Name: 用双光子激光消融神经种群及其对斑马鱼幼虫钙成像和行为记录的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学习双光子激光消融技术用于斑马鱼幼虫神经回路研究。该方法通过精准靶向特定神经元群体，结合钙成像与行为记录，揭示捕食行为背后的神经机制，为神经科学研究提供可靠的功能分析手段。

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这些研究由日本文部科学省（MEXT）以及日本学术振兴会（JSPS）科研费资助，项目编号分别为JP25290009、JP25650120、JP17K07494和JP17H05984。

1. 使用双光子激光显微镜消融特定神经元亚群
注意：如果用户计划在消融后进行钙成像，请使用 UAShspzGCaMP6s 品系21。如果用户计划在消融后进行行为记录，请使用 UAS:EGFP 品系，因为消融 EGFP 阳性细胞比消融表达 GCaMP6s 的细胞更容易操作。
<ol>
	<li>首先建立携带Gal4的果蝇品系与UAS:EGFP或UAShspzGCaMP6s品系的杂交，以标记待研究的特定神经元。务必使用 珍珠层 以便为双亲提供背景信息 珍珠层 可获得纯合子。 
	注意： 纯合子 珍珠层 体表不含黑色素细胞（图1B）。在本研究中，使用了标记顶盖前区的 Gal4 品系 gSAIzGFFM119B 和标记间脑后部外侧区（ILH）的另一个 Gal4 品系 hspGFFDMC76A21.</li>
	<li>在设置交配后的第二天，收集斑马鱼卵，并将其培育至幼体阶段，此时目标神经元将表达荧光报告基因。</li>
	<li>将斑马鱼幼鱼固定在2%低熔点琼脂糖中（图1B).
	<ol>
		<li>首先制备2%琼脂糖储备液：将2 g低熔点琼脂糖粉末溶于100 mL系统用水中（即用于在循环水系统中饲养成年斑马鱼的水22 或 E3 水23通过将水在微波炉中加热至沸腾并剧烈搅拌。</li>
		<li>将2%低熔点琼脂糖储备液微波加热至沸腾。取3.5–4.0 mL琼脂糖溶液倒入6 cm培养皿的皿盖中。待琼脂糖冷却至触感温热后，再进行后续操作。</li>
		<li>接下来，将一只幼虫（此步骤无需麻醉）放入琼脂糖中。使用解剖针不断调整幼虫的位置和方向，使其保持直立状态。图1C），直至琼脂糖凝固，以确保幼虫处于正确位置。 
		注意： 幼虫将在琼脂糖凝固过程中继续游动。</li>
		<li>幼虫定位后，静置5分钟，使琼脂糖完全凝固。</li>
		<li>在琼脂糖上加入5 mL三卡因溶液（0.4%，1x工作浓度）。 
		注意： 为避免激光消融过程中幼虫移动，必须在整个消融过程中保持幼虫处于麻醉状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用双光子激光显微镜系统的漂白功能消融幼虫。
	<ol>
		<li>将琼脂糖包埋的幼虫置于双光子激光扫描显微镜下，启动显微成像系统。</li>
		<li>启动图像采集软件并点击 &#34;开启&#34; 按钮 &#34;激光&#34; 按 Tab 键以打开激光器（图1D）。等待 &#34;状态&#34; 激光的波长发生变化 &#34;繁忙&#34; 到 &#34;锁模。&#34;</li>
		<li>在 &#34;通道&#34; 设置激光波长为880 nm（最大功率：约2,300 mW）用于EGFP消融，或设置为800 nm（最大功率：约2,600 mW）用于GCaMP消融。</li>
		<li>手动旋转物镜转盘以选择20倍物镜。点击 &#34;定位&#34; 标签，点击 &#34;GFP&#34; 改变光路，并通过肉眼直接观察荧光。</li>
		<li>将斑马鱼幼体脑部置于视野中央，然后点击 &#34;采集&#34; 按 Tab 键返回双光子显微镜。</li>
