Name: 用基于气味的延迟配对试验对大鼠元认知应答的测试 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学习基于气味的延迟配对试验方法，用于测试大鼠的元认知应答能力。该方法利用啮齿动物的自然觅食行为和嗅觉，帮助研究人员评估动物对自身记忆状态的监控能力。

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感谢Rebecca Burwell在视频录制期间提供其实验室，以及Robert Vera对本手稿早期版本的帮助。

本文所述所有方法均已获得普罗维登斯学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 构建测试装置
<ol>
	<li>使用一个社交互动箱（76.2 x 114.3 cm），该箱被划分为三个独立的区域。
	<ol>
		<li>使用可滑动的纸板隔板将中央区域分隔为样本区和延迟区，该隔板可通过侧壁上安装的金属轨道上下移动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用不透明的贴膜覆盖透明箱壁，以防止动物从视觉上看到其他区域。</li>
	<li>在右侧房间（测试区；见图1）的一侧，用地面铺有砂粒并覆盖红色贴膜的区域，作为拒绝测试选项的视觉与触觉辨别线索。</li>
	<li>在测试区的另一侧，使用美纹纸胶带贴出凸起条纹，作为选择测试的视觉与触觉辨别&#160;线索，并用黑色贴膜覆盖条纹。箱体中间三分之一区域保持原样，不做任何处理。</li>
</ol>
2. 建立偏好性食物奖励等级/偏好测试
<ol>
	<li>选择测试中可能使用的食物奖励。确保其中一种奖励为较大的奖励，因此 &#34;首选的&#34; 而非选择另一选项。
	<ol>
		<li>使用一整片谷物作为较大的奖励 &#34;偏好的&#34; 奖励和一个 &#188; 一小片谷物作为较小的奖励， &#34;较不偏好的&#34; 奖励 
		注意： 谷物可包含加糖的麦片或脱水棉花糖。也可以使用两种不同的奖励物（例如 谷物 与 标准啮齿类动物颗粒饲料（TestDiet，45 mg），但当奖励之间的差异源于质量而非数量时，难以确定个体内部及个体间稳定的偏好排序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将成年雄性Long Evans大鼠在测试开始前30分钟带入黑暗的测试室。如果大鼠处于每日周期的黑暗阶段，则使用红光照明测试箱；否则，按照视频所示在正常光照条件下进行测试。</li>
	<li>将两份奖励，即一整块麦片和 &#188; 一片麦片，放置于腔室右侧房间的对角角落（参见 图1).</li>
	<li>将大鼠放置于房间的对侧，使其背向奖励物，并允许大鼠取食其中一项奖励。 
	注意： 为通过偏好测试并确保较大块的谷物为首选奖励，受试动物必须在连续两个阶段中，每个阶段的5次试验内至少有4次取食较大奖励（每阶段包含5次试验）。每天进行两个阶段的测试。
	<ol>
		<li>如果经过10个训练阶段后，大鼠仍未表现出对较大谷物奖励的偏好，则更换另一种奖励。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在整个测试过程中，为确保大鼠的偏好保持一致，每周进行一次偏好检查。
	<ol>
		<li>以相同的方式进行偏好检查，将整块和四分之一块的谷物分别放置在实验箱的对角角落。 
		注意： 2 次试验构成一次偏好检查。</li>
		<li>如果大鼠在两次试验中均选择较不偏好的奖励，则对该大鼠进行完整的偏好测试，共5次试验。
		<ol>
			<li>如果大鼠选择放弃，则可继续进行测试。</li>
			<li>如果大鼠未能通过，应停止测试并引入不同类型或数量的奖励。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通用方法
<ol>
	<li>在整个测试过程中使用固定的实验人员&#160;，以便大鼠充分适应实验人员的气味和操作方式。 
	注意：假设在测试前，大鼠已由人类处理至少1周，使其习惯被实验人员抓取和搬运。</li>
	<li>在测试开始前30分钟，将大鼠连同其鞋盒笼（家庭笼）一起带入测试室，使其适应新环境。</li>
	<li>如果测试在大鼠活动周期的黑暗阶段进行，应保持测试环境&#160;黑暗，仅使用红光照明设备。</li>
	<li>确保带气味的选择杯按照&#160;随机化脚本&#160;确定的顺序正确排列，该脚本已包含&#160;平衡设计。在正确杯子中放入一整片谷物作为诱饵。</li>
	<li>仅允许大鼠在一个杯子中挖掘，一旦大鼠通过挖掘行为选择了一个杯子，应立即将其从装置中移出。将大鼠放回家庭笼，使其完成奖励的摄取。</li>
	<li>试次间间隔（ITI）固定为4分钟。当大鼠回到家庭笼后，立即启动秒表计时。
	<ol>
		<li>在试次间间隔期间，使用真空吸尘器清理洒出的沙子，并用70%异丙醇擦拭装置底部。如果上一次试次中的奖励未被吃掉，则将其丢弃。&#160;此外，每周需清洁一次陶瓷杯：倒掉旧沙子，并用异丙醇擦拭杯子。&#160;</li>
