使用双光子激光消融神经元群体及其在斑马鱼幼鱼中通过钙成像与行为记录进行评估

本实验的总体目标是检测特定神经元的激光消融对神经环路活动和行为的影响。通过该实验技术，我们可以检验神经元在介导行为的神经环路中的必要性。该方法有助于回答行为学与神经科学领域的关键问题，例如猎物如何被感知，以及神经活动如何产生捕食行为。

该技术的主要优势在于，由于这些神经元具有遗传标记，且激光具有高空间分辨率，因此可以特异性地消融神经元。按照文本方案将幼虫培养并置于2%低熔点琼脂糖中固定后，将包埋在琼脂糖中的幼虫置于双光子激光扫描显微镜下，并启动显微镜系统。打开图像采集软件，在激光选项卡下点击“开启”按钮以启动激光。

等待激光器状态从“忙碌”变为“锁模”。在通道选项卡中，将激光器波长设置为 880 纳米以进行 EGFP 消融，或设置为 800 纳米以进行 GCaMP 消融。通过手动旋转物镜转盘选择 20X 物镜。

然后，点击定位选项卡，点击GFP以切换光学通路，通过目镜直接观察荧光。将斑马鱼幼体脑部置于视野中央，然后点击采集选项卡，返回双光子显微镜界面，并设置激光功率和增益。为记录消融前的状态，点击Z层扫描以选择Z层扫描选项。

然后，将焦点对准幼虫脑的腹侧末端，单击“设置起始”按钮以设定下限；再将焦点对准脑背侧最表面，单击“设置终止”按钮以设定上限。最后，单击“开始实验”按钮以运行Z轴层扫图像采集。接下来，通过手动旋转物镜转盘选择63X物镜。

然后，单击定位选项卡以切换至落射荧光显微镜模式。通过肉眼将待消融的细胞置于视野中央，随后单击采集选项卡返回激光扫描显微镜模式。在采集模式选项卡中，将帧尺寸设置为 256 × 256。

点击实时观察，查看目标神经元。然后，从背侧最上方开始，找到一个焦平面，使待消融的细胞处于清晰对焦状态。使用区域功能，在每个神经元上标记一个直径约为细胞大小三分之一的微小圆形区域作为感兴趣区域（ROI）。

将扫描速度设置为每256×256像素13.9秒，对应每个像素的激光驻留时间约为200微秒，或每0.5微米200微秒。同时，将迭代周期设置为四次重复。点击“开始实验”以执行时间序列和漂白功能。

在时间序列循环中，将消融前的图像与消融后的图像进行比较，以确认靶向细胞中的荧光信号已消失。接着，将焦平面略微调深，选择下一个未消融细胞出现的焦平面。执行如前所述的漂白功能，并重复此过程，直至目标神经结构中的所有细胞均被消融。

消融后，检查细胞的荧光是否消失，必要时重复激光照射。照射后需要恢复幼虫。在幼虫周围的琼脂糖中小心地做微小的垂直切割。

然后，等待麻醉效果消退后，斑马鱼幼鱼自行从琼脂糖中游出。根据文本方案培养草履虫并麻醉斑马鱼幼鱼后，将幼鱼放入2%低熔点琼脂糖中，并立即去除多余的琼脂糖，使琼脂糖表面呈轻微凸起状。使用解剖针迅速将幼鱼调整为直立位置。

然后，使用手术刀在琼脂糖上做几个小切口，以去除斑马鱼头部周围的琼脂糖，从而为草履虫的游动腾出空间。通过轻轻向记录 chamber 中倒入系统用水，小心去除残留的琼脂糖。接着，将一个草履虫放入记录 chamber 中，作为视觉刺激物。

然后将记录室置于配备科学级CMOS相机的落射荧光显微镜下，并选择2.5倍物镜。启动所配相机的图像采集程序。点击序列窗格，并在该窗格中选择硬盘记录。

在扫描设置部分，将帧数设置为900或任何其他所需的总帧数。在采集面板中，将曝光时间设为30毫秒，像素合并设为2×2。点击采集面板上的“实时”按钮，以在相机视野中定位幼虫并进行聚焦，然后点击“停止实时”，再点击“开始”按钮。

将视频保存为 cxd 格式，并根据文本方案分析数据。按照文本方案设置行为记录系统，并将一条幼虫放入记录室后，使用微量移液器收集 50 个草履虫并将其放入记录室中。在记录室上方加盖盖玻片时，应先在盖玻片上滴加一滴水，再将其置于记录室的水面上，以避免将空气带入记录室。

将记录室置于照明系统中。然后，以每秒10帧的速度开始连续拍摄，持续11分钟。最后，根据文本方案进行分析。

在本实验中，使用标记前顶区细胞核及嗅球部分神经元的Gal4品系。对前顶区神经元进行双侧激光消融，以嗅球神经元的消融作为对照。

结果显示，双光子激光能够消融靶向细胞，同时不影响邻近的神经突。本实验研究了轴突同侧投射至间脑后部（ILH）的前顶盖神经元的功能连接性。前顶盖和间脑后部（ILH）在猎物临近时均表现出神经元活动，表明这两种神经元活动均由视觉驱动。

钙成像还被用于观察中脑顶盖区神经元消融幼鱼中顶盖区和间脑后部（ILH）的神经元活动。经激光消融的左侧顶盖区表现出残余甚至无神经元活动。此外，同侧的ILH显示出显著偏移的神经元活动，提示ILH的主要输入来源于同侧顶盖区。

相比之下，激光消融后对侧的背侧间脑（ILH）表现出与同侧顶盖前区神经元活动相似的活性，这表明右侧ILH正在接收来自右侧顶盖前区的输入。一旦掌握该技术，每条斑马鱼幼鱼的激光消融操作约需一小时即可完成。在进行该操作时，重要的是需牢记仅对目标神经元进行精确的激光照射消融，同时避免激光造成的热损伤。

通过该方法，可对其他脑区（如前脑或后脑）的神经元进行消融，以回答更多科学问题，例如这些神经元如何参与认知功能或运动功能。该技术建立后，为行为神经科学领域的研究人员探索斑马鱼模型中的功能性神经环路开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何在斑马鱼幼体脑中特异性地进行激光消融神经元操作，并评估其功能及行为学后果。

请务必注意，使用激光器可能具有极高的危险性，在执行此操作时应始终遵守制造商的说明。