Name: 3D 脊髓黑色素瘤球形皮肤模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学习构建三维器官型黑色素瘤球形皮肤模型，用于模拟体内肿瘤结构并研究肿瘤与宿主相互作用。该方法利用悬滴技术生成球体，结合成纤维细胞和角质形成细胞重建皮肤，为黑色素瘤治疗研究提供可靠的体外实验平台。

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作者感谢Hanna Voersmann建立了三维类器官黑色素瘤-球状体-皮肤模型并提供了优秀的实验方案。作者还感谢Silke Busch提供的宝贵技术支持。本工作由德国联邦教育与研究部（BMBF）e:Med项目“Melanoma Sensitivity”（项目编号：031A423A）资助。

所有人体组织相关工作均采用经批准的机构方案进行。
1. 从人皮肤（包皮环切术获得的幼年包皮）中分离真皮和表皮
<ol>
	<li>将包皮（通常为1 - 2 cm）2) 转移至一个无黏附性的无菌细胞培养皿中（&#216; 10 cm）并加入 10 - 12 mL 磷酸盐缓冲液+ （PBS，0.5 mM MgCl₂）2，0.9 mM CaCl2，pH 7.2 = PBS+使用无菌手术刀和镊子去除所有多余的（脂肪）组织。</li>
	<li>将皮肤切成 3 mm × 5 mm 的小片，用 PBS 洗涤后转移至无黏附性的无菌细胞培养皿中（&#216; 6 cm）。用 5–7 mL 分散酶溶液（2 U/mL PBS 配制）覆盖组织块。用石蜡膜密封细胞培养皿，于 4 °C 孵育 16 小时。 &#176;C.</li>
	<li>用两把无菌镊子将表皮从真皮部分分离。将分离的组织片转移至各自的非黏附性细胞培养皿中（&#216; 6 cm）并用 PBS 覆盖每个样本+.</li>
</ol>
2. 从表皮分离原代角质形成细胞
<ol>
	<li>使用巴斯德吸管小心移除细胞培养皿中的 PBS+，并用 PBS 清洗表皮组织片（第 1.3 节）。将表皮切成更小的组织块（1 mm2），收集至 50 mL 锥形管中。加入 10 mL 1× 胰蛋白酶-EDTA（预热至 37 °C），在 37 °C 水浴中孵育 5 分钟。每 2 分钟涡旋振荡组织悬液一次。</li>
	<li>加入 1 mL 胎牛血清（FCS）以终止酶反应。用 10 mL 塑料吸管反复吹打细胞悬液 4 分钟，使细胞重悬。尽量避免产生气泡和泡沫。</li>
	<li>将细胞悬液通过置于新 50 mL 锥形管上方的细胞筛（孔径 100 µm）过滤，并用 5 mL PBS 冲洗 3 次。在 200 × g 条件下离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于 2–6 mL 含 1%（v/v）庆大霉素的培养基中。使用血细胞计数板手动计数细胞，接种 6 × 105 个细胞至 T75 细胞培养瓶中。</li>
</ol>
3. 原代角质形成细胞的培养
<ol>
	<li>将步骤2.3中分离的原代角质形成细胞置于细胞培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下，使用不含FCS的角质形成细胞培养基培养至50–70%融合度。</li>
	<li>传代角质形成细胞时，小心移除培养基，加入5 mL PBS-EDTA，并在37 °C孵育10分钟。在光学显微镜下（4X&#160;放大倍数：细胞呈圆形但仍附着于培养瓶表面）检查细胞是否开始从培养瓶表面脱落。若未脱落，更换为新鲜的PBS-EDTA，再次于37 °C孵育10分钟。</li>
	<li>向仍被10 mL PBS-EDTA覆盖的圆形细胞中加入5 mL 1×胰蛋白酶-EDTA，于37 °C继续孵育1–3分钟。加入1 mL FCS以终止酶反应，将脱落的细胞收集至50 mL锥形管中。在200 × g离心5分钟，将沉淀重悬于角质形成细胞培养基中，并将6 × 105个细胞接种至新的T75细胞培养瓶中。 
	注意：用于构建类器官皮肤重建模型的原代角质形成细胞，传代次数不应超过第3–4代。</li>
</ol>
4. 从真皮中分离原代成纤维细胞
<ol>
	<li>将真皮组织（第1.3节）切成较小的片段（1 mm2），转移至50 mL锥形管中。加入10 mL胶原酶溶液（5 U/mL，溶于PBS+），在37 °C水浴中孵育45分钟。将组织碎片与细胞混合物在200 × g离心5分钟。</li>
	<li>用10 mL含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺但不含L-丙酮酸的DMEM洗涤细胞沉淀两次。最后将组织碎片重悬于2 mL含1%（v/v）庆大霉素和10%胎牛血清（FCS）的DMEM中。转移至T25细胞培养瓶中，在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中过夜孵育。 
	注意：较小的体积有助于成纤维细胞从组织碎片中迁移出来，并促使其附着于培养瓶壁。</li>
	<li>次日早晨，再加入6 mL DMEM/庆大霉素/FCS，于37 °C继续孵育2–3天，直至细胞达到80–90%融合度。</li>
</ol>
5. 原代成纤维细胞的培养
<ol>
	<li>传代成纤维细胞时，移除培养基，并用 PBS 洗涤贴壁细胞。加入 5 mL 1× 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 培育 3 分钟。</li>
	<li>加入 5 mL DMEM/FCS 以终止酶促反应，将脱落的细胞收集至 50 mL 锥形管中。在 200 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于 DMEM 培养基中，并将 6 × 105 个细胞接种至新的 T75 细胞培养瓶中。 
	注意：为构建类器官皮肤重建模型，原代成纤维细胞的传代次数不应超过第 4 至第 6 代。</li>