		<li>根据随机化脚本&#160;重新排列下一次试次所用沙杯的顺序，并在正确杯子中放入诱饵。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 训练大鼠在沙杯中挖掘及对测试装置的适应
<ol>
	<li>倒入约 &#189; 直径6.99厘米、高8.81厘米的陶瓷杯中的彩砂</li>
	<li>将装有食物奖励的沙杯放入每只大鼠的居住笼中过夜。 
	注意： 大鼠需连续两个晚上成功挖掘杯子并吃掉奖励。</li>
	<li>让大鼠在测试装置中适应5分钟。
	<ol>
		<li>在整个装置内分散放置食物奖励，以促进大鼠对装置的探索以及穿过打开门的活动。确保大鼠连续两天内不在箱体内排尿、排便或出现僵直行为。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将装有食物奖励的无味沙子杯转移至测试装置中。确保大鼠能够成功挖掘沙子并取出奖励，且连续两天内无僵直行为、排便或排尿现象。如有必要，可移除陶瓷杯，并将谷物直接放置于实验箱内。</li>
</ol>
5. 样本匹配训练（MTS）
<ol>
	<li>通过将约3杯儿童玩沙与¼茶匙的有香味香料（肉桂、咖啡、红椒粉和百里香）混合，制备4种不同气味的沙堆。为控制气味线索，在错误选项杯中压碎一小块奖励物。
	<ol>
		<li>每周重新混合一次带气味的沙子，并储存在玻璃容器中，以确保测试各天之间的气味强度一致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每种带气味的沙子各½杯倒入4个杯子中，并将杯子以半圆形排列在黑色触感纸区域（MTS任务区；图1A）。确保所有杯子距离入口门的距离相等。
	<ol>
		<li>根据编程软件“R”中无放回抽样函数的输出结果，将杯子按指定位置摆放。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在受试动物视线之外，将一整块奖励物埋入正确的带气味杯中。将½块奖励物埋入一个相同气味的样本杯中。所有奖励物均需埋入沙子深度至少½处。
	<ol>
		<li>伪随机选择正确的带气味杯，唯一限制&#160;是同一种气味连续作为样本气味&#160;不得超过两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将受试动物放入样本室，使用弯曲的刮刀（手柄托盘呈90度角）放下样本杯。允许受试动物在样本杯中挖掘并获取½块谷物奖励。一旦受试动物开始进食奖励物，立即移除杯子。</li>
	<li>当受试动物完成进食后，在其进入延迟室时，抬起纸板隔板并打开测试室的门。</li>
	<li>允许受试动物通过挖掘“选择”其中一个杯子。一旦受试动物做出选择并获取存在的奖励物，立即将其从测试室移出并放入转移笼中。大鼠可以嗅闻每个杯子，但仅允许一次选择，以挖掘行为为准。
	<ol>
		<li>在4分钟的ITI期间，使用70%异丙醇清洁测试室。吸除可能洒出的沙子，并根据需要补充沙杯中的沙子。</li>
		<li>准备下一个样本杯，并对样本杯和测试杯进行诱饵放置。如果受试动物在上一试验中选择了错误的杯子，则取出并丢弃未食用的奖励物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保受试动物每天接受一次包含6次试验的MTS训练。为通过MTS训练，受试动物必须在连续两次训练中，每次6次试验中至少正确选择3次。
	 
	注意：这可确保其表现高于随机水平，但在4选1测试中未达到上限。</li>
</ol>
6. 延迟样本匹配任务（DMTS）中的延迟时间滴定
<ol>
	<li>继续按照之前的训练方法对受试动物进行匹配样本任务（MTS）训练（起始延迟时间为 0 秒）。 
	注意： 正确率必须保持在 40% 至 70% 之间，以确保表现显著高于随机水平（25%），但未达到上限。在此范围内的表现可使受试动物经历记住样本和遗忘样本的不同情况。当引入可选择的测试试次时，这为受试动物有利地使用“拒绝测试”反应提供了机会。</li>
	<li>如果在连续两个包含 6 次试次的训练阶段中，正确率均超过 70%，则将延迟时间从 0 秒增加至 30 秒。
	<ol>
		<li>在延迟时间不为 0 秒的试次中，使用秒表计时每次延迟。在受试动物完成样本采样后，升起纸板隔板墙，允许其进入延迟室。关闭纸板隔板，并启动秒表开始计时。</li>
		<li>30 秒延迟结束后，打开测试室的门，待受试动物进入测试室后关闭房门。</li>
		<li>其余试次流程照常进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果在连续两个包含 6 次试次的训练阶段中，正确率仍持续高于 70%，则将后续每次延迟时间增加为前一次延迟的 1.5 倍。</li>
	<li>如果在连续两个训练阶段中，正确率均低于 40%，则将延迟时间恢复至上一个使用的延迟值。</li>
