Name: 对西方玉米 Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera、生殖转化胚胎或 CRISPR/Cas9 基因组编辑的显微注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学习对西方玉米根虫Diabrotica virgifera virgifera胚胎进行显微注射的方法，实现CRISPR/Cas9基因组编辑和生殖系转化。该技术为研究害虫抗性机制提供了重要的功能基因组学工具。

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本研究得到了孟山都玉米根虫知识研究计划（项目编号 AG/1005，授予 MDL 和 YC）以及北卡罗来纳州立大学（NCSU）为 MDL 提供的启动资金支持。FC 的研究还得到了孟山都玉米根虫知识研究计划（AG/1005）和美国国家科学基金会（项目编号 MCB-1244772，授予 MDL）的资助。作者声明无利益冲突。FC 和 MDL 构思并设计了实验；FC、PW 和 SP 执行了实验；FC 和 MDL 分析了实验结果；FC、NG 和 MDL 撰写了论文。我们感谢 Teresa O'Leary、William Klobasa 和 Stephanie Gorski 在西部玉米根虫（WCR）筛选工作中提供的专业协助。我们还感谢美国农业部农业研究局北中部农业研究实验室（南达科他州布鲁金斯市）的 Wade French 博士提供用于建立实验室种群的虫卵以及饲养方案。