		<li>作为消融前状态的记录，使用20倍物镜以快速扫描模式采集z轴层扫图像（以避免热损伤）。随后将消融前与消融后实验所获得的图像进行对比。图2A）。要获取z轴层叠图像，单击 &#34;Z轴层扫&#34; 选择z轴堆叠选项并展开该标签页。设置下限（点击 &#34;设置初始值&#34; 按钮&#34;) 在聚焦于幼虫脑腹侧末端后，设置上限（点击 &#34;设置最后&#34; 在聚焦于大脑最背侧表面后，点击按钮。然后，点击 &#34;开始实验&#34; 点击按钮以运行z轴层扫图像采集。</li>
		<li>通过手动旋转物镜转盘，选择63倍物镜。</li>
		<li>点击 &#34;定位&#34; 切换至落射荧光显微镜，通过肉眼观察将待消融的细胞移至视野中央，然后点击 &#34;采集&#34; 按 Tab 键返回激光扫描显微镜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 &#34;采集模式&#34; 标签，设置 &#34;帧大小&#34; 256 × 256。单击 &#34;活体&#34; 观察目标神经元。</li>
	<li>从背侧最上方开始，找到一个焦平面，使待消融的细胞处于清晰对焦状态。</li>
	<li>在每个神经元上标记一个直径约为细胞大小三分之一的小圆形区域作为感兴趣区域（ROI），使用 &#34;区域&#34; 功能。</li>
	<li>将扫描速度设置为13.93秒/256×256像素（134.42 µm × 134.42 µm），对应激光驻留时间约为200 µs/像素，或200 µs/0.5 µm。同时设置4次重复（“迭代周期：4”）。或者，可优化迭代次数和扫描速度，以确保实现充分的消融。</li>
	<li>使用软件中的“漂白”功能进行消融，并结合“时间序列（2个周期）”对样品在消融前后进行成像，同时使用“区域”功能（用于设定感兴趣区域，ROI）或所用软件中的等效功能图1D).</li>
	<li>通过比较时间序列循环中的第一幅图像（消融前）和第二幅图像（消融后），确保在漂白后，靶向细胞中的荧光降低至与背景水平相当的强度图2B).</li>
	<li>如果消融后仍存在荧光，则增加迭代次数。</li>
	<li>接下来，将焦平面略微向下移动（即，朝向腹侧），并选择下一个出现未消融细胞的焦平面。</li>
	<li>按照上述方法执行漂白操作（步骤1.9）。重复这些步骤，直至目标神经结构中的所有细胞均被消融。</li>
	<li>在扫描完覆盖待消融神经结构的所有焦平面后，检查细胞的荧光是否已消失。若发现部分细胞因消融不充分仍具有荧光，应按照上述方法再次进行激光照射。</li>
	<li>如果需要在激光照射后从琼脂糖中回收幼虫，请勿强行将其从琼脂糖中取出，以免损伤幼虫。相反，应小心地在幼虫周围垂直于其体表方向对琼脂糖进行微小切割。随后，等待麻醉效果消退后幼虫自行游出琼脂糖。</li>
	<li>继续对下一个幼虫进行消融，或使用与所研究行为无关的另一群神经元进行对照实验。 
	注意： 此处作为对照，采用上述相同方案，利用激光消融了 UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B 幼虫中的嗅球神经元图2A，右侧。</li>
	<li>在进行钙成像（第2节）或行为记录（第3节）之前，需让幼虫恢复数小时至一天。在此恢复期间，应检查幼虫的健康状况即，正常自发游泳，消融区域周围无明显热损伤， 等等。）并剔除任何表现出健康不良迹象的幼虫。</li>
</ol>
2. 钙成像记录视顶盖切除斑马鱼幼体中猎物诱发的神经元活动
<ol>
	<li>准备记录室时，将一个带粘性的密封封接杂交室垫圈置于载玻片上，粘性面朝向载玻片，并揭去顶部密封膜。 
	注意： 这形成了一个直径为9 mm、深度为0.8 mm的小型记录腔室（图3A).</li>
	<li>接下来，将一张尼龙网膜（孔径：32 µm）置于已切去底部的50 mL离心管上，用管盖将网膜固定在管口（图3B).</li>
	<li>制备 草履虫 （即用作幼虫视觉刺激的猎物）。 
	注意： 制备 草履虫 培养（步骤 2.3.1 和 2.3.2）需提前进行。
	<ol>
		<li>获取 草履虫 来自商业来源或学术生物资源中心的种子培养物24 提前。</li>