	<li>如果在连续两个训练阶段中，正确率均保持在 40% 至 70% 之间，则将该延迟时间设定为该受试动物的个体化标准延迟。</li>
</ol>
7. 拒绝测试选项训练
<ol>
	<li>每次 DMTS 训练会话结束后，在有气味的沙杯对面放置另一个装有不同质地和颜色沙子的杯子。在该杯中放入偏好度较低的奖励物，即¼块麦片，此杯将作为拒绝选择杯。随后将有气味的沙杯从实验箱中移除。</li>
	<li>按照 DMTS 训练期间的方式进行试验，允许受试动物采样一个随机选择的有气味杯子，并在延迟室中等待其个体特定的延迟时间。</li>
	<li>允许受试动物在无气味的沙杯中挖掘并获取奖励物，然后将受试动物从实验箱中移出。此类试验将被视为“强制拒绝”试验。</li>
	<li>每次 DMTS 训练会话后进行两次强制拒绝试验。</li>
</ol>
8. 测试：强制选择 与 选择试验
<ol>
	<li>使用标准延迟对受试者进行延迟匹配样本测试（DMTS）。每天对每位受试者进行一次包含12个试验的测试会话。
	<ol>
		<li>随机选择8个试验作为 &#34;选择&#34; 试验中将退选杯放置在有气味的杯子对面。使用随机化脚本&#160;以确定试验类型的顺序，且限制连续选择试验不超过3次&#160;或强制试验&#160;依次发生。 
		注意： 其余的4次试验将为 &#34;强制&#34; 移除室内的回避杯。</li>
		<li>根据受试大鼠的标准延迟时间，可能在一只大鼠的间隔休息期（ITI）内测试2至3只受试动物。在第一只受试动物的ITI期间，进行第二只受试动物的试验。每次试验结束后，务必使用异丙醇清洁实验箱。</li>
		<li>对受试者进行十次测试。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每次试验中，当大鼠进入延迟室后，确保其向左转以选择拒绝测试，或向右转以选择接受测试（参见 图1A；俯视摄影）。记录大鼠是否从房间一侧移动到另一侧（例如 &#34;决定参加测试&#34; 然后前往房间的“拒绝测试”区域。 
	注意： 因此，大鼠在面对四种可选气味之前，通过选择接受或放弃测试，做出前瞻性的元记忆决策（参见结果论文）19 关于同时性与前瞻性元记忆测试的详细讨论）。</li>
	<li>在连续进行两轮测试后，持续计算强制试验中的准确率，并监测放弃测试选项的使用情况。
	<ol>
		<li>如果在连续两个测试阶段中准确率超过70%，则停止测试，返回至延迟时间的滴定阶段，并采用更长的延迟时间。</li>
		<li>如果使用拒绝测试的频率接近&#160;若在连续两个会话中始终为0%或100%，则暂停测试，并考虑调整拒测反应的设定值，以确保拒测率维持在10%至40%之间。</li>
		<li>如果连续2个测试阶段的准确率低于40%，则停止测试，返回至较短延迟时间的延迟滴定阶段。</li>
		<li>在连续两个测试阶段中，当强制试验的准确率保持在40%至70%之间时，继续进行测试。</li>
		<li>在整个测试过程中，为确保大鼠的偏好保持一致，每周进行一次偏好检查（每 session 2 次试验）。偏好检查方法如上所述。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 建议的泛化测试
<ol>
	<li>泛化测试，例如结果论文中所述的测试19 可用于确定元认知反应是否能在不太可能通过单一外部刺激关联来控制反应的条件下发生迁移。
	<ol>
		<li>在无样本探测试验中对大鼠进行测试，其中&#160;不呈现样本阶段，但保留与正常试验相同的延迟间隔（RI）和测试阶段。将4次无样本试次与8次正常样本试次随机混合，组成一个包含12次试次的实验单元。对受试者进行10个单元的测试。比较无样本试次与正常试次中的回避率。</li>
		<li>在双样本试验中对大鼠进行测试，即向受试动物两次呈现原始样本气味，以增强记忆强度。将探测试验与正常样本试验按上述方法随机交叉混合。比较双样本试验与正常试验中的回避率。</li>
		<li>对大鼠进行三种不同保持间隔（RI）的测试：标准延迟、一个较短的延迟例如 0 秒）短于标准延迟，另一个则长于标准延迟（例如 4分钟）。在每次实验会话中的每个延迟条件下，向受试者呈现4次选择试验和2次强制试验，使每次会话共包含18次试验。&#160;实验。将所有试验随机混合，对大鼠进行十次训练。比较三种不同延迟条件下试验的放弃率，其中记忆强度应分别降低和升高。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 数据分析
<ol>
	<li>测试完成后，计算每个受试者在强制试验和选择试验中的平均正确率。
	<ol>
		<li>将正确完成的强制试验次数除以强制试验总次数，以计算正确强制试验所占比例。</li>
		<li>计算正确选择试验所占比例时，首先从选择试验总次数中减去被拒绝的试验次数。然后将每只大鼠的正确选择试验次数除以选择试验总次数减去被拒绝试验次数后的结果。</li>
		<li>对群体数据进行 t 检验，比较强制试验中正确反应的比例与选择试验中正确反应的比例（参见 图2).</li>