1. WCR 成虫的群体水平饲养
<ol>
	<li>从可靠的公司或研究实验室获取足够数量的WCR成虫（500–1,000只）（参见材料表中的示例），并放入30 cm3的笼子中。 
	注意：强烈建议使用非滞育品系。</li>
	<li>按照制造商的说明制备WCR人工饲料，并将约1 cm厚的饲料层倒入38 oz容器中（参见材料表）。混合后，未使用的饲料可在4 °C下保存最多2个月。</li>
	<li>将含有成虫饲料（10&#160;–15 g）的培养皿（100 × 15 mm）放入30 cm3的笼子中。当食物不足或变干时，及时补充饲料。</li>
	<li>将一个装有水的烧瓶（300 mL）放入笼中，瓶口用棉球封住，用于固定棉条（6&#34; × 3/8&#34;），作为水源。当水量减少时，及时更换水。</li>
	<li>将WCR饲养于昆虫培养恒温箱中，条件为26 °C、60%湿度和14:10的光暗周期。</li>
</ol>
2. 胚胎收集与排列
<ol>
	<li>使用无菌的100 × 15 mm培养皿，以1%琼脂水溶液制备卵收集装置2 培养皿。琼脂凝固后，于 4 °C 保存。</li>
	<li>为收集新产的卵，将一层滤纸和四层纱布（每层均裁剪至合适大小）依次放置在琼脂表面图1A). 
	注意：纱布在使用漂白剂清洗并经高压灭菌后可重复使用，但首次使用时无需进行此处理。滤纸不应重复使用，且无需灭菌。</li>
	<li>将卵收集板尽可能在当天晚些时候（工作日结束时）放入WCR笼中，并用锡箔帐篷覆盖。过夜放置。 
	注意：将光照时间设置为上午10点至午夜12点（共14小时）可延迟产卵，从而便于收集更年轻的卵用于显微注射，且无需实验人员在深夜将收集装置放入饲养笼中。</li>
	<li>在上午8点或9点左右取下卵收集室。</li>
	<li>使用镊子一次夹取一层纱布，放入盛有水的烧杯（500 mL）中，通过轻轻搅拌将卵从纱布上洗下图1B 和1C).</li>
	<li>使用移液管将卵转移至另一个装有水的烧杯（500 mL）中。重复2–3次以清洗卵。</li>
	<li>使用移液管将卵转移到滤纸上图1D）同时尽量减少水分的带入量。</li>
	<li>将黑色滤纸裁成与载玻片等宽的纸条，用胶带将其牢固地固定在载玻片上，确保滤纸平整贴合（图2A). 
	注意：黑色滤纸可通过减少反射光量来提高显微镜下的可见度。</li>
	<li>使用无毒胶水（参见 材料表 （例如）以细线形式滴加到滤纸上的图2B胶线宽度应小于卵的直径，以避免卵被胶水包裹。</li>
	<li>使用细毛刷将西部玉米根虫卵从滤纸上逐一轻轻移至胶线上。尽量在胶水未干前将虫卵放置于胶线上，并保持&#160;每个卵之间至少保持一个卵的距离。</li>
	<li>通过在一张滤纸载片上放置多排卵，以最大化注射效率（图3).</li>
	<li>将所有卵放置在滤纸后，需等待胶水完全干燥后再进行显微注射。 
	注意：对于生殖系转化和CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，需在中午12点前完成所有胚胎的注射，以确保最老的胚胎不超过19小时。然而，对于RNA干扰（RNAi），并无时间限制，因为在西部玉米根虫（WCR）中，双链RNA（dsRNA）可在细胞间移动。事实上，对于RNAi而言，使用较老的胚胎可能获得更高的存活率。</li>
</ol>
3. 质粒DNA和注射针的制备
<ol>
	<li>使用无内毒素的商用试剂盒制备高质量的超螺旋质粒DNA（示例参见材料表）。</li>
	<li>配制注射溶液时，先测定每种质粒的浓度，然后将辅助质粒（终浓度250 ng/µL）、供体质粒（终浓度750 ng/µL）和酚红缓冲液（终浓度20%）混合。短暂涡旋混匀后，以最大速度离心3分钟，以沉淀可能堵塞针头的颗粒。</li>
	<li>使用Flaming/Brown型微电极拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃针（外径1 mm，内径0.58 mm，长度10 cm）。储存时，将拉好的针固定在培养皿或其他透明容器内的双面胶带上。 
	注：微电极拉制仪的设置参数为：Heat = 335，FIL = 4，VEL = 40，DEL = 200，PUL = 100。</li>
	<li>使用微加样吸头（见材料表）将0.5–1.0 µL溶液沿针管内壁注入靠近锥形末端处，完成注射针的后向填充。如有气泡，需从针尖处去除。</li>
	<li>将注射针插入针头夹持器中。</li>
	<li>用精细镊子轻轻折断针尖，或轻轻触碰/拖动针尖于盖玻片或载玻片表面，以打开针尖开口。 
	注：目标是获得能够使注射混合物顺利流出的最小开口（较小的开口通常需要更高的注射压力）。斜面针头无需此步骤，因其已预先开口。</li>
</ol>
4. 显微注射及注射后护理
<ol>
	<li>使用细小的画笔，用无菌水小心润湿1-3枚卵的表面，插入针头，然后注入溶液。注射&#160;在卵表面干燥前完成每个卵的注射。注射时观察卵内是否出现少量红色，以确认显微注射成功。对于外观受损、空卵或无法注射的卵，应予以压碎或移除。 
	注意：尽管注射压力因针头孔径大小而异，但10 - 13 psi是一个合适的起始范围。</li>
	<li>所有卵注射完毕后，从载玻片上移除滤纸。</li>
	<li>将滤纸置于1%琼脂平板（如上所述）的表面。</li>
	<li>用塑料封口膜密封培养皿，置于26 °C昆虫培养用培养箱中培养12天。 
	注意：石蜡膜有助于防止培养皿间霉菌的交叉污染。然而，任何其他抑制霉菌和细菌生长的处理措施可能会降低注射胚胎的存活率。</li>
</ol>
5. 胚胎的培养与孵化
<ol>
	<li>从注射后第12天开始检查胚胎，观察新孵化的幼虫，并在接下来的2周内每天持续检查。</li>
	<li>使用细刷将幼虫转移到含有发芽玉米和土壤的饲养盒中。 
	注意：琼脂培养皿中可能会生长霉菌，但在大多数情况下幼虫仍能正常孵化。需仔细在霉菌中寻找幼虫，以确保全部捕获。部分幼虫可能会移动到培养皿盖上，并可能被困在冷凝水滴中。</li>
	<li>按照标准的西部玉米根虫（WCR）饲养方法，在26 °C条件下饲养幼虫25。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管已有报道通过显微注射dsRNA对西部玉米根虫（WCR）进行RNA干扰9，但本方案是首个建立针对WCR合子前胚胎显微注射最佳操作规范的实验流程，该技术对于在此物种中开展生殖系转化和/或CRISPR/Cas9基因组编辑至关重要。WCR胚胎显微注射的成功以及转化效率的高低依赖于多种因素。下文将讨论影响本方案在该甲虫中用于生殖系转化效果的一些主要问题。
获取前细胞胚胎 
如上所述，DNA 无法像双链 RNA（dsRNA）那样穿过细胞膜。这意味着在细胞化发生之前注射 DNA、mRNA 和/或蛋白质至关重要。由于注射时机极为关键，因此有必要根据非滞育西部玉米根虫（WCR）品系完成发育所需的时间，确定一个可能成功的显微注射时间窗口。30 完成胚胎发生。这是基于对另一种甲虫合胞体囊胚阶段时间的详细研究计算得出的。 赤拟谷盗。在 赤拟谷盗约在30 °C条件下产卵后8小时发生细胞化31</...