		<li>培养 草履虫 在含有经高压灭菌的稻草和一粒干啤酒酵母的水中培养数天22 (图3C).</li>
		<li>倒入 草履虫 依次通过两层筛网过滤培养物（第一层孔径为150 µm，第二层孔径为75 µm），以去除培养物中的碎片。</li>
		<li>收集 草履虫 在上一步的流穿液中使用尼龙网膜（13-µm 孔径）进行过滤。</li>
		<li>重悬 草履虫 将尼龙网上的内容物用系统水冲洗至玻璃烧杯中（使用洗瓶）图3D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冲洗滤网（图3B) 在系统水中清洗 2 次图3E). 
	注意： 此步骤的目的是去除可能含有的任何气味物质和味觉物质 草履虫 培养基，因为本研究的目的是观察视觉驱动的神经元活动。</li>
	<li>将斑马鱼幼鱼放入三卡因溶液中以进行麻醉。</li>
	<li>将单个幼虫置于2%低熔点琼脂糖中包埋。
	<ol>
		<li>首先，将2%低熔点琼脂糖进行微波加热，然后向琼脂糖中加入1/10体积的10倍浓缩三卡因（tricaine）。</li>
		<li>将一滴含有三卡因的琼脂糖置于记录室中（图3A).</li>
		<li>在确认琼脂糖温度不过高后，将麻醉后的幼虫（来自步骤2.5）放入琼脂糖中，并立即去除多余的琼脂糖，使琼脂糖表面呈轻微凸起状。</li>
		<li>用解剖针迅速将幼虫调整至直立位置（图1C). 
		注意： 这些步骤必须在几秒内完成，以免琼脂糖凝固。</li>
		<li>幼虫正确放置后，静置5分钟，使琼脂糖完全凝固。然后，在琼脂糖上滴加一滴1x三卡因溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除斑马鱼幼鱼头部周围的琼脂糖，并留出空间 草履虫 使用手术刀在琼脂糖中进行划线接种。操作时，首先在琼脂糖上做几个小切口（图3F然后，轻轻将系统水倒入培养室，以小心去除多余的琼脂糖。 
	注意： 在此步骤中，将洗去三卡因。</li>
	<li>接下来，放入一个 草履虫 在记录室中作为视觉刺激。 
	注意： 当 草履虫 在斑马鱼幼鱼头部附近游动时，会引发神经元反应（图3G).</li>
	<li>将记录室置于配备科学级CMOS相机的落射荧光显微镜下图3H）并选择 2.5X 物镜（图3我).</li>
	<li>采集GCaMP荧光信号的时间序列记录。
	<ol>
		<li>启动配备相机的图像采集应用程序。</li>
		<li>点击 &#34;序列窗格&#34; 并选择 &#34;硬盘记录&#34; 在面板上。在扫描设置部分，设置 &#34;帧数&#34; 至900或其他任意所需总帧数。 
		注意： 如果具备条件，可使用带有模块的时间延时记录软件（此处指 &#34;硬盘记录&#34;可实现将数据高效保存至硬盘。</li>
		<li>在 &#34;捕获&#34; 面板，将曝光时间设为30 ms（即，33.3 帧/秒），以及 2 × 2 采样合并。</li>
		<li>在显微镜控制触摸面板上，选择用于GFP的滤光片组，因为GCaMP的激发/发射光谱与GFP相似。</li>
		<li>点击 &#34;活体&#34; 在捕获面板上定位相机视野中的幼虫并进行聚焦（图4A），然后单击 &#34;停止实时观察&#34; 并点击 &#34;开始&#34; 按钮。将视频保存为 .cxd 格式或任何其他能够保存采集条件信息的格式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录结束后，使用免费软件 Fiji，通过获取时间序列视频中设定于脑区结构的感兴趣区域（ROI）的平均像素值，分析 GCaMP6s 荧光信号（Ca 信号）。25. 
	注意： Fiji 是 ImageJ 的一个版本，预装了许多有用的插件，并可通过 Bio-Formats 插件读取 .cxd 格式的图像文件。</li>
	<li>如果幼虫在记录过程中发生轻微移动，通过运行 TurboReg 插件进行图像配准26 在 Fiji 中，从菜单中选择“插件”、“配准”和“TurboReg”。</li>
	<li>根据研究目的考虑如何分析数据。以下是一个示例。