</ol>
6. 三维黑色素瘤球体的生成 通过 悬滴法
<ol>
	<li>培养黑色素瘤细胞（例如，451-LU 或任何感兴趣的黑色素瘤细胞系）根据通用方案，使用含 10% FCS 的 RPMI 培养15.
	<ol>
		<li>为获得大小和质量相似的黑色素瘤类球体，用 PBS 洗涤黑色素瘤细胞，向 T175 细胞培养瓶中的细胞加入 5 mL 1x 胰蛋白酶-EDTA（溶于 PBS），室温（RT）孵育 3–5 分钟。加入 5 mL RPMI/10% FCS 以中和胰蛋白酶。在 200 × g 离心 5 分钟收集细胞。根据血细胞计数板计数结果，将细胞沉淀重悬于 RPMI/FCS 中，终浓度为 10,000 个细胞/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点 40 × 25 &#181;将细胞悬液中的 L（= 250 个细胞）接种至无菌非黏附性细胞培养皿盖的内表面&#216; 使用电子多道移液器将10 cm培养皿中的溶液吸出。以快速但平稳的动作将皿盖翻转，并放置在含有5 mL PBS的相应细胞培养皿上。
	<ol>
		<li>培养 &#34;悬滴培养皿&#34; 在37℃的细胞培养箱中 &#176;C 和 5% CO2 培养10至14天，具体时间取决于所使用的细胞类型。 
		注意：与来自RGP或VGP期的黑色素瘤细胞相比，处于MM生长阶段的细胞在悬滴中通常生长更快，并形成更致密的球状体。为进行个体化评估，可在双目显微镜或光学显微镜（4X）下观察球状体的生长情况。&#160;放大倍数）。通常，在双目镜或光学显微镜（4×）下，48 小时后即可观察到类球体。&#160;放大倍数）。10至14天后，无需任何放大设备即可观察到。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>初始滴加5天后，加入10&#160;&#181;L 新鲜 RPMI/10% FCS 培养基加入每滴中。随后，更换 10&#160;&#181;每隔一天更换一次培养基。此步骤中使用电子移液器非常有助于操作。</li>
	<li>根据细胞类型，用 PBS 轻轻冲洗细胞培养皿盖，于第 10 至 15 天收集类球体（详见第 10 节）。将类球体收集至新的非黏附性细胞培养皿中。 
	注意：培养时间取决于黑色素瘤细胞最初分离时所处的肿瘤生长阶段。 例如，源自451-LU细胞的球体生长至约500 &#181;在悬滴培养12天内达到直径m15.</li>
</ol>
7. 类器官全层皮肤重建中真皮层的构建
<ol>
	<li>使用置于24孔板中的24孔细胞微孔膜插件（孔径8 µm）制备皮肤模型。 
	注意：请确保使用直立式插件而非悬滴式插件，因为后续步骤中这些插件将被转移至6孔板中进行气液界面培养。</li>
	<li>配制凝胶中和液（GNL）15，以及分别称为MM和内皮细胞生长培养基（EGM）的培养液16,17。为防止凝固，胶原蛋白I型（通常来源于大鼠尾部，浓度为3.5 - 4 mg/mL，溶于0.02 N乙酸）需冰上保存至使用前，因其在室温下会开始凝胶化。</li>
	<li>将每插件1 × 105个成纤维细胞重悬于GNL中，并迅速按1:3的比例将细胞悬液与胶原蛋白混合，终体积为每插件500 µL。通过轻柔吹打混匀，避免产生气泡，因气泡可能影响皮肤重建的质量。</li>
	<li>将各真皮凝胶置于无培养基条件下，在无菌操作台中室温静置30分钟，使其充分沉降。随后每层凝胶覆盖含4.5 g/L葡萄糖、1% L-谷氨酰胺、10%胎牛血清但不含L-丙酮酸的DMEM培养基，并于37 °C孵育过夜。</li>
</ol>
8. 类器官全层皮肤重建中表皮区室的生成
<ol>
	<li>次日，从真皮凝胶中移除培养基，并用EGM培养基（10% FCS、1% PenStrep、10 mg/mL庆大霉素）在37 °C下平衡2小时。吸除培养基后，将重悬于100 µL EGM培养基中的1 × 105个角质形成细胞小心接种至真皮凝胶表面。</li>
	<li>将重建皮肤在37 °C下孵育1.5小时，使角质形成细胞黏附于真皮层。 
	注意：在此孵育期间，由于成纤维细胞诱导的收缩作用，凝胶将开始收缩，从而至少部分脱离插入物的壁面。</li>
	<li>用约800 µL EGM培养基覆盖皮肤等效物，并用小型（白色）移液器吸头小心去除插入物壁上的残余凝胶。将皮肤等效物浸没于EGM培养基中，在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养7天，每隔一天更换一次培养基。 
	注意：在此期间，皮肤等效物将显著收缩。</li>
</ol>
9. 器官型全层皮肤重建的气液界面培养
<ol>
	<li>第8天，将每个插入物转移至6孔板的单独孔中。每孔仅加入1.2 - 1.4 mL MM培养基，使皮肤重建组织从孔底部获得培养基供应，但不被培养基覆盖。 
	注意：气液界面培养可促进表皮部分的分层，并形成完整的角质层（stratum corneum）。</li>
	<li>在接下来的10 - 17天内，每隔一天按照第9.1节所述更换培养基。在此期间，根据需要向培养基中添加药物或其他刺激物。使用弯头镊子小心地将完整的皮肤重建组织从微孔膜插入物上取下，用于进一步分析，例如，免疫组织化学分析（图1）。</li>
</ol>
10. 器官型黑色素瘤球体皮肤模型的构建
<ol>
	<li>为将黑色素瘤类球体整合至类器官全层皮肤重建模型的真皮层，需用 PBS 小心地将类球体（步骤 6.4 后）从悬滴细胞培养皿的盖子上冲洗下来。在无菌非黏附性细胞培养皿中收集每个插件 10 - 20 个类球体。用巴斯德吸管小心去除多余的 PBS。</li>
	<li>用尽可能小的 EGM 体积吸取类球体。此时需用肉眼观察并计数类球体，无需使用任何额外的放大设备。按照步骤 10.1 所述，每个皮肤模型/凝胶取 10 - 20 个类球体。</li>