西方玉米根虫（WCR），Diabrotica virgifera virgifera是玉米的重要害虫1有趣的是，西部玉米根虫（WCR）似乎比大多数农业害虫更快地突破防控措施，因为它们不仅在生理上产生适应，还在行为上发生改变。2,3,4,5,6近十年来，RNA干扰（RNAi）作为一种强大的功能基因组学工具，已被研究用于玉米根萤叶甲（WCR）的潜在防控方法。7,8，并且还被用作研究基因功能的方法9然而，尽管在其他物种中RNAi通常通过显微注射双链RNA（dsRNA）来实现，但在西部玉米根虫（WCR）中基于注射的RNAi却较为罕见。事实上，关于WCR中RNAi的研究报道仅有少数几例 通过 将dsRNA显微注射到WCR中9原因是WCR能够实现高水平的基因敲低 通过 摄入dsRNA7,10甚至可通过向母体喂食dsRNA来研究胚胎效应11. 尽管该方法使西部玉米根虫成为功能基因组学分析的理想对象 通过 RNAi 技术的应用已减缓了该物种胚胎显微注射方法开发的进展。
尽管RNAi技术具有强大功能，但也存在一些局限性。例如，并非所有基因对RNAi的响应程度相同。这种变异性可能使功能基因组学实验结果的解读变得更加困难。此外，RNAi效应是短暂的，无法产生可遗传的突变。相比之下，生殖系转化作为一种功能基因组学工具，可通过将带有标记的转座元件插入基因组，从而产生可遗传的突变via插入标记的转座元件到基因组中12,13。这使得生殖系转化成为构建突变品系以用于长期遗传学研究的理想工具。此外，通过向突变基因组中导入基因的功能性拷贝，转化技术还可用于突变的挽救14。更重要的是，生殖系转化是多种分子遗传学技术的基础。除了用于基因功能的敲除和/或挽救外，生殖系转化还可应用于增强子捕获15、基因捕获16、基于Gal4的异位表达17以及全基因组范围的诱变18。
最近，人们开发出能够实现复杂基因组编辑的工具&#160;。这些工具包括转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）以及CRISPR/Cas9核酸酶系统19,20。这些新工具的优势在于，研究人员几乎可以在任意基因组中的几乎任何位置诱导产生双链DNA断裂。一旦发生断裂，细胞可通过非同源末端连接方式进行修复，从而在靶向基因中引入缺失或插入；或者通过同源定向修复方式进行修复，在提供工程化修复模板的情况下，可实现整个基因或基因区域的替换21,22。然而，这些方法需要将DNA、RNA和/或蛋白质显微注射到早期胚胎中。
重要的是，与用于RNAi的dsRNA不同，用于种系转化和基因组编辑的核酸和蛋白质难以穿过细胞膜。因此，质粒DNA、mRNA和/或蛋白质的显微注射必须在合胞体胚盘阶段进行即 在昆虫胚胎细胞化之前）。这使得注射时机成为一个关键因素。例如，在 黑腹果蝇，胚胎需要在产卵后两小时内进行注射12因此，建立高效的西部玉米根虫胚胎显微注射方案时，必须综合考虑雌虫产卵的最佳条件以及收集足量合子期前胚胎的有效方法。
为了将多种分子遗传学工具应用于西部玉米根虫（WCR）的生物学研究，需要建立收集和显微注射WCR合子前胚胎的方法。本文提供了详细的实验步骤以及实用技巧，以帮助其他研究者在WCR研究中应用基于转化的技术。这些技术不仅可将转基因技术拓展至WCR，用于功能基因组学研究，还可在此类具有重要经济意义的害虫中测试诸如基因驱动23,24等强大的新型害虫防控策略。