		<li>若进行泛化测试，则对正常试验中的放弃率进行 t 检验 与 如步骤9所述进行探测试验。对于混合延迟试验（如9.1.3所述），采用重复测量方差分析（ANOVA），以延迟时间和试验类型作为组内因素，比较强制测试与选择测试的表现。同时，对不同延迟条件下的回避选择使用情况进行单因素方差分析（ANOVA），以确定准确率是否随保留间隔（RI）发生变化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Nilsson, M., Perfilieva, E., Johansson, U., Orwar, O., Eriksson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+environment+increases+neurogenesis+in+the+adult+rat+dentate+gyrus+and+improves+spatial+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Enriched environment increases neurogenesis in the adult rat dentate gyrus and improves spatial memory.</a> J. Neurobiol. 39 (4), (1999).</li>
<li>Van Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+consequences+of+environmental+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural consequences of environmental enrichment.</a> Nature reviews. Neuroscience. 1 (3), 191(2000).</li>
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无任何披露事项需要报告。

本文介绍了一种利用基于气味的延迟匹配样本任务（DMTS）评估大鼠元认知反应的新方法。由于嗅觉是啮齿类动物的主要感官，因此在大鼠和小鼠实验中，使用气味刺激优于视觉线索20,21。利用在沙土中挖掘的行为是大鼠的自然觅食行为，使该任务对啮齿类物种具有生态相关性。
该实验方案中的一个关键步骤是确保食物奖励具有等级层次，其中一种奖励明显比另一种更受偏好。在研究的早期阶段，大鼠需要在被认为更受偏好的奖励（一片甜味麦片）和一小粒标准食物颗粒之间进行选择。然而，偏好测试结果显示大鼠的选择行为无明显差异，因此改用数量差异作为奖励的变化依据。大鼠在整片麦片与¼片麦片之间进行选择时，始终稳定地偏好较大量。若缺乏对食物质量或数量的偏好，则受试者将没有动力选择接受测试而非拒绝测试，因此这一步骤至关重要。
该实验方案的另一个重要方面是建立合适的反应间隔（RIs）和刺激间隔（ITIs），以确保多试次序列记忆任务（MTS）的准确率维持在40%至70%的正确范围内。如果延迟时间过短，且由于ITI较长导致干扰极小，大鼠将从未经历&#34;遗忘&#34;样本的过程。相反，如果RI过长而ITI过短，测试将变得过于困难，大鼠则无法记住样本。此类行为反应不仅可通过强制选择试次的准确率来检测，还可通过回避率是否过高或过低来判断。受试动物应在约10%-50%的选择试次中选择回避：若某受试动物回避所有试次或从不回避，则无法据此判断其是否具备元记忆能力，此时需重新评估回避-测试反应的相对价值。在整个实验过程中，强制试次的平均表现会在连续两天测试结束后持续进行计算。随着大鼠完成更多次的延迟非匹配样本任务（DMTS），其表现可能会提升，此时应启动返回延迟滴定（见图1B），适当延长延迟时间，使准确率保持在70%以下。如果对样本的记忆表现 consistently 高于70%，应考虑缩短ITI；如果对样本的记忆表现 consistently 低于40%，应考虑延长ITI，和/或将气味样本数量从4种增加至10-20种，以降低记忆干扰。
根据所使用的大鼠品系、饲养环境以及动物所处的明暗循环周期，其记忆能力可能较弱或较强&#160;。与其他实验室大鼠品系（如Wistar或Sprague Dawley大鼠）相比，Long Evans大鼠通常能在相对较少的试验次数内掌握认知任务22,23。因此，其他啮齿类动物可能需要更多的适应阶段和更长时间的训练才能学会该任务。本研究中的大鼠饲养在高度丰富的环境中，并可自由活动，因此其记忆能力可能相对较强24,25,26。本研究所用大鼠还处于反转的明暗循环周期中饲养，由于测试是在其黑暗周期进行，这可能会提高其认知表现。
选择测试中的表现显著高于强制测试时，表明受试者对衰退测试反应的适应性使用，这提示存在元认知反应。然而，元认知反应可能源于对内部记忆线索或外部线索的依赖8。为了确定衰退测试反应的适应性使用是否确实由内部记忆线索驱动，实验者应尽可能消除外部线索的影响8,14。所谓外部线索，是指受试者可用于指导是否选择衰退测试的任何公开可获取的、与特定测试相关的刺激或线索8。本任务中可能的外部线索包括不同气味的相对显著性、样本呈现时间、反应潜伏期以及反应间隔（RIs）的持续时间。如本文及后续结果论文中更详细描述的泛化测试19，有助于排除基于外部线索（例如因不同实验间任务参数不一致而导致的环境线索关联）的行为反应。