	<li>将其转移至含有成纤维细胞的所需体积 GNL 中（在步骤 7.3 期间），并与 I 型胶原蛋白混合。从本步骤起，按第 7.3 - 9.1 节所述操作。 
	注意：肿瘤类球体在真皮凝胶中表现为白色斑点（图 2）</li>
</ol>

<ol><li>Boulais, N., Misery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidermis%3A+a+sensory+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The epidermis: a sensory tissue.</a> Eur. J. Dermatol. 18 (2), 119-127 (2008).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+homeostasis%3A+a+balancing+act+of+stem+cells+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 10 (3), 207-217 (2009).</li>
<li>Shain, A. H., Bastian, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+melanocytes+to+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">From melanocytes to melanomas.</a> Nat. Rev. Cancer. 16 (6), 345-358 (2016).</li>
<li>Clark, W. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cutaneous+malignant+melanoma+as+a+model+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Human cutaneous malignant melanoma as a model for cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 10 (2), 83-88 (1991).</li>
<li>Hsu, M. Y., Meier, F., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+development+and+progression%3A+a+conspiracy+between+tumor+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host.</a> Differentiation. 70 (9-10), 522-536 (2002).</li>
<li>Miller, A. J., Mihm, M. C. Jr <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra052166">Melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 355 (1), 51-65 (2006).</li>
<li>Balch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Final+version+of+2009+AJCC+melanoma+staging+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification.</a> J. Clin. Oncol. 27 (36), 6199-6206 (2009).</li>
<li>Eigentler, T. K., Caroli, U. M., Radny, P., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palliative+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma%3A+a+systematic+review+of+41+randomised+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Palliative therapy of disseminated malignant melanoma: a systematic review of 41 randomised clinical trials.</a> Lancet Oncol. 4 (12), 748-759 (2003).</li>
<li>Kim, T., Amaria, R. N., Spencer, C., Reuben, A., Cooper, Z. A., Wargo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+targeted+therapy+and+immune+checkpoint+inhibitors+in+the+treatment+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Combining targeted therapy and immune checkpoint inhibitors in the treatment of metastatic melanoma.</a> Cancer Biol. Med. 11 (4), 237-246 (2014).</li>
