Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

本实验的总体目标是测试某些神经元的激光消融对回路活动和行为的影响。通过这种实验技术，我们可以检查神经元在潜在行为回路中的必要性。这种方法可以帮助回答我们在行为和神经科学领域的关键问题，例如如何感知猎物以及神经活动如何产生捕获的猎物行为。

该技术的主要优点是神经元可以被特异性消融，因为这些神经元的遗传标记以及激光的高空间分辨率。根据文本方案培养幼虫并将其安装在 2% 低熔点琼脂糖中后，将琼脂糖包埋的幼虫置于双光子激光扫描显微镜下并启动显微镜系统。打开图像采集软件，然后在激光选项卡下单击打开按钮以打开激光。

等待激光器的状态从繁忙变为模式锁定。在 channels（通道）选项卡上，将激光的波长设置为 880 纳米（EGFP 消融）或 800 纳米（GCaMP 消融）。通过手动移动镜头旋转器选择 20X 主观镜头。

然后，点击定位选项卡，点击 GFP 改变光路，直接用肉眼查看荧光。将斑马鱼幼虫大脑置于视野中心，然后单击"采集"选项卡返回双光子显微镜并设置激光功率和增益。作为消融前条件的记录，单击 Z 堆栈以选择 Z 堆栈选项。

然后，在聚焦在幼虫大脑的腹侧端后，点击设置第一个按钮设置下限，在关注大脑最背端后，点击设置最后一个按钮设置上限。最后，单击 start experiment 按钮运行 Z 堆栈图像采集。接下来，通过手动移动镜头旋转器选择 63X 主观镜头。

然后，单击定位选项卡切换到落射荧光显微镜。将要通过眼睛消融的细胞居中，然后单击 Acquisition 选项卡返回激光扫描显微镜。在采集模式选项卡中，将帧大小设置为 256 x 256。

单击 live 并观察感兴趣的神经元。然后，从最背面开始，找到一个焦平面，其中要消融的细胞聚焦。使用区域功能，在每个神经元上标记一个直径约为 1/3 细胞大小的小圆形区域作为 ROI。

将扫描速度设置为每 256 x 256 像素 13.9 秒，这对应于激光驻留时间，大约为每像素 200 微秒或每半微米 200 微秒。此外，将迭代周期设置为 4 次重复。单击 Start experiment 以执行时间序列和漂白函数。

在时间序列周期中将消融前的图像与消融后的图像进行比较，以确保目标细胞中的荧光消失。接下来，将焦平面稍微移得更深，然后选择出现未消融细胞的下一个焦平面。执行刚才演示的漂白功能并重复该过程，直到感兴趣的神经结构中的所有细胞都被消融。

消融后，检查细胞是否消除荧光，并在必要时重复激光照射。照射后，幼虫需要恢复。小心地在幼虫周围的琼脂糖上做微小的垂直切口。

然后，等待鱼在麻醉剂消失时自行从琼脂糖中游出。根据文本方案培养草履虫并麻醉斑马鱼幼虫后，将幼虫放入 2% 低熔点琼脂糖中，并立即去除任何多余的琼脂糖，使琼脂糖表面看起来略微凸起。使用解剖针快速将幼虫定位在直立位置。

然后，用手术刀在琼脂糖上切几个小切口，以去除斑马鱼头周围的琼脂糖，从而为草履虫游泳腾出空间。将系统水轻轻倒入腔室，小心地去除残留的琼脂糖。接下来，在记录室中放置一株草履虫作为视觉刺激。

然后将记录室放在配备科学 CMOS 相机的落射荧光显微镜下，并选择 2.5 倍物镜。启动配备的相机的图像采集应用程序。单击 序列 窗格，然后选择 硬盘记录 在窗格上。

在扫描设置部分，将帧数设置为 900 或所需的任何其他总帧数。在捕获窗格中，将曝光时间设置为 30 毫秒，并将像素合并设置为 2 x 2。单击捕获窗格上的 live 以在相机视图和焦点中找到幼虫，然后单击 Stop live 并单击开始按钮。

以 cxd 格式保存影片，并根据文本协议分析数据。设置行为记录系统并根据文本协议将幼虫放入记录室后，使用微量移液器收集 50 个草履虫并将它们放入记录室中。要将盖玻片放在记录室的顶部，请在盖玻片上滴一小滴水，然后再将其放在记录室的水面上，以避免将空气引入记录室。

将记录室置于照明系统中。然后，以每秒 10 帧的速度开始延时录制 11 分钟。最后，根据文本协议进行分析。

在这个实验中，使用标记盖前区域细胞核和嗅球神经元亚群的 Gal4 系。顶盖前神经元双侧激光消融。嗅觉神经元作为对照消融。

结果表明，双光子激光可以消融目标细胞，同时不影响相邻的神经突。在该实验中，研究了将其轴突向同侧 ILH 投射的顶盖前神经元的功能连接。前盖和 ILH 在猎物的近端存在时都显示出神经元活动，这表明这两种神经元活动都是视觉驱动的。

钙成像还用于观察盖前神经元消融幼虫中神经元的活动和 ILH。激光消融的左侧前盖显示残余或无神经元活动。此外，同侧 ILH 显示显着移位的神经元活动，表明 ILH 的主要输入来自同侧前盖。

相比之下，激光消融前盖另一侧的 ILH 显示出与同侧前盖中的神经元活动相当的神经元活动，这表明右侧 ILH 正在接收来自右侧前盖的输入。一旦掌握，每个斑马鱼幼虫的激光消融可以在大约一小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住仅通过适当的激光照射对目标神经元进行消融，以避免激光的热损伤。

按照此程序，可以对其他大脑区域（如前脑或后脑）中的神经元进行消融，以回答诸如这些神经元如何参与认知功能或运动功能等附加问题。开发后，这项技术为行为神经科学领域的研究人员探索斑马鱼模型中的功能神经回路铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何专门激光消融斑马鱼幼虫大脑中的神经元并评估功能和行为后果有很好的了解。

不要忘记，使用激光可能非常危险，并且在执行此程序时请始终遵守制造商的说明。