	<ol>
		<li>按如下方法计算 F/F0（每个时间点的荧光强度除以静息状态或任何钙瞬变发生前的荧光强度）：</li>
		<li>使用 ROI Manager 在前顶盖或 ILH 上设置 ROI：在菜单中选择 &#34;分析，&#34; &#34;工具，&#34; &#34;ROI 管理器&#34;，以及 &#34;添加&#34; 到 ROI 列表中（图4A).</li>
		<li>计算各感兴趣区域（ROI）的平均像素值（即，通过在 ROI Manager 面板中选择来获取 GCaMP6s 的荧光强度 &#34;更多，&#34; &#34;多指标测量&#34;，以及 &#34;好的。&#34; 将结果保存为电子表格文件。</li>
		<li>由于信号存在噪声，使用能够处理电子表格数据的应用程序，对11个时间点的信号进行平均（移动平均）。</li>
		<li>将F（随时间变化的荧光强度）除以F0（基础水平的荧光强度），以计算归一化的荧光强度。作为数据可视化的一个示例，前顶盖和ILH中归一化的GCaMP6s荧光强度变化以颜色编码并映射于 草履虫 轨迹（图4B - D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 激光消融后行为学后果的评估
<ol>
	<li>设置一个行为记录系统，该系统由配备视频摄像机的体视显微镜组成。使用带有适当图像采集软件的摄像机，软件可为商用或定制开发的图5A).</li>
	<li>优化光照条件，使 草履虫 可通过图像处理进行检测。例如，使用带间隔器的环形白色LED光源（图5B). 
	注意： LED 的距离和角度会影响样本的外观即，明场中为暗色或暗场中为亮色）因此对成功的图像处理至关重要。确定垫片的最佳高度（图5C).</li>
	<li>将一条斑马鱼幼鱼（来自第1节所述激光消融实验回收的样本）放入行为记录室（已连接至载玻片）中，移除原有的顶部密封图5D).</li>
	<li>收集50 草履虫 使用微量移液器从培养物（步骤 2.3.5）中取出并置于记录室中。</li>
	<li>在记录室上方放置盖玻片。在将盖玻片置于记录室的水面上之前，先在盖玻片上滴加一滴水，以避免将空气带入记录室中。 
	注意： 在这一步中，加入一些水与 草履虫 将从记录室溢出。剩余的数量 草履虫 记录室内的温度将约为30-40。</li>
	<li>将记录室（内含一条幼虫）置于 草履虫) 在照明系统中（图5D).</li>
	<li>以每秒10帧的速度开始延时记录，持续11分钟（6,600帧）。</li>
	<li>（可选）对于每只用于行为测试的幼虫，通过荧光显微镜观察激光消融区域的荧光，以确认激光消融的有效性（即激光照射区域内荧光细胞的缺失或数量显著减少。 
	注意： 即使经过照射，在消融后发生分化的细胞中，由于Gal4基因表达的延迟启动，仍可观察到一些荧光细胞27.</li>
	<li>记录幼虫行为后，为补偿背景的不均匀性，在Fiji中对每一帧进行与平均图像的逐像素相除操作：点击“Process”（处理）、“Image Calculator”（图像计算器）、“Operation: Divide”（运算方式：相除）、勾选“32-bit (float) result”（32位浮点结果），然后点击“OK”（确定）。生成平均图像的方法为：点击“Image”（图像）、“Stacks”（堆栈）、“Z-Project”（Z轴投影）、选择“Average intensity”（平均强度），然后点击“OK”（确定）。图5E，F).</li>
	<li>计数数量 草履虫 通过点击“分析”、“分析颗粒”，并设置覆盖所有颗粒的面积范围，将剩余在腔室中的颗粒进行分析 草履虫，勾选“显示：掩膜”复选框，然后点击“确定”。“显示：掩膜”选项将提供一个提取的 草履虫 图像（图5G），以及颗粒数量列表（草履虫每帧中的）</li>
	<li>绘制数量 草履虫 随时间留在记录室中。由于对数量的估计 草履虫 由于数据存在噪声，我们建议在电子表格中对每一点在600帧（1分钟）范围内进行移动平均处理。</li>
</ol>