<li>Lawrence, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+heterogeneity+in+cancer+and+the+search+for+new+cancer-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes.</a> Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).</li>
<li>Flaherty, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mutated%2C+activated+BRAF+in+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 363 (9), 809-819 (2010).</li>
<li>Rauschenberg, R., Garzarolli, M., Dietrich, U., Beissert, S., Meier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+therapy+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dtsch.+Dermatol.+Ges%22%5BJournal%5D)">Systemic therapy of metastatic melanoma.</a> J. Dtsch. Dermatol. Ges. 13 (12), 1223-1235 (2015).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+the+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Vorsmann, H., Groeber, F., Walles, H., Busch, S., Beissert, S., Walczak, H., Kulms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+three-dimensional+organotypic+skin-melanoma+spheroid+model+for+in+vitro+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death.+Dis%22%5BJournal%5D)">Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing.</a> Cell Death. Dis. 4, e719(2013).</li>
<li>Chen, C. S., Lavker, R. M., Rodeck, U., Risse, B., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+serum-free+epidermal+culture+model+to+show+deleterious+effects+of+epidermal+growth+factor+on+morphogenesis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation.</a> J. Invest. Dermatol. 104 (1), 107-112 (1995).</li>
<li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs+%3A+biological+significance+of+bFGF%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 193-200 (2000).</li>
<li>Sinnberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+PI3K-AKT-mTOR+signaling+sensitizes+melanoma+cells+to+cisplatin+and+temozolomide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of PI3K-AKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide.</a> J. Invest. Dermatol. 29 (6), 1500-1515 (2009).</li>
<li>Niessner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+farnesyl+transferase+inhibitor+lonafarnib+inhibits+mTOR+signaling+and+enforces+sorafenib-induced+apoptosis+in+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib inhibits mTOR signaling and enforces sorafenib-induced apoptosis in melanoma cells.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (2), 468-479 (2011).</li>
<li>Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol. J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍的皮肤型黑色素瘤类器官球体模型，有助于深入理解肿瘤内及肿瘤-宿主间的相互作用，未来可能为研究肿瘤发生及治疗耐药的分子机制提供一个先进的筛选平台。