<table><tbody><tr><td>定性滤纸（黑色）</td><td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>用于卵子显微注射</td></tr><tr><td>1 oz 容器&amp;nbsp;</td><td>安妮的塑料餐具</td><td>ASET101</td><td>鸡蛋容器</td></tr><tr><td>果蝇琼脂类型 II</td><td>顶点</td><td>66-103</td><td>WCR产卵盘用基质</td></tr><tr><td>轻量镊子&amp;nbsp;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>处理幼虫和蛹&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Clorox 漂白剂1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>清洗玉米和餐具</td></tr><tr><td>卡车司机最爱的黄色</td><td>库尔农场供应公司</td><td>502</td><td>用于饲喂西部玉米根虫的玉米</td></tr><tr><td>显微注射系统（自制）</td><td>NA</td><td>部件 &amp;及详细说明可根据要求提供</td><td>控制注射压力（0-20 psi）</td></tr><tr><td>Elmer's 无毒胶水</td><td>Elmer's Products, Inc.</td><td>E304</td><td>将卵粘附于滤纸上</td></tr><tr><td>epTIPS 微量上样吸头</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>回填针头装填技巧</td></tr><tr><td>Falcon 细胞培养皿</td><td>Falcon</td><td>25383-103</td><td>萌发的玉米 /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;定量级滤纸圆片</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47576C</td><td>制备用于产卵的琼脂培养皿（9 cm）</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>清洗器皿</td></tr><tr><td>普通载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>手持滤纸和卵进行显微注射</td></tr><tr><td>西方玉米根虫（无花粉替代物）</td><td>前沿农业科学&amp;nbsp;</td><td>F9766B</td><td>WCR成虫人工饲料</td></tr><tr><td>大号棉球</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>关闭烧瓶</td></tr><tr><td>Globe Scientific 3.0 mL 小型球状吸头移液管</td><td>Globe Scientific</td><td>137035</td><td>收集并转移卵子</td></tr><tr><td>Leica M165 FC 荧光体视显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>M165 FC&amp;nbsp;</td><td>WCR 筛选</td></tr><tr><td>用于荧光体视显微镜的 DsRed 滤光片组</td><td>Leica</td><td>DSR</td><td>激发滤光片：510-560 nm，发射滤光片：590-650 nm</td></tr><tr><td>EGFP滤光片</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>激发滤光片：440&amp;ndash;520 nm，发射滤光片：510 nm</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView Science</td><td>DP1000_5P</td><td>成年种群饲养笼</td></tr><tr><td>微型画笔</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>Liner 2/0&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>操纵杆显微操作器</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>显微操作仪和持针器</td></tr><tr><td>显微镜XY载物台</td><td>Olympus</td><td>265515</td><td>显微镜载物台（适用于体视显微镜）</td></tr><tr><td>90 号纱布</td><td>在线布料商店</td><td>CHEE90</td><td>用于产卵</td></tr><tr><td>塑料石蜡膜&amp;nbsp;</td><td>佩基尼塑料包装</td><td>PM-996</td><td>显微注射后密封琼脂培养皿/卷尺寸 4 英寸 × 125 英尺</td></tr><tr><td>Percival 培养箱</td><td>Percival&amp;nbsp;</td><td>I41VLH3C8</td><td>WCR饲养室（昆虫养殖培养箱）</td></tr><tr><td>窄口锥形瓶</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>成虫种群用水容器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Griffin 低型烧杯</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>用于蛋液涂抹</td></tr><tr><td>编织棉卷</td><td>里士满牙科棉业公司</td><td>605-3599</td><td>用于成年种群的供水&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养皿（35×10 mm）</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>用于饮食平板</td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>显微注射缓冲液</td></tr><tr><td>基于激光的微毛细管拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>针头拉制仪/加热温度 = 335，填充度（FIL）= 4，拉制速度（VEL）= 40，延迟时间（DEL）= 200，拉制力度（PUL）= 100</td></tr><tr><td>优质表层土</td><td>The Scotts Company</td><td>71130758</td><td>用于种植大麻的土壤</td></tr><tr><td>Reloc Zippit 2 Mil 自封袋</td><td>美国塑料公司</td><td>48342</td><td>显微注射后将培养皿装袋/5x7</td></tr><tr><td>培养皿（100×15 mm）</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>制备用于产卵的琼脂平板 / 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6 盎司容器</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR 单对交配室&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>38 盎司容器</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>幼虫饲养盒/38盎司</td></tr><tr><td>ChoiceHD 16 盎司可微波透明塑料熟食容器</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>幼虫饲养盒/16盎司</td></tr><tr><td>显微注射显微镜&amp;nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>配备XY载物台的显微注射镜</td></tr><tr><td>标准玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>显微注射针</td></tr><tr><td>成年西方玉米根虫</td><td>北中部农业研究中心实验室</td><td>非二酯酶菌株</td><td>来自 Bryan Wade French 博士实验室的申请</td></tr><tr><td>质粒DNA中量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>纯化可用于注射的质粒DNA</td></tr></tbody></table>

