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四天内完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用CARIP-Seq技术对染色质相关RNA进行分析，并在胚胎干细胞中全局范围内鉴定蛋白质与DNA的相互作用。