为确保最佳的生理和 体内 模拟皮肤重建的条件，原代细胞的质量至关重要。如上所述，幼年或产前皮肤细胞的分化程度最低，因此最适合用于生成全层皮肤替代物。第一个可能的质量控制指标是在接种角质形成细胞并使凝胶在EGM中平衡后第2天观察真皮收缩的程度（实验方案第8.2和8.3节）。成纤维细胞质量越高，真皮凝胶的收缩程度越大。此外，成纤维细胞接种过少或过多均可能影响真皮收缩，进而影响表皮层与真皮层之间的结合。这反过来会损害表皮分化，因为该过程依赖于真皮细胞与表皮细胞之间广泛的相互作用。
原代细胞的质量还关键取决于细胞汇合度以及传代次数。如果角质形成细胞培养至≥80%汇合度，它们会立即停止增殖并开始分化。因此，在传代过程中应将其培养至40–70%汇合度，并且使用时不应超过第3–4代。成纤维细胞相对不敏感，但也不应使用超过第4–6代的细胞。还需注意，用于构建类器官型黑色素瘤球状皮肤模型的所有原代细胞和细胞系均在无抗生素条件下培养，因此污染风险较高。然而，添加抗生素会改变单个细胞的生理状态，从而降低皮肤替代模型的质量。
通常，几乎所有类型的肿瘤细胞系以及从患者样本中 freshly 分离的肿瘤细胞均可形成肿瘤球。获得最佳肿瘤球大小所需的初始细胞数量和/或培养时间可能因所用细胞类型而异。当肿瘤球大小不超过 150 - 200 µm 时，其中包含的所有细胞仍可通过简单扩散获得充足的营养供应。只有大小 ≥500 µm 的肿瘤球才会表现出高度的细胞分化，并呈现出无血管化肿瘤组织的典型特征22。
本文开发的皮肤-黑色素瘤类器官球体模型特别适用于在类似体内的条件下研究肿瘤与宿主之间的相互作用以及进行黑色素瘤药物测试15。然而，黑色素瘤在体内的微环境更为复杂，包含多种与肿瘤相关的细胞类型，如免疫细胞和内皮细胞。由于添加合适的原代免疫细胞面临组织相容性问题，这些模型目前尚无法充分监测免疫治疗策略的效果。
尽管如此，黑色素瘤类球体可由 freshly isolated patient material（新鲜分离的患者样本）生成，一旦将其纳入完整的皮肤重建模型，便可作为个体化药物筛选平台。甚至可将黑色素瘤转移灶的组织片段整合入皮肤重建模型中，以在个体化治疗策略中测试药物组合。将器官型三维皮肤-黑色素瘤模型应用于临床前测试，有望确保仅有最具前景的新型治疗方案进入临床试验，从而降低该疾病潜在新疗法在研发过程中的淘汰率，并提高临床试验中治疗成功的概率。

人体皮肤由两个功能不同的区室组成，共同保护机体免受不良环境因素的影响1。位于下方的真皮区室由一种纤维弹性结缔组织构成，其中包含由成纤维细胞合成的、松散连接的胶原蛋白和弹性蛋白纤维，发挥机械屏障作用。真皮与上方的表皮通过基底膜相分隔，基底膜是由于两个皮肤区室之间持续相互作用而形成的细胞外基质。与真皮不同，表皮为复层鳞状上皮，主要由角质形成细胞构成，并可分为四层。基底层由未分化的基底角质形成细胞组成，这些细胞不断由皮肤前体细胞产生，并依次经过棘层和颗粒层，最终分化为角质层，以防止机体脱水和抵御感染2。黑色素细胞排列在基底膜处，通过树突状突起与多个角质形成细胞进行通讯。它们合成黑色素，以保护皮肤组织免受紫外线辐射的有害影响，如皮肤老化、免疫抑制、炎症以及非黑色素瘤皮肤癌的发生。然而，紫外线辐射在黑色素细胞向恶性黑色素瘤转化过程中的具体作用，目前仍有争议3。
黑色素瘤的发展可分为不同的肿瘤进展阶段，其特征是存在特定的遗传学、形态学和组织学改变4。黑色素瘤可为原发性（de novo）产生，也可由先天性或获得性痣因局部黑素细胞增殖增加而引发，导致良性肿瘤形成。这种癌前病变可能转变为结构异常的发育不良组织，其中含有非典型细胞，进而发展为首个恶性阶段——径向生长期（RGP）。这一早期肿瘤进展阶段的特点是细胞在表皮内呈径向增殖，并在乳头层真皮中仅有少量局部侵袭性细胞。随后进入垂直生长期（VGP），此时黑色素瘤细胞已表现出转移性和侵袭性表型，突破基底膜，浸润至真皮深层以及皮下组织5。最终，转移性黑色素瘤（MM）代表最侵袭性的进展阶段，其转移细胞通过血液和淋巴系统全身播散，侵犯远端器官，如肝脏、肺和脑6。
迄今为止，早期诊断后进行手术仍是恶性黑色素瘤最有效的治疗方法。然而，对于发生远处转移的患者，其预后仍然极差7，因为传统的化疗方案仅能带来有限的生存获益8,9。不过，在经历了数十年的停滞之后，近年来靶向治疗的进展已显著改善了恶性黑色素瘤的预后。
两种主要的有丝分裂原激活通路——RAS-RAF-MEK-ERK通路和PI3K-AKT-PTEN信号通路——的失调是黑色素瘤进展的关键驱动因素，尤其是在原癌基因BRAFV600和NRAS发生持续性激活的点突变时尤为显著10。因此，靶向激酶抑制剂的发明为转移性黑色素瘤患者带来了潜在的治疗希望。然而，迄今为止开展的大量临床试验并未为转移性黑色素瘤患者带来显著的临床获益。几乎所有治疗反应均为部分缓解，且有一部分患者表现出原发性耐药。此外，大多数患者在治疗后出现了继发性耐药，导致疾病复发11,12。
显然，仅分析突变状态不足以制定最有效的治疗策略。有必要开发新的快速且可靠的诊断工具，以系统性地记录和分析单个癌细胞的反应性。目前关于人类黑色素瘤的绝大多数数据均来自二维（2D）黑色素瘤细胞培养。然而，三维（3D）培养的肿瘤细胞能够实现不同分化癌细胞亚群之间，以及癌细胞与未转化的周围宿主组织之间的细胞间相互作用。因此，最佳方案是重建黑色素瘤发生的三维环境，作为临床前筛选模型13,14。

