基于蜕皮激素受体的单基因开关用于稳健、可逆且泄漏极低的外源基因精确表达

本实验的总体目标是通过给予化学诱导剂甲氧虫酰肼来调控外源基因的表达。该方法有助于回答细胞与分子生物学领域中的关键问题，例如在需要于特定时间以特定强度诱导目的基因表达的情况下。该技术的主要优势在于，通过将外源基因表达所需的所有元件整合于单一载体中，仅需给予化学诱导剂甲氧虫酰肼即可启动外源基因的表达。

根据文本方案对EGFP或ANKRD13A转基因进行亚克隆后，准备四个细胞培养皿，每个培养皿中加入5毫升含5%至10%胎牛血清（FBS）及抗生素的DMEM培养基（下文简称培养基），并接种新传代的HEK 293细胞。将细胞维持在37摄氏度环境中。当细胞密度达到50%至60%时，在200微升稀释液中加入3微升转染试剂，该稀释液中含有目标DNA。

室温孵育反应30分钟后，将混合物加入HEK 293细胞中。使用两皿细胞进行转染，另两皿不作处理作为对照。将细胞在37°C条件下孵育12至24小时。

孵育后，向其中一个转染样品和其中一个未转染对照样品中加入Teb。其余两个样品不作处理，作为实验对照。将培养板孵育12至48小时。

若使用 EGFP 插入片段，需在荧光显微镜下分析 EGFP 表达情况。否则，为进行免疫印迹实验而收集细胞时，先用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，然后用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下，并转移至 15 毫升锥形管中。

接下来，在18至25摄氏度下，以21,000 ×g离心2分钟。弃去PBS后，向沉淀中加入0.5毫升冰预冷的哺乳动物蛋白提取试剂（M-PER）和蛋白酶抑制剂。通过多次移液重悬细胞。

然后，将细胞悬液在18至25摄氏度及室温下孵育15分钟。在21,000 × g及4摄氏度条件下离心细胞裂解物10分钟。随后，将水相上清转移至新的1.5毫升微量离心管中，并使用相应的抗体通过免疫印迹法进行分析。

为了终止 Teb 刺激，从细胞中移除含有 Teb 的培养基，并用预热的 PBS 清洗细胞两次。然后加入 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶/EDTA，于 37 摄氏度孵育 1 分钟。向细胞中加入 10 毫升预热的不含 Teb 的培养基，并使用细胞刮刀收集细胞。

将细胞转移至15毫升锥形管中。然后在18至25摄氏度下以21,000 ×g离心2分钟。用50毫升预热的不含Teb的培养基重悬细胞，并将5毫升细胞悬液分别转移至三个新的60毫米细胞培养皿中。

将细胞分别在 37 摄氏度下孵育 24、48 和 72 小时。最后在不同时间点收集细胞，并通过免疫印迹法检测外源基因的表达水平。在本实验中，为评估 pEUI-plus-EGFP 的活性和渗漏性，无论是否用 Teb 处理，空载质粒转染组均未显示荧光信号。

然而，pEUI-plus-EGFP 转染细胞对逐渐增加的 Teb 量表现出渐进性的敏感化。更重要的是，未经 Teb 处理的 pEUI-plus-EGFP 转染细胞未产生任何可检测到的 EGFP 信号。使用 FLAG 标签标记的 ANKRD13A 进一步验证了 pEUI-plus 对 Teb 的响应性。

如使用抗FLAG抗体进行的Western印迹所示，转染的HEK 293细胞在经Teb处理24小时后表现出强烈的ANKRD13A表达。此外，去除Teb后ANKRD13A表达消失，表明pEUI-plus基因开关具有可逆性，因为在未添加Teb培养的细胞中已无法检测到ANKRD13A。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一小时内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要始终牢记几乎所有的实验步骤都必须在无菌条件下进行。在完成该操作后，还可应用其他方法，例如 Tet-On 或 Tet-Off 系统，以实现两个不同外源基因的差异性表达。该技术建立后，为细胞生物学领域的研究人员探索细胞水平的分子生理学奠定了基础。

观看本视频后，您应能充分理解如何使用 pEUI-plus 基因开关载体，以在期望的时间和强度下诱导外源基因的表达。请务必注意，使用虫酰肼（tebufenozide）可能存在危害，因此在操作过程中应始终采取预防措施，例如穿戴实验服。