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<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
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 <a target="_blank" href="https://fiji.sc">https://fiji.sc</a> (2017).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
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<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+of+visual+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish.</a> PLoS Genet. 1 (5), 66(2005).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

尽管双光子激光器具有优异的空间分辨率，可特异性消融单个神经元，但必须格外注意避免因热量对脑组织造成不必要的损伤。消融实验中最重要的步骤是确定最佳的激光照射剂量。照射剂量不足将无法杀死神经元；而照射剂量过高则会因热效应损伤周围组织，导致非预期的结果。最佳激光照射参数范围（包括感兴趣区域的面积、扫描迭代次数和扫描速度）通常较窄。多个因素会影响消融的效率。
首先，通过使用不同的荧光报告蛋白，需要针对每种报告蛋白优化消融条件。GCaMP 的表达位于无细胞核的细胞质中。相比之下，EGFP 的荧光遍布整个细胞内部，与 GCaMP 相比，这可能更有利于实现靶向细胞的高效且特异性的消融。使用 GCaMP 还存在一个不利因素：激光消融表达 GCaMP 的细胞后，由于瞬间大量钙离子内流，可能导致荧光强度增加；而使用 EGFP 进行消融时，荧光强度则会下降。因此，荧光强度的变化不能作为 GCaMP 消融程度的可靠指标。在此类情况下，可能需要通过观察特定时间后荧光细胞的消失来验证消融效果。消融区域内钙信号的缺失或显著减弱可作为使用 GCaMP 成功消融的另一判断标准。
<p class="jove...

