用于个体化囊性纤维化跨膜电导调节因子研究的人鼻上皮细胞球体的生成

本实验的总体目标是生成人鼻腔细胞球体，最终可用于功能型CFTR研究的检测。该方法有助于回答囊性纤维化领域中的关键问题，例如在离体模型系统中评估个体受试者对CFTR调节药物的反应。该技术的主要优势在于，仅需少量鼻腔细胞样本，即可在相对较短的时间内生成大量细胞球体，从而支持广泛的实验测试。

本实验操作将由本实验室的技术员 Lauren Strecker 和 Jessica Moncivaiz 演示。按照文本方案在饲养层成纤维细胞上处理并扩增人鼻上皮（HNE）细胞后，将先前配制的扩增培养基、分化培养基、0.1%胰蛋白酶-EDTA 溶液以及无菌 PBS 置于室温下平衡 30 分钟以上。随后用 70%乙醇擦拭容器表面，并将其转移至洁净的生物安全柜中。

在生物安全柜中，使用连接真空泵的巴斯德吸管吸除并弃去HNE培养物的培养基。然后用一支洁净的血清学吸管，加入5 mL PBS洗涤培养皿，轻轻晃动后吸除缓冲液。向培养物中加入5 mL 0.1%胰蛋白酶-EDTA溶液，随后将培养皿放回37°C、5%二氧化碳的培养箱中孵育5分钟。

然后在倒置显微镜下以4至10倍放大倍数观察，检查细胞是否已从培养皿上脱落、变圆并漂浮。轻轻敲击培养皿侧面以使细胞脱落；如有必要，将培养皿再次放入培养箱中孵育额外5分钟，直至大多数细胞脱落。接着，使用10毫升血清移液管向培养皿中加入5毫升扩增培养基，收集全部液体至已标记的无菌50毫升锥形管中。

若细胞在经过三轮胰蛋白酶消化后仍贴壁于培养皿上，可使用无菌细胞刮棒轻轻刮下剩余细胞，并用5 mL扩增培养基冲洗刮棒和培养皿，将冲洗液收集至同一已标记的锥形管中。在4 °C条件下以360 × g离心5分钟。吸除上清液，加入1 mL扩增培养基重悬细胞沉淀。

然后使用血细胞计数板对细胞进行计数。根据制造商的说明，将基底膜基质在冰上解冻。分离适量经不同胰蛋白酶消化处理的传代细胞，使其最终浓度为每毫升基质含500,000个细胞。

对于四孔板，使用 200,000 个细胞，并将其收集至 1.5 毫升离心管中。接下来，将细胞混合物在不超过 360 ×g 的条件下离心 5 分钟。然后使用 1 毫升移液器完全且小心地吸除并弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。

在不进行操作时，将细胞管置于冰上。使用1毫升移液枪头，按每个预定孔加入100微升基底膜基质至细胞中。为避免引入气泡，不要将移液枪头完全排空，上下轻柔吹打，仔细且充分地重悬细胞。

操作需迅速，以避免基质凝固。将100毫升基质等分试样接种至4孔IVF培养板的每个孔中时，使用洁净的剪刀从200微升移液器吸头的末端剪去3至4毫米。小心而缓慢地将100微升细胞基质混合物滴加至每个孔的中央，确保液滴保持球形，且不接触孔壁。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育30分钟，直至凝固。然后小心地向每个孔中加入500微升分化培养基，注意不要扰动基质液滴。确保培养基刚好覆盖液滴，必要时可补充更多培养基。

培养HNE类球体时，使用1毫升移液枪头轻轻吸出孔板中的全部培养基，注意避免触碰基质，以免破坏类球体。然后更换新的1毫升移液枪头，在不接触或扰动基质的前提下，沿基质周围轻轻加入500 µL分化培养基。继续孵育类球体，并按照上述方法每周更换三次分化培养基。

在倒置显微镜下以20倍放大倍数每日评估类球体形态。类球体应在铺板后3至5天内形成，并在约10天内达到成熟。人鼻上皮细胞应在接种后72小时内贴附于培养皿并形成小岛状结构。

此处展示了一周时良好与不良类球体形成的示例。类球体应在15至30天内逐渐扩展并覆盖培养皿。在培养的最初三至四天内，基质中应开始形成微小的囊状结构，并在约10天内逐渐成熟。

若按照所述密度接种，成功的培养物中每个基质液滴将含有50至100个类球体。类球体的管腔可能相对清晰，如同野生型CFTR情况，也可能充满细胞碎片和黏液，如同囊性纤维化（CF）类球体。这两个图示展示了用于界定类球体管腔区域的掩膜方法。

此处展示的是形态不良且不成功的类球体培养物的示例。如这些功能检测图中所示，来自CFTR野生型个体的类球体在受到刺激后应于1小时内发生肿胀，若在CFTR抑制剂inh-172存在下受到刺激，则肿胀程度减小或发生收缩。来自F508del-CFTR纯合子个体的类球体在受到刺激时通常会收缩或仅有轻微肿胀，而在使用CFTR调节剂VX809和VX770进行药物学矫正后，其肿胀程度会增加或收缩程度减轻。

一旦掌握，若操作得当，接种鼻腔细胞球状体可在15至20分钟内完成。进行此操作时，重要的是要牢记在生物安全柜内保持无菌操作，以尽量降低样本污染风险，并避免对自身健康造成任何危害。完成此步骤后，可进一步采用固定、染色和显微镜观察等其他方法，以回答有关细胞形态和组成方面的更多问题。

观看本视频后，您应充分了解如何制备可用于评估CFTR功能的个性化检测的人源性鼻腔细胞原代球状体。请务必注意，操作人源性原代组织可能存在潜在危险，因此在进行本实验操作时，应始终采取适当的安全防护措施，例如正确使用个人防护装备。