在此范式中，大鼠需要在记忆测试呈现之前（见8.2）就决定接受或拒绝测试，从而在很大程度上消除了反应竞争对拒绝测试反应的控制作用。反应竞争是指当元认知选择与主要记忆测试同时呈现时，大鼠因看到或闻到正确测试选项而倾向于选择接受测试8。要求大鼠在接触记忆测试本身之前就选择接受或拒绝测试，可显著降低反应竞争控制拒绝测试反应的可能性。然而，该设计的一个改进方案是，让大鼠通过在与记忆测试区域分离的&#160;房间内做出特定反应来选择接受或拒绝测试。这将进一步增强该范式的前瞻性特征，可能更有效地排除外部线索的影响8,19。未来研究的另一项改进是，如果可能，记录大鼠进入测试房间至其向左或向右转向（分别对应拒绝或接受测试）之间的反应潜伏期。这将使研究人员能够判断反应潜伏期是否作为外部线索，被受试动物随着时间推移学会与特定反应相关联（见8）。同时，记录受试动物是否以及何时改变其反应方向也将具有重要意义（见8.2；例如，从房间内MTS选择侧移动至拒绝测试区域，或反之亦然）。正如结果论文中所讨论的，我们仅观察到一次此类行为，这进一步支持了以下结论：大鼠在进入测试房间后即刻、且在接触记忆测试本身之前就已做出接受或拒绝测试的决定，其方式是系统性地采样每个选择性气味。
由于在此范式中测试的大鼠在多个泛化测试中表现出元认知反应的迁移，因此得出结论：大鼠具备元记忆能力——它们能够监控自身对样本的记忆19。其他研究团队对这一范式或其类似变式进行测试将十分重要，因为在能够确信大鼠具备元认知反应能力、且该行为受内部而非外部线索调控之前，必须获得来自不同实验室的验证性证据。检测这种重要的记忆能力（其随年龄增长而衰退）的存在，可能在转化医学研究记忆功能障碍时具有应用价值，例如用于转基因小鼠及阿尔茨海默病模型的研究。研究人员若将此行为范式与脑损伤、暂时性脑区失活或激活（例如 光遗传学、化学遗传学）以及电生理记录技术相结合，将尤其富有成效，因为这些研究有望揭示元认知过程背后的神经机制。

元记忆是指个体评估自身记忆强度的能力2,3,4。尽管人类已持续展现出这种认知能力，但非人类动物是否具备元记忆仍存在争议e.g.5,6。检验元记忆可能性的一种常用方法是为非人类动物提供一个拒绝测试选项，若动物选择该选项，则可获得一个确定但比正确完成测试所获奖励更小的&#160;奖励。如果受试者能够监控自身的记忆状态，那么当其记忆较弱时，就应当选择拒绝参加测试（相关综述见：7,8,9,10）。
在过去的几十年中，为人类和非人类灵长类动物11以及鸽子12开发的实验程序已被多方面改进，用于进一步检验猴子是否存在元记忆能力1,2,13。其中最具开创性的研究或许是Hampton1所采用的延迟匹配样本测试（delayed match-to-sample test, DMTS）。在完成匹配样本（MTS）任务的训练后，研究人员调整了样本呈现与测试之间的延迟时间，使任务难度处于中等水平，从而使猴子有一定概率记住或遗忘样本。在延迟之后，猴子被给予选择是否参加测试的机会。结果显示，当猴子主动选择接受测试时，其表现显著优于被迫必须参与的试验，这表明猴子能够监控自身对样本的记忆强度1。
迄今为止，大多数元记忆范式均采用视觉或听觉刺激，这并不令人意外，因为研究最为广泛的物种是高度依赖视觉的非人类灵长类动物例如11,14。在有关大鼠元认知的少量先前研究中，所使用的感官模式也同样是视觉或听觉15,16,17,18。鉴于最近在基于气味的任务中已获得元认知反应的有力证据19，此前在大鼠中得出的不确定结果可能是由于缺乏标准化的实验范式所致。我们设计了一种范式19，借鉴了上述在猴子中使用的DMTS范式1，并充分利用大鼠最主要的感觉——嗅觉。本文所描述的任务要求大鼠在装有沙子的杯子中挖掘以获取食物奖励，从而利用了啮齿类动物天然的挖掘行为。
可以使用此处介绍的基于气味的延迟匹配样本任务（DMTS）来评估大鼠的元记忆能力。首先建立食物奖励的等级体系，使受试动物表现出对更高价值奖励的明显偏好。随后训练大鼠通过挖掘带有气味的沙子来获取奖励。在呈现一个有气味的样本杯后，受试动物必须从四个气味各不相同的杯子中选择其中一个。与样本杯气味相同的杯子底部埋有奖励。当大鼠在基本的匹配样本（MTS）测试中表现熟练后，针对每只大鼠调整其记忆保持间隔（RIs），使其表现的成功率维持在40%至70%之间。在2/3&#160;的试验中，允许大鼠选择放弃记忆测试，以换取一个较不偏好的奖励。通过比较大鼠在提供放弃测试选项的试验（选择试验）和必须强制进行测试的试验（强制试验）中的表现，来评估其元认知能力。
尽管在此范式中仅测试了Long-Evans大鼠，但该任务也可用于测试其他品系的实验大鼠和小鼠，以进一步研究啮齿类动物的元记忆。此外，测试老龄啮齿类动物或具有阿尔茨海默病病理特征的转基因小鼠也将有助于更好地理解记忆障碍如何影响元认知过程。