为了理解行为如何由大脑中的神经元活动产生，有必要确定参与该行为生成的神经环路。在幼体阶段，斑马鱼为研究与行为相关的大脑功能提供了一个理想的动物模型，因为其体积小且透明的大脑使得在观察行为的同时，能够在大脑较大区域内以细胞分辨率研究神经元活动1。随着基因编码的钙离子（Ca）指示剂（GECIs）如GCaMP的发明，对特定神经元中神经元活动的成像已成为可能2。通过在行为活动的动物中进行钙成像，GCaMP转基因斑马鱼已被证明在将功能神经环路与行为关联方面具有重要价值3。
尽管钙成像可以揭示神经元活动与行为之间的相关性，但要证明因果关系，抑制神经元活动并检测其对行为的影响是至关重要的步骤。实现这一目标有多种方法：利用改变特定神经回路的基因突变4、在特定神经元中表达神经毒素5,6、使用光遗传学工具（如卤视紫红质）7，以及靶向神经元的激光消融8,9。其中，激光消融特别适用于消除数量较少的特定神经元的活动。通过杀死神经元从而不可逆地消除其活动，有助于评估其行为学后果。
在斑马鱼幼体阶段可观察到一种有趣的行为，即捕食行为&#160;（图1A）。这种由视觉引导、具有明确目标的行为为研究视觉敏锐度10、视觉-运动转换11,12,13、视觉感知与物体识别14,15,16,17,18以及决策过程19提供了一个理想的实验系统。捕食者如何识别猎物，以及猎物的检测如何引发捕食行为，一直是神经行为学中的核心问题20。本文重点探讨由前顶盖核（nucleus pretectalis superficialis pars magnocellularis，下文简称为前顶盖）向间脑后外侧核（ILH）投射所构成的前顶盖-下丘脑环路的作用。研究表明，通过激光消融前顶盖可降低斑马鱼幼体的捕食活动，并消除ILH中与视觉猎物感知相关的神经元活动21。本文描述了在斑马鱼幼体中进行激光消融操作，并利用Ca2+成像和行为记录来检测其效应的实验方案。

