CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

CARIP-Seq 的总体目标是研究全基因组染色质相关 RNA。ChIP-Seq 的目标是在全球范围内评估胚胎干细胞中的蛋白质-DNA 相互作用。这些方法可以帮助回答表观遗传学和干细胞领域的关键问题，确定胚胎干细胞中的基因组位置转录因子或表观遗传调节因子结合或组蛋白修饰占有率或染色质相关 RNA。

这些技术的主要优点是它们允许对与染色质成分相关的 RNA 进行全基因组无偏面询问，并对蛋白质 DNA 相互作用进行全局鉴定。虽然这些方法可以深入了解胚胎干细胞生物学，但它们也可以应用于其他哺乳动物细胞类型，以研究癌症生物学或其他人类疾病。要收获胚胎干细胞，请先用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞。

然后，用预热至 37 摄氏度的 0.25% 胰蛋白酶分离细胞。胰蛋白酶消化后，将细胞重悬于预热的 MEF 培养基中，补充有 10% 胎牛血清。然后，将 37% 甲醛添加到锥形管中的细胞中，至终浓度为 1%，并在 37 摄氏度下孵育 8 分钟以交联细胞。

为了终止固定反应，加入 1.25 摩尔甘氨酸，在 4 摄氏度下预冷至终浓度为 0.125 摩尔。然后，将试管放在旋转器上，在室温下以每分钟 8 转的速度倒置 5 分钟。5 分钟后，在室温下以 300 g 离心样品 5 分钟。

离心结束后，弃去上清液。然后，用预冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤沉淀，并再次离心样品。然后，去除磷酸盐缓冲盐水，将细胞在液氮中冷冻一分钟。

干细胞在冰上解冻后，将沉淀重悬于 2.5 mL超声处理缓冲液中。为了研究转录因子或表观遗传因子，将细胞沉淀重悬于不含十二烷基硫酸钠的超声处理缓冲液中。对于组蛋白修饰，将细胞沉淀重悬于含有十二烷基硫酸钠的缓冲液中。

接下来，对于染色质免疫沉淀，以 40% 振幅对染色质进行 14 至 18 个循环，开启 30 秒，休息 30 秒。为了溶解蛋白质因子 ChIP 的染色质，在超声处理缓冲液中补充 28 μL 10% 十二烷基硫酸钠。对于组蛋白修饰中的蛋白质因子，加入 28 微升脱氧胆酸钠和 0.28 毫升 10% Triton X-100 并充分混合。

然后，将样品在 10， 000g 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟，以预清除染色质。在 1.5 mL 低结合管中，加入 40 μL A 或 G 磁珠。然后，用 600 μL 磷酸盐缓冲盐水洗涤珠子，将装有珠子的试管转移到装有磁铁的架子上，并在室温下孵育一分钟。

然后，去除磷酸盐缓冲盐水，并再次将珠子重悬于 100 微升磷酸盐缓冲盐水中。向试管中加入 2 至 4 μg 抗体，并以每分钟 8 转的速度放在旋转器上孵育 40 分钟，以促进抗体与磁珠结合。然后，加入 200 微升磷酸盐缓冲盐水来洗涤珠子。

洗涤后，将超声处理的染色质提取物在旋转器上于 4 摄氏度孵育过夜，以免疫沉淀染色质结合的蛋白质。第二天，洗涤磁珠，并与 RIPA 缓冲液、含盐的 RIPA 缓冲液、氯化锂缓冲液、含 Triton X-100 的 Tris-EDTA 缓冲液和 Tris-EDTA 缓冲液一起在旋转器上孵育 10 分钟。要去交联以进行 ChIP，请将磁珠重悬于 100 μL Tris-EDTA 缓冲液中。

然后加入 3 微升 10% 十二烷基硫酸钠和 5 微升每毫升 20 毫克蛋白酶 K，并将珠子在 65 摄氏度下孵育过夜。孵育后，第二天，将试管倒置数次，将它们放在磁架上，然后将上清液转移到新试管中。然后，加入 100 微升含有 0.5 摩尔氯化钠的 Tris-EDTA 缓冲液洗涤磁珠，并混合两种上清液。

要对 CARIP 进行去交联，请将珠子重悬于 100 微升 Tris-EDTA 缓冲液中。然后，加入 3 微升 10% 十二烷基硫酸钠和 5 微升每毫升 20 毫克蛋白酶 K，并将微珠在 65 摄氏度下孵育 4 至 12 小时。再次将试管倒置数次并放在磁力架上，将上清液转移到新试管中。

然后，加入 100 微升含有 0.5 摩尔氯化钠的 Tris-EDTA 缓冲液洗涤磁珠，然后混合两种上清液。最后，使用酚氯仿异戊醇以 25 至 24 比 1 体积比分离 RNA 样品。接下来，使用 DNase 从染色质相关免疫沉淀的 RNA 样品中去除 DNA。

然后，向 CARIP 样品中加入 10X DNase 缓冲液，并将最终体积调整至 1X 浓度。然后，将样品在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。接下来，通过添加 10.5 μL RNA 和 1 μL 每毫升 3 μg 随机六聚体引物来构建 PCR 反应，合成第一链互补 DNA。

要使二级结构变性，首先将试管在 65 摄氏度下孵育 5 分钟，然后在冰上孵育 2 分钟。然后，将预混液添加到 PCR 管中，并在 25 摄氏度下孵育 2 分钟。然后，每微升上标 2 添加 1 微升 200 单位，并运行热循环仪程序。

要合成第二链互补 DNA，请添加试剂、缓冲液和酶，在冰上构建反应体系。然后，涡旋以轻轻混合试剂，并在 16 摄氏度下孵育 2 小时。合成 DNA 后，使用 PCR 纯化试剂盒纯化互补的 DNA。

然后，对双链 DNA 进行碎片整理，使用水浴超声器和 1.5 毫升试管将 DNA 共享成 250 至 500 个碱基对的大小，持续 3 次 10 分钟或 4 次 10 分钟。然后，准备文库并进行下一代测序。在这里，捕获了胚胎干细胞的相差图像以可视化干细胞集落。

在该方案中，在存在或不存在有丝分裂灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的情况下，在培养基中使用 LIF 和/或 GSK3i 培养细胞，以防止细胞分化。然后，为了观察交联胚胎干细胞染色质的超声处理效率，将超声处理的双链 DNA 上样到 2% 琼脂糖凝胶上。凝胶图像显示剪切的染色质在 200 到 500 个碱基对范围内。

接下来，使用下一代测序平台生成 ChIP-Seq 文库并对其进行测序，以评估组蛋白修饰酶和组蛋白修饰在胚胎干细胞中的全基因组占有率。从自定义 UCSC 浏览器视图中，在核心多能性调节因子基因 POU5F1 和 HOXC 簇处可以看到富集的 H3K4 三甲基化、H3K4 二甲基化和 KDM5B。还进行了 CARIP-Seq 分析以评估胚胎干细胞中的染色质相关 RNA。

自定义 UCSC 浏览器视图显示了胚胎干细胞中 H4K20 三甲基化相关 RNA 和 H4K20 三甲基化占有率。从 CARIP-Seq 结果可以解释为，尽管 RNA 与 H4K20 三甲基化相关，但它可能不会与特定基因座相互作用。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四天内完成。

观看本视频后，您应该对如何使用 CARIP-Seq 研究染色质相关 RNA 以及在全球范围内鉴定胚胎干细胞中蛋白质 DNA 的相互作用有很好的了解。