<table><tbody><tr><td>果圈早餐麦片</td><td>Kellogg's&amp;nbsp;</td><td>B00I8QZ4HM</td><td>加糖麦片&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>社交行为检测室&amp;nbsp;</td><td>Noldus Technologies&amp;nbsp;</td><td>46503 / 46553</td><td></td></tr><tr><td>黑色贴膜纸&amp;nbsp;</td><td>Con-Tact&amp;nbsp;</td><td>B000KKMO90</td><td></td></tr><tr><td>硬纸板&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>陶瓷小动物食盘&amp;nbsp;</td><td>Norpro</td><td>B00061N0QO</td><td>直径7 cm，高3.8 cm</td></tr><tr><td>儿童用沙子&amp;nbsp;</td><td>ACTIVA</td><td>B004BNBXJ4</td><td>白色沙子</td></tr><tr><td>强力胶带</td><td>3M</td><td>B001HT720O</td><td>黑色强力胶带</td></tr><tr><td>肉桂&amp;nbsp;</td><td>Simply Organic&amp;nbsp;</td><td>FNTR07824</td><td>Amazon&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>咖啡</td><td>Folgers&amp;nbsp;</td><td>B016KZTPJU</td><td>Amazon&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>红椒粉&amp;nbsp;</td><td>Simply Organic&amp;nbsp;</td><td>B06XB9QGVB</td><td>Amazon&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>百里香&amp;nbsp;</td><td>Simply Organic&amp;nbsp;</td><td>579193</td><td>Amazon&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>彩色沙子&amp;nbsp;</td><td>Sandtastik Products&amp;nbsp;</td><td>B000Q4O9UW</td><td>橙色沙子&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>70% 异丙醇&amp;nbsp;</td><td>Swan</td><td>B00HKDI6WO</td><td>Amazon&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>手持式吸尘器（真空吸尘器）&amp;nbsp;</td><td>Black + Decker</td><td>B01DAI5BZ2</td><td>无线吸尘器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>金属轨道&amp;nbsp;</td><td>Home Depot&amp;nbsp;</td><td>EC751BA</td><td>用于检测室的门结构&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>刮铲</td><td>Chef Craft&amp;nbsp;</td><td>B00B0M5LQK</td><td>呈直角弯曲，用于将样品杯放入检测装置中</td></tr></tbody></table>

使用基于气味的延迟匹配样本测试法检测大鼠的元认知反应

Testing for Metacognitive Responding Using an Odor-based Delayed Match-to-Sample Test in Rats

元记忆涉及评估自身记忆强度的认知能力。为了探索非人类动物中是否存在元记忆，研究人员已设计出多种行为任务，其中许多任务包含允许被试拒绝接受记忆测试的选项。为评估大鼠的元记忆，我们采用了这种“拒绝测试”选项范式，将先前为灵长类动物开发的视觉延迟匹配样本测试（DMTS）1,2 改编为适用于啮齿类动物的基于气味的测试。首先，&#160;让大鼠通过挖掘装有带气味沙子的杯子来学习并记住一个样本气味。经过一段延迟后，大鼠会面对四个不同气味的杯子，其中一个杯子的气味与之前样本中的气味完全相同；如果大鼠选择该匹配的杯子，则会获得更偏好、更大的奖励。若选择其余三个不匹配的、装有带气味沙子的杯子，则无法获得奖励。记忆保持间隔时间根据个体进行调整，使被试的正确率维持在40%至70%之间，从而确保大鼠有时能记住样本气味，有时则会遗忘。在此实验中，元记忆的操作性定义是指个体通过行为反应区分记忆存在与否的能力。为此，在三分之二的试验中，除四个选择杯子外，还会提供一个“拒绝测试”选项（选择试验）。如果大鼠选择该“拒绝测试”选项——即一个无气味但颜色标记的沙杯，则会获得较小且较不偏好的奖励，并可避免进行记忆测试。而在其余三分之一的试验中，不提供“拒绝测试”选项（强制试验），此时当大鼠遗忘样本气味时，只能猜测正确的杯子。在选择试验中，若大鼠具备元记忆能力，当记忆较弱时应选择“拒绝测试”选项，而非冒险参加测试并做出错误选择。因此，选择试验中的表现显著高于强制记忆测试的表现，表明被试适应性地使用了“拒绝测试”反应，反映了元认知行为的存在。