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG 琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>Cat.#50080</td><td>低熔点琼脂糖</td></tr><tr><td>6 cm 培养皿</td><td>FALCON</td><td>Product#:351007</td><td></td></tr><tr><td>解剖针</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat. No. 2-013-01</td><td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142</td></tr><tr><td>LSM7MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>双光子激光扫描显微镜</td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>63X 物镜</td></tr><tr><td>Imager.Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>落射荧光显微镜</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>共聚焦显微镜图像采集软件</td></tr><tr><td>Secure-Seal 杂交室垫圈，8 个腔室，直径 9 mm × 深度 0.8 mm</td><td>Molecular Probes</td><td>Catalogue # S-24732</td><td>用作钙成像中的记录腔室</td></tr><tr><td>成像腔室</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CoverWell 成像腔室 PCI-A-2.5</td><td>用作行为记录腔室</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>MANI</td><td>眼科手术刀 MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>型号：C11440-22CU</td><td>科学级 CMOS 相机</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>图像采集软件</td></tr><tr><td>硬盘记录模块</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>可实现将视频文件快速保存至硬盘驱动器的软件模块</td></tr><tr><td>SZX7</td><td>Olympus</td><td></td><td>体视显微镜</td></tr><tr><td>DF PL 0.5X</td><td>Olympus</td><td></td><td>SZX7 用物镜</td></tr><tr><td>Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio</td><td>FLIR Systems, Inc.</td><td>产品编号：GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>CMOS 相机</td></tr><tr><td>XIMEA xiQ 相机</td><td>XIMEA</td><td>产品编号：MQ042RG-CM</td><td>CMOS 相机</td></tr><tr><td>环形 LED 光源</td><td>CCS</td><td>型号：LDR2-100SW2-LA</td><td>白色 LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼龙网 32&amp;micro;m</td><td>东京筛网</td><td>N-No.380T</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr><tr><td>尼龙网 13&amp;micro;m</td><td>东京筛网</td><td>N-No. 508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr><tr><td>金属筛网，孔径 150 微米</td><td>东京筛网</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>金属筛网，孔径 75 微米</td><td>东京筛网</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>EBIOS</td><td>Asahi Food &amp;amp; Healthcare, Co. Ltd.</td><td></td><td>干啤酒酵母</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>用于编程的集成开发环境</td></tr><tr><td>Mai-Tai HP</td><td>Spectra Physics&amp;nbsp;</td><td></td><td>双光子激光器&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

使用双光子激光消融神经元群体及其在斑马鱼幼鱼中通过钙成像与行为记录进行评估

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

为了确定神经元亚群在行为中的作用，必须在活体动物中测试阻断其活性所产生的后果。当神经元被荧光探针特异性标记时，激光消融神经元是实现这一目标的有效方法。本研究描述了使用双光子显微镜对神经元亚群进行激光消融，并检测其功能和行为学后果的实验方案。本研究以斑马鱼幼鱼的捕食行为作为研究模型。已知视顶盖-下丘脑环路介导这种由视觉驱动的捕食行为。实验中对斑马鱼视顶盖区域进行了激光消融，并检测了下丘脑下叶（ILH；视顶盖投射的靶区）的神经元活动。同时，还测试了视顶盖消融后的捕食行为表现。

特定神经元通过Gal4品系驱动，被遗传标记为EGFP或GCaMP6s。使用Gal4品系gSAIzGFFM119B标记了位于前顶盖区的一个核团（大细胞浅表前顶盖核）以及嗅球中的一群亚群神经元。另一个Gal4品系hspGFFDMC76A用于标记ILH。我们在gSAIzGFFM119B Gal4品系与UAS:EGFP报告鱼杂交所得的斑马鱼幼体中，双侧激光消融前顶盖神经元（图2A左图），并以双侧消融嗅球神经元作为对照（图2A右图）。结果显示，双光子激光能够特异性消融靶细胞，而对邻近细胞或神经纤维无影响（图2B）。
顶盖前区神经元将其轴突向同侧ILH投射。在此，我们利用钙成像技术研究了...