西方玉米根虫（diabrotica virgifera virgifera）胚胎的显微注射用于种系转化或crispr/cas9基因组编辑

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

西方玉米根虫（WCR）是玉米的重要害虫，以其能够快速适应害虫管理策略而著称。尽管RNA干扰（RNAi）已被证明是研究WCR生物学的有力工具，但它也存在局限性。具体而言，RNAi本身是瞬时的（即不会导致相关表型的长期孟德尔遗传），并且需要已知靶基因的DNA序列。如果感兴趣表型由保守性较差甚至全新的基因控制，则后一限制尤为突出，因为识别有效的靶点将极具挑战性，甚至不可能。因此，应通过开发可用于创建稳定突变品系并实现对WCR基因组进行序列无关性筛查的新方法，来扩充WCR基因组工具箱中的工具种类。本文详细描述了采集和显微注射核酸至WCR合子前胚胎的方法。尽管本文所述方案旨在创建转基因WCR，但使用相同的流程也可进行CRISPR/Cas9基因组编辑，唯一的区别在于注射入胚胎的溶液成分不同。

在制定本实验方案时，一个重要的考虑因素是显微注射时胚胎发育的阶段。具体而言，种系转化要求在胚胎细胞化之前对DNA进行显微注射，因为DNA难以穿过细胞膜。尝试使用细胞核染料观察WCR胚胎发育各阶段时未能成功，原因是WCR胚胎的去卵壳过程会基本溶解所有维持胚胎完整性的保护膜。然而，这一研究方向又被另一困难所取代——及时获取足量的胚胎。在自然环境中，WCR雌虫将卵产于土壤中，因此在实验室条件下，雌虫仅在黑暗环境中产卵也就不足为奇了，这使得白天短时间内（2–4小时）收集卵变得困难。为克服这一问题，采用单次过夜产卵的方法，结果发现可获得大量胚胎。尽管收集（图1）和铺展（图2）胚胎以进行显微注射的过程较为繁琐，但若操作迅速，本方案可实现对注射时年龄介于2–19小时之间的胚胎进行显微注射；若在当天较晚时间进行注射，则胚胎年龄不得超过24小时。WCR与其他物种发育时间的比较表明，WCR胚胎在产卵后24小时仍应处于前细胞阶段（见讨论部分）。
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本文介绍了收集和显微注射前细胞期西方玉米根虫胚胎的实验方案，旨在进行功能性基因组学检测，如种系转化和CRISPR/Cas9基因组编辑。