为了研究受试者的元认知反应，需将正确完成的强制试验比例（基线记忆表现）与正确完成的选择性试验比例进行比较，其中选择性试验是指存在“放弃选项”的试验。若选择性试验的准确率显著高于强制试验，则表明结果为阳性（图2A）。该结果说明大鼠可能在监测自身的记忆状态，并在记忆较弱时选择放弃任务，从而在存在放弃选项的选择性试验中表现出准确率的提升。
如果在选择性试验中的表现准确度与强制性试验相比没有显著提高，则结果为阴性。这种在大鼠中缺乏元记忆证据的假设情况（图2B）表现为：在样本已被遗忘的试验中，未能使用退步测试选项，而在此情况下使用该选项本应是有利的。
如果进行了泛化测试，当受试者拒绝无样本试次的频率显著高于正常样本试次，并且拒绝双样本试次的频率显著高于正常样本试次时，则表明其元认知表现良好。拒绝行为应与记忆准确性呈负相关，即在强制试次中的准确率越高，拒绝率应越低。如果强制试次中的准确率不随试次条件而变化，则应调整参数（例如，增加反应间隔RI），因为此时无法判断受试者是否表现出元认知行为。在混合延迟测试中，受试者在自主选择测试中的准确率应显著高于强制测试中的准确率，且受试者更倾向于拒绝反应间隔较长的测试，而较少拒绝反应间隔较短的测试。有关泛化测试及其相应解释的更多细节，请参见结果论文19。
<img alt="啮齿类动物在MTS任务箱中进行偏好与记忆训练的实验装置及流程图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57489/57489fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1．实验装置与流程示意图。A) 实验装置照片，经许可改编自文献19。 B) 实验流程。 第一步为适应性训练，即训练大鼠在装有沙子的杯子中挖掘，该过程持续两个晚上。随后，大鼠将适应实验装置，并在装置内的沙杯中进行挖掘训练。接着，让大鼠在两种奖励之间进行选择，分别用绿色三角形和红色新月形表示（完整谷物片 vs. 四分之一大小的谷物片）。当大鼠对其中一种奖励表现出显著偏好后，即进入MTS训练阶段，此时杯子中填充带有气味的沙子，气味以肉桂、红椒粉、百里香和咖啡的图像表示。若连续两个训练阶段的成功率低于50%，则继续进行MTS训练；若大鼠的成功率达到50%或更高，则进入延迟滴定阶段。在延迟滴定阶段，大鼠继续进行MTS训练，但在样本阶段与测试阶段之间引入时间延迟（起始为0秒）。若大鼠的记忆准确率高于70%，则增加延迟间隔（RI）；若准确率低于40%，则减少RI，并继续MTS训练。此循环持续进行，直至大鼠在连续两个阶段中的准确率稳定在40%至70%之间。此时，大鼠进入正式实验测试阶段，该阶段包含随机混合的强制试次和选择试次。 <a href="/files/ftp_upload/57489/57489fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="柱状图比较强制与选择结果；标注统计学显著性；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57489/57489fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2阳性结果表明存在元认知反应，假设的阴性结果表明缺乏元认知反应。A） 阳性结果改编自 19 经许可。正确回答的平均比例 强制的 和 选定 试验数据来源于9只大鼠每只完成120次试验的表现。*=p&lt;.05，采用配对双尾t检验。选择试验中正确回答的试验比例显著高于强制试验，表明受试者恰当地使用了拒绝测试反应。 B) 在强制选择和自主选择试验中，正确回答的试验比例相当，表明未依据记忆强度对试验进行降级处理。虚线表示偶然水平（0.25）。误差线代表均值的标准误。 <a href="/files/ftp_upload/57489/57489fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了一种用于研究啮齿类动物元记忆（即记忆意识）可能性的方法。基于气味的延迟匹配样本范式是一种新颖的、具有生态相关性的行为测试，可用于确定啮齿类动物在多大程度上能够根据对自身记忆状态强度的认知监控而作出适应性反应。

元记忆涉及评估自身记忆强度的认知能力。为了探究非人类动物是否存在元记忆，……