<table><tbody><tr><td>胎牛血清白蛋白（FCS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>添加至细胞培养基中，终浓度为10%</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td>用PBS稀释至1倍浓度</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td>用于黑色素瘤细胞系的培养</td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965062</td><td>用于原代成纤维细胞的培养</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco life technologies&amp;nbsp;</td><td>17105041</td><td>2U/ml，溶于PBS中</td></tr><tr><td>I型胶原蛋白</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>通常来源于大鼠尾腱，浓度应为3.5–4 mg/ml</td></tr><tr><td>24孔Nunclon插件&amp;nbsp;</td><td>Nunc</td><td>140629</td><td>孔径8 &amp;micro;m；使用直立式插件，不可使用悬挂式插件！</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>黄色</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750060</td><td>溶于PBS中</td></tr><tr><td>Keralife角质形成细胞培养基</td><td>Cell Systems</td><td></td><td>不添加FCS或抗生素</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td>NB4标准级</td></tr><tr><td>青少年来源人角质形成细胞</td><td>Cell Systems</td><td>FC-0007</td><td>可替代自青少年包皮组织中自行制备的细胞</td></tr><tr><td>青少年来源人成纤维细胞</td><td>Cell Systems</td><td>FC-0001</td><td>可替代自青少年包皮组织中自行制备的细胞</td></tr><tr><td>DMEM&lt;br/&gt; [+] 4.5 g/l 葡萄糖,&lt;br/&gt; [+] L-谷氨酰胺,&lt;br/&gt; [-] L-丙酮酸</td><td>Gibco life technologies</td><td>41965</td><td>与Ham&amp;acute;s F-12按1:1混合配制MM培养基；&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 与Ham&amp;acute;s F-12按3:1混合配制EGM培养基</td></tr><tr><td>Ham&amp;acute;s F-12 [+] L-谷氨酰胺</td><td>Gibco life technologies</td><td>&amp;nbsp;21765-029</td><td>与DMEM混合用于配制EGM和MM培养基（见第15行）</td></tr><tr><td>EGF&amp;nbsp;</td><td>Gibco life technologies</td><td>&amp;nbsp;13247-051</td><td>仅在配制EGM培养基时添加，终浓度为10 ng/ml</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Merck Chemicals</td><td>2381</td><td>配制EGM培养基时添加1.9 mM，配制MM培养基时添加3.8 mM</td></tr><tr><td>亚硒酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>18851</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加53 nM</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Lilly</td><td>HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加5 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>E-0135</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加0.1 mM</td></tr><tr><td>磷酸乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0503</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加0.1 mM</td></tr><tr><td>全转铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T-0665</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加5 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6397</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加20 pM</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-088816</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加0.4 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8783</td><td>仅在配制EGM培养基时添加，终浓度为10 nM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3784</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加15 