西方玉米根虫（Diabrotica virgifera virgifera）胚胎的显微注射用于种系转化或CRISPR/Cas9基因组编辑

西方玉米根虫（WCR）是玉米的重要害虫，以其能够快速适应害虫管理策略而著称。尽管……

本显微注射方案的总体目标是修饰西方玉米根虫的基因组。该方法有助于解答有关西方玉米根虫生物学特性及其快速克服害虫防控手段（如BT毒素和RANI）能力的关键问题。除西方玉米根虫外，该方法还可应用于其他类似物种，例如南方和北方根虫。我最初产生这种方法的想法是在20世纪90年代，当时受邀协助开展西方玉米根虫的注射型RANI实验。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为在实验室中饲养西方玉米根虫是一项劳动密集型工作。目前使用现有技术，其存活率仍然较低。从可靠的公司或研究实验室获取500至1,000只非滞育期的玉米根虫成虫，并将其饲养在30立方厘米的笼子中。将标准的根虫人工饲料储存在约一厘米深的食品储存容器中。未使用的饲料可在4°C下保存长达两个月。喂养根虫时，在100厘米的培养皿中加入10至15克饲料。每个玉米根虫饲养笼中放入一份食物。当食物不足或变干时及时补充。同时，在每个笼内放置一个300毫升的水 reservoir，上面覆盖棉球，作为水源。当水量减少时及时更换。将饲养在笼中的根虫置于昆虫饲养培养箱中，保持26°C、60%湿度及14小时光照与10小时黑暗的光周期。将灯光关闭时间设定在较晚时段（例如午夜），以确保产卵在次日早晨工作开始前完成。首先，收集胚胎。用于收集卵的培养表面，需在直径100毫米的培养皿中加入30毫升含1%琼脂的水。接着，在琼脂上放置一层滤纸，然后再覆盖四层纱布。每层应裁剪至合适尺寸。接下来，在当天尽可能晚些时候，将卵收集板放入根虫饲养笼中，并用锡箔帐篷覆盖。然后在次日早晨，取回卵收集室。使用镊子一次拾取一层 cheesecloth，并放入盛有水的 500 毫升烧杯中。通过在水中搅动清洗 cheesecloth 上的卵。然后，使用移液管将卵转移至另一杯水中进行洗涤步骤。以这种方式清洗两到三次。然后，将清洗后的卵尽可能少地带水转移到滤纸上。接着，用胶带将一片黑色滤纸平整地固定在载玻片上，以增强对比度，制备好载玻片。然后将少量无毒胶水以细线状滴在纸面上，用于固定虫卵。胶水位置应低于虫卵的周长范围。在胶水未干时，用细刷将虫卵轻轻放置于胶线上。每个卵之间至少保持一个卵的距离。每张载玻片上准备多排卵。卵应在30分钟内完成注射。现在，将辅助质粒、供体质粒和酚红缓冲液混合。使用无内毒素商业试剂盒制备的高质量、超螺旋质粒。短暂涡旋振荡以混匀。然后以最大速度离心3分钟，沉淀颗粒物。接着，用0.5至1微升注射溶液回填拉制的硼硅酸盐玻璃针。若产生气泡，务必将其去除。然后，将注射针连接到显微操作器上。如有必要，在显微镜下用精细的镊子轻轻折断密封的针尖，或通过轻轻将针尖触碰玻璃屏障来打开。尽量形成能够释放注射溶液的最小开口。在注射玉米根虫卵之前，使用细小的画笔将一至三个已准备好的卵表面用无菌水轻轻润湿。随后注射湿润的胚胎。将针头轻轻插入胚胎中部，注入少量溶液。开始时使用 10 至 13 psi 的压力，并根据需要调整压力。干燥的胚胎具有明显的圆形形状，通过用水预先润湿每个胚胎，可改变其形状并软化卵壳，从而便于针头顺利刺入。成功注射的胚胎会呈现少量红色。如果卵出现损伤、形态异常或无法注射，则将其压碎或从载玻片上移除。所有卵注射完成后，将带有卵的滤纸转移至含1%琼脂的培养皿中。然后用封口膜密封培养皿，并在26°C条件下孵育，直至幼虫孵化。注射后第12天开始，在接下来的两周内每天检查幼虫。使用细毛刷将幼虫转移至含有发芽玉米和土壤的饲养盒中，在标准条件下进行培养。通过将携带转座酶的质粒与携带转座子的质粒共同注射到卵裂前胚胎中，尝试实现根虫的种系转化。在26只存活个体中，利用每种EFP表达来筛选供体元件的插入。尽管已鉴定出胸刺突后代，但使用强光源对根虫胚胎进行筛选被证明具有致死性。下一轮种系转化使用了由黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）组成型活性启动子驱动的红色荧光蛋白基因。存活率有所提高，但仅记录到一条DS红色阳性的幼虫。接下来，将胚胎显微注射缓冲液，或同时注射辅助质粒和荧光标记的供体质粒DNA。注射质粒或仅注射缓冲液的胚胎孵化比例相似。有趣的是，未注射的胚胎中仅有约一半成功孵化。这表明对胚胎进行注射操作所造成的致死率与实际注射过程本身相当。观看本视频后，您应能充分掌握如何对西方玉米根虫胚胎进行显微注射。掌握该技术后，每小时可注射两三百个胚胎。该方法借鉴了黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）种系转化技术的发展成果，这些技术可作为适用于许多其他物种的模板。采用本实验步骤后，还可进行其他方法，如基于CRISPR/Cas9的基因组编辑，以在西方玉米根虫（Western Corn Rootworm）基因组中实现靶向突变。为了回答有关基因组功能的具体问题。

microinjection-western-corn-rootworm-diabrotica-virgifera-virgifera

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

对西方玉米 Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera、生殖转化胚胎或 CRISPR/Cas9 基因组编辑的显微注射

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