本文介绍了一种利用双光子激光消融斑马鱼幼鱼中基因标记的神经元亚群的实验方案。

为了确定神经元亚群在行为中的作用，必须在活体动物中测试阻断其活性所导致的后果。激光...

本实验的总体目标是检测特定神经元的激光消融对神经环路活动和行为的影响。通过该实验技术，我们可以检验神经元在介导行为的神经环路中的必要性。该方法有助于回答行为学与神经科学领域的关键问题，例如猎物如何被感知，以及神经活动如何产生捕食行为。该技术的主要优势在于，由于这些神经元具有遗传标记，且激光具有高空间分辨率，因此可以特异性地消融神经元。按照文本方案将幼虫培养并置于2%低熔点琼脂糖中固定后，将包埋在琼脂糖中的幼虫置于双光子激光扫描显微镜下，并启动显微镜系统。打开图像采集软件，在激光选项卡下点击“开启”按钮以启动激光。等待激光器状态从“忙碌”变为“锁模”。在通道选项卡中，将激光器波长设置为 880 纳米以进行 EGFP 消融，或设置为 800 纳米以进行 GCaMP 消融。通过手动旋转物镜转盘选择 20X 物镜。然后，点击定位选项卡，点击GFP以切换光学通路，通过目镜直接观察荧光。将斑马鱼幼体脑部置于视野中央，然后点击采集选项卡，返回双光子显微镜界面，并设置激光功率和增益。为记录消融前的状态，点击Z层扫描以选择Z层扫描选项。然后，将焦点对准幼虫脑的腹侧末端，单击“设置起始”按钮以设定下限；再将焦点对准脑背侧最表面，单击“设置终止”按钮以设定上限。最后，单击“开始实验”按钮以运行Z轴层扫图像采集。接下来，通过手动旋转物镜转盘选择63X物镜。然后，单击定位选项卡以切换至落射荧光显微镜模式。通过肉眼将待消融的细胞置于视野中央，随后单击采集选项卡返回激光扫描显微镜模式。在采集模式选项卡中，将帧尺寸设置为 256 × 256。点击实时观察，查看目标神经元。然后，从背侧最上方开始，找到一个焦平面，使待消融的细胞处于清晰对焦状态。使用区域功能，在每个神经元上标记一个直径约为细胞大小三分之一的微小圆形区域作为感兴趣区域（ROI）。将扫描速度设置为每256×256像素13.9秒，对应每个像素的激光驻留时间约为200微秒，或每0.5微米200微秒。同时，将迭代周期设置为四次重复。点击“开始实验”以执行时间序列和漂白功能。在时间序列循环中，将消融前的图像与消融后的图像进行比较，以确认靶向细胞中的荧光信号已消失。接着，将焦平面略微调深，选择下一个未消融细胞出现的焦平面。执行如前所述的漂白功能，并重复此过程，直至目标神经结构中的所有细胞均被消融。消融后，检查细胞的荧光是否消失，必要时重复激光照射。照射后需要恢复幼虫。在幼虫周围的琼脂糖中小心地做微小的垂直切割。然后，等待麻醉效果消退后，斑马鱼幼鱼自行从琼脂糖中游出。根据文本方案培养草履虫并麻醉斑马鱼幼鱼后，将幼鱼放入2%低熔点琼脂糖中，并立即去除多余的琼脂糖，使琼脂糖表面呈轻微凸起状。使用解剖针迅速将幼鱼调整为直立位置。然后，使用手术刀在琼脂糖上做几个小切口，以去除斑马鱼头部周围的琼脂糖，从而为草履虫的游动腾出空间。通过轻轻向记录 chamber 中倒入系统用水，小心去除残留的琼脂糖。接着，将一个草履虫放入记录 chamber 中，作为视觉刺激物。然后将记录室置于配备科学级CMOS相机的落射荧光显微镜下，并选择2.5倍物镜。启动所配相机的图像采集程序。点击序列窗格，并在该窗格中选择硬盘记录。在扫描设置部分，将帧数设置为900或任何其他所需的总帧数。在采集面板中，将曝光时间设为30毫秒，像素合并设为2×2。点击采集面板上的“实时”按钮，以在相机视野中定位幼虫并进行聚焦，然后点击“停止实时”，再点击“开始”按钮。将视频保存为 cxd 格式，并根据文本方案分析数据。按照文本方案设置行为记录系统，并将一条幼虫放入记录室后，使用微量移液器收集 50 个草履虫并将其放入记录室中。在记录室上方加盖盖玻片时，应先在盖玻片上滴加一滴水，再将其置于记录室的水面上，以避免将空气带入记录室。将记录室置于照明系统中。然后，以每秒10帧的速度开始连续拍摄，持续11分钟。最后，根据文本方案进行分析。在本实验中，使用标记前顶区细胞核及嗅球部分神经元的Gal4品系。对前顶区神经元进行双侧激光消融，以嗅球神经元的消融作为对照。结果显示，双光子激光能够消融靶向细胞，同时不影响邻近的神经突。本实验研究了轴突同侧投射至间脑后部（ILH）的前顶盖神经元的功能连接性。前顶盖和间脑后部（ILH）在猎物临近时均表现出神经元活动，表明这两种神经元活动均由视觉驱动。钙成像还被用于观察中脑顶盖区神经元消融幼鱼中顶盖区和间脑后部（ILH）的神经元活动。经激光消融的左侧顶盖区表现出残余甚至无神经元活动。此外，同侧的ILH显示出显著偏移的神经元活动，提示ILH的主要输入来源于同侧顶盖区。相比之下，激光消融后对侧的背侧间脑（ILH）表现出与同侧顶盖前区神经元活动相似的活性，这表明右侧ILH正在接收来自右侧顶盖前区的输入。一旦掌握该技术，每条斑马鱼幼鱼的激光消融操作约需一小时即可完成。在进行该操作时，重要的是需牢记仅对目标神经元进行精确的激光照射消融，同时避免激光造成的热损伤。通过该方法，可对其他脑区（如前脑或后脑）的神经元进行消融，以回答更多科学问题，例如这些神经元如何参与认知功能或运动功能。该技术建立后，为行为神经科学领域的研究人员探索斑马鱼模型中的功能性神经环路开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何在斑马鱼幼体脑中特异性地进行激光消融神经元操作，并评估其功能及行为学后果。请务必注意，使用激光器可能具有极高的危险性，在执行此操作时应始终遵守制造商的说明。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

用双光子激光消融神经种群及其对斑马鱼幼虫钙成像和行为记录的评价

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双光子轴突切除与活体斑马鱼胚胎的延时共聚焦成像

本视频介绍了捕食行为检测实验。视频讨论了在对特定神经元进行激光消融后，研究斑马鱼幼鱼捕食行为的方法。...

捕食行为检测法：一种研究斑马鱼幼虫捕食行为的方法

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本视频展示了利用基于钙离子指示剂的荧光成像方法研究转基因斑马鱼幼鱼视觉捕食探测的技术，其实现方式为使其神经元表达荧光钙离子指示剂复合物。...

分析转基因斑马鱼幼虫中由猎物引发的神经元活动

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使用共聚焦显微镜对斑马鱼幼鱼进行单神经元选择性激光消融

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尽管周围神经系统（PNS）在损伤后具有显著的修复能力，但调控这一现象的细胞和分子机制仍知之甚少。通过使用活体转基因斑马鱼和可重复的神经横断实验，我们能够研究神经变性和再生过程中胶质细胞的动态行为。...

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使用双光子激光消融神经元群体及其在斑马鱼幼鱼中通过钙成像与行为记录进行评估

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