本实验的总体目标是通过向实验动物提供可选择回避的记忆测试，来确定啮齿类动物进行元认知反应的程度。该方法有助于回答比较心理学领域的一些关键问题，例如确定大鼠监控自身记忆的能力程度。该技术的主要优势在于，大鼠较容易学会该任务，因为它利用了大鼠天然的觅食行为及其主要依赖的嗅觉功能。该技术经过精心设计，以确保行为测试的结果具有有效性和可靠性。例如，我们将试次间间隔与采样气味的刺激集大小相平衡，以实现最佳的记忆干扰效果。这一方法的构思源于先前在猴子中使用视觉刺激的类似范式，以及一些不相关的实验——在那些实验中，大鼠通过挖掘装有沙子的杯子来记忆所呈现的气味。该文字方案描述了测试装置的组装、大鼠对测试装置的适应过程，以及大鼠在沙杯中挖掘以获取食物奖励的行为。一旦建立显著的食物偏好，大鼠即可进入样本匹配训练阶段。进行此项测试前，应预先准备好四种不同气味的沙杯，且沙杯存放时间不得超过一周。将带气味的沙子储存在密封良好的玻璃容器中。每次匹配样本测试包含六次试验，每次试验之间间隔四分钟。动物要通过此训练，大鼠必须在连续两个测试阶段中，每个阶段至少有三次正确识别出隐藏的奖励。为了设置匹配样本测试，将每种有气味的沙子各取半杯倒入四个杯子中。然后根据软件随机指定的位置，将杯子等距离地放置在装置任务区域的入口门附近。接下来，在伪随机选定的正确气味杯子中埋入一整块奖励物。切勿连续使用同一个杯子超过两次。同时，将半块奖励物埋入一个气味相同的样本杯中。将奖励物埋入沙杯中，深度至少达到杯底的一半。通过向大鼠呈现样本气味来开始测试。将大鼠放入样本室，经过中间的延迟室。然后使用弯头刮铲将装有半份奖励的杯子 lowered 放入室内。一旦大鼠开始食用奖励，立即移除杯子。待大鼠吃完奖励后，抬起纸板隔板，使其进入延迟室，并打开通往多目标序列（MTS）任务区域的隔板。一旦大鼠做出选择并取回存在的奖励（如有），立即将其从实验箱中取出，并放入转运笼中。大鼠可能会嗅闻每个杯子，而且很可能确实会这样做，但只允许大鼠挖掘其中一个杯子。如果它选择错误，应迅速将其移开，以防止其选择其他杯子。一旦放入转移笼中，开始为期四分钟的ITI（间隔时间），并用遮挡物挡住笼子，使大鼠无法看到下一次试验的设置。在休息期间，吸除可能洒出的沙子，用70%异丙醇清洁操作箱，移除未食用的奖励物，并根据需要补充沙杯。然后准备下一个伪随机选择的样品杯，放入半量奖励物。设置好任务区域，进行下一次试验。当会话结束后，将大鼠放回其居住笼中，并开始测试下一只大鼠。完成匹配样本任务（MTS）后，进入延迟匹配样本（Delayed Match-To-Sample, DMTS）测试，以建立延迟标准。该任务与MTS类似，但本质上是在给予大鼠样本刺激与允许其执行测试之间增加一个保持间隔。当大鼠的成功率在40%至70%之间时，延迟间隔已足够使其进入强制选择与自由选择试验阶段。在开始强制选择与自由选择试验之前，首先进行两次试验，其中大鼠仅在任务房间内找到拒绝杯。拒绝杯中装有颜色和质地不同的沙子。其加载的奖励量为四分之一大小。强制选择与自由选择试验类似于延迟匹配样本（DMTS）测试，但在12次测试中的8次，下降杯会出现在与四个匹配样本测试（MTS）杯相对的腔室一侧。每只大鼠进行10次强制选择与自由选择试验。每次试验中，当大鼠进入延迟室时，注意观察大鼠是首先向左转向斜坡杯，还是向右进行 MTS 测试。此为视角元记忆选择。经过两个阶段后，计算大鼠在强制试验中的准确率。如果大鼠的准确率达到70%以上或降至40%以下，则停止强制选择与自由选择测试，返回至DMTS测试。当大鼠在连续两次DMTS测试中的准确率再次处于40%至70%之间时，再恢复强制选择与自由选择测试。此外，若连续两次测试中，大鼠对退减杯的选择趋近于0%或100%，则应暂停测试，并考虑调整退减杯中的奖励量。目标是使放弃选择率保持在10%至40%之间。在进行强制选择与自由选择测试期间，需按照文本方案中所述，每周进行一次偏好检查，以确保大鼠的偏好保持一致。每次试验结束后，务必使用异丙醇清洁测试室。根据各动物所设定的标准延迟时间，可能可以同时测试两只或三只大鼠，此时彻底清洁将尤为关键。为了研究受试者的元认知反应，需将强制试验中正确反应的比例与选择性试验中正确反应的比例（或存在放弃选项的试验）进行比较。若选择性试验的准确率显著高于强制试验，则表明结果为阳性。如果选择性试验的表现准确率与强制试验相比无显著提高，则结果为阴性。这种假设性的大鼠元记忆缺乏证据，表现为在样本信息已被遗忘的试验中，未能选择使用回避测试选项，而这种选择本应是适应性的。观看本视频后，您应能充分理解如何利用带有气味沙子的延迟匹配样本测试来检验大鼠的元认知反应。一旦掌握该方法，只要操作得当，一只大鼠在约45分钟的一次匹配样本测试实验中即可完成测试，具体时长取决于大鼠的延迟时间。在进行该实验操作时，需注意大鼠必须先适应实验装置，对奖励具有明显的偏好，并应选择和监测个体化的记忆保持间隔时间。

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Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

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