利用二维半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳验证淀粉样或类淀粉样纤维的大小异质性

二维半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳的总体目标是验证在传统SDD-AGE过程中观察到的淀粉样或类淀粉样纤维的大小异质性。该方法有助于回答淀粉样蛋白或蛋白质聚集研究领域中的关键问题，例如在传统SDD-AGE中观察到的大小异质性是纤维在体内的天然状态，还是蛋白质在凝胶电泳过程中发生降解或解离的结果。该技术的主要优势在于可在实验室中轻松进行，无需特殊设备。

除了传统SDD-AGE所用设备外，无需其他额外设备。首先，将产生淀粉样蛋白的HT-29结肠癌细胞接种于10厘米的组织培养皿中。然后，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育细胞过夜。

当细胞达到80%融合度时，使用磷酸盐缓冲液洗涤细胞。然后向细胞中加入3毫升胰蛋白酶，于37摄氏度孵育3分钟。待细胞从培养皿上脱落后，向培养皿中加入10毫升培养基。

然后，将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。接着，在室温下以1,000 × g离心3分钟。离心结束后，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于5毫升培养基中。

使用细胞计数器对细胞进行计数。然后将两块培养板在37摄氏度下过夜培养。接着，向其中一块培养皿中加入TSZ试剂作为处理。

约六小时后，使用塑料刮刀收集细胞。接着，将细胞悬液转移至15毫升锥形管中，在4°C条件下以1,000 × g离心3分钟。然后，用10毫升预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀两次，并重复离心步骤。

接下来，吸除 PBS 溶液，将细胞沉淀转移至 1.5 毫升微量离心管中。向细胞沉淀中加入 0.3 毫升裂解缓冲液，冰上孵育 30 分钟。再次在 4 摄氏度下以 20,000 ×g 离心 15 分钟。

获得的上清液即为全细胞裂解物。向上清液中加入4倍浓度的SDD-AGE缓冲液，配制为20微升、每微升含3微克蛋白的样品。将样品在室温下孵育10分钟。

制备凝胶时，将两克琼脂糖粉末加入盛有 200 毫升 TAE 缓冲液的玻璃烧杯中。然后将烧杯放入微波炉中加热，使琼脂糖完全溶解。接着，加入 1 毫升 20% SDS，使其终浓度为 0.1%。轻轻摇动烧杯混匀。

接下来，将液体琼脂糖倒入一个15厘米×14厘米的凝胶板上。使用1毫升移液器去除任何气泡。然后，在凝胶上方放置一个20孔梳子。

接下来，在凝胶最右侧的泳道中加入约 60 微克的全细胞裂解液。使用含有 0.1% SDS 的 TAE 缓冲液作为电泳缓冲液，以 60 伏电压运行约 4 小时。进行第二向电泳时，小心地将凝胶逆时针旋转 90 度。

然后，以 60 伏电压电泳约 4 小时。在 20 厘米 × 20 厘米的容器中加入 500 毫升转移缓冲液。紧邻容器旁，准备一叠约 5 厘米高的纸巾。

然后，将两张尺寸为 14 × 15 厘米的滤纸浸入转移缓冲液中，放置在滤纸叠的上方。将一张 14 × 15 厘米的 PVDF 膜在甲醇中活化 30 秒。活化后，将膜置于滤纸上，并用滚轮去除所有气泡。

转移过程中最重要的一步是确保凝胶与膜之间不产生气泡。用转移缓冲液冲洗凝胶，然后将其铺在膜的上方。用滚轴排除任何形成的气泡。

接下来，使用塑料薄膜覆盖靠近转膜缓冲液容器一侧的纸巾边缘。然后，将一块尺寸为15厘米×35厘米的滤纸浸入转膜缓冲液中。放置滤纸时，使其一端覆盖在凝胶的上方，另一端置于转膜缓冲液容器内。

用塑料膜覆盖容器，并在室温下静置过夜。第二天，在 20 厘米 × 20 厘米的容器中用 50 毫升 PBST 冲洗膜。接着，向膜上加入 20 毫升含 5% 脱脂奶粉的 PBST 溶液。

然后，将膜置于摇床上，室温孵育30分钟以进行封闭。将10微升兔抗MLKL抗体加入20毫升含5%脱脂奶粉的PBST溶液中，混匀。随后，将抗体混合液加入膜上。

将膜置于摇床上，4摄氏度孵育过夜。然后用20毫升PBST洗涤膜5分钟，此步骤重复5次。

接下来，将4 µL抗兔HRP抗体加入20 mL含5%脱脂奶粉的PBST溶液中。将抗体溶液加至膜上。将装有膜的容器置于室温下的摇床上孵育2小时。

孵育两小时后，用20毫升PBST溶液将膜洗涤五次，每次五分钟。最后，将增强型化学发光底物加入膜上，然后根据制造商的说明将膜曝光于X射线胶片上。

本研究旨在证明在肿瘤坏死因子α处理的细胞所获得的全细胞裂解液中存在SDS抗性的淀粉样纤维。结果显示，RIPK1和RIPK3表现出相似且完全相同的淀粉样结构模式。有趣的是，MLKL纤维似乎具有异质性，其迁移模式与其他蛋白不同。

此图像显示了淀粉样或类淀粉样纤维可能的迁移模式。在第一维 SDD-AGE 中，淀粉样或类淀粉样纤维表现出特征性的弥散条带。在此图像中，纤维在第二次电泳中的迁移方式相同，并在膜上呈现出45度角的对角线迁移模式。

这表明纤维在凝胶电泳过程中未发生降解或解离。相反，如果纤维发生解离，则会在对角线下方出现垂直条带，表明在第二次电泳过程中较小的纤维迁移速度更快。第一维和第二维的 SDD-AGE 结果均显示，MLKL 纤维在 SDD-AGE 过程中并未解离，且确实与 RIPK1 和 RIPK3 纤维不同。

在此图像中，MLKL 纤维在第一维中呈现特征性的弥散条带。然而，相同的纤维在第二维 SDD-AGE 中则显示为一条清晰的对角线，且无垂直拖尾现象。在进行该实验操作时，需注意保持第一维和第二维的所有条件（如电压和电泳时间）一致，以确保形成一条清晰的 45 度角直线。

完成此操作后，可进行其他方法，例如剥离膜并用其他抗体重新孵育，以回答更多问题，例如纤维是否含有其他蛋白质。观看本视频后，您应能够充分理解如何确认在传统的 SDD-AGE 过程中未发生淀粉样或类淀粉样纤维的降解或解离。