mM</td></tr><tr><td>丝氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4311</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加1 mM</td></tr><tr><td>氯化胆碱</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C-7017</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加0.64 mM</td></tr><tr><td>去脂胎牛血清（dFCS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-0392 Lot 086K0361</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加2%</td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A-9795</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加0.18 mM</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>PromoCell</td><td>C-42209</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加7.25 mM</td></tr><tr><td>氯化锶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>配制EGM和MM培养基时均添加1 mM</td></tr><tr><td>抗细胞角蛋白10抗体</td><td>Dako</td><td>M7002</td><td>1:50</td></tr><tr><td>抗细胞角蛋白14抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53253</td><td>1:200</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;抗层粘连蛋白5抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32794</td><td>1:50</td></tr><tr><td>抗丝聚蛋白抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-13440</td><td>1:50</td></tr><tr><td>抗兜甲蛋白抗体</td><td>Acris Antibodies</td><td>AM33368PU</td><td>1:50</td></tr><tr><td>二抗：多克隆山羊抗小鼠IgG-FITC标记</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-C153907</td><td>1:50</td></tr><tr><td>二抗：多克隆山羊抗小鼠IgG-Cy3标记</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-165-003</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

一种三维类器官黑色素瘤球体皮肤模型

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

黑色素细胞（人类皮肤的色素细胞）的恶性转化会导致黑色素瘤的形成，这是一种具有高度侵袭性和较强转移潜能的癌症。近年来，针对黑色素瘤的靶向激酶抑制剂联合化疗方案不断改进，单药化疗也在持续发展。然而，转移性黑色素瘤仍然是一种危及生命的疾病，因为肿瘤表现出对新型疗法的原发性耐药或在治疗过程中产生耐药性，从而重新获得致瘤能力。为了提高恶性黑色素瘤的治疗效果，有必要明确赋予肿瘤对常规治疗产生耐药性的分子机制；但这一研究需要创新的细胞模型 体外 模型。在此，我们介绍一种 体外 三维（3D）类器官黑色素瘤球状体模型，能够模拟 体内 恶性黑色素瘤的结构可能为肿瘤内部以及肿瘤与宿主相互作用提供新的见解。该模型在由原代皮肤细胞构成的三维全层人皮肤重建模型中，整合了数量明确的成熟且已分化的黑色素瘤类球体。嵌入的黑色素瘤类球体在细胞组成和分化状态上与皮肤黑色素瘤转移灶相似 体内利用该类器官黑色素瘤球体模型作为药物筛选平台，可能有助于识别出对特定联合疗法有响应的患者，同时避免无响应者承受不必要的治疗负担，从而提高治疗干预的效果。

黑色素瘤转移的成功治疗可能受到肿瘤细胞之间以及肿瘤细胞与未转化宿主细胞之间相互作用的影响。建立癌症类器官模型的目的在于 体外 旨在提供能够模拟人类黑色素瘤三维结构与复杂性的适宜临床前测试系统 体内 这使得能够在类器官环境中平行研究治疗对肿瘤的影响以及对周围正常组织的不良反应。
要开发最佳的类器官皮肤模型，原代细胞的质量至关重要。使用幼年来源的原代成纤维细胞和角质形成细胞具有优势，因为与成年个体的原代皮肤细胞相比，它们通常分化程度较低。幼年皮肤细胞可从幼年包皮组织中分离获得，具体方法如本方案第1至第5节所述；也可直接从商业公司购买产前来源的原代成纤维细胞和角质形成细胞。若选择购买细胞，必须从不同供体订购，以避免出现供体特异性的实验结果，例如药物敏感性差异。整个实验流程在图3中以示意图形式展示。
三维全层皮肤等效物的质量控制需要进行免疫组织化学分析。通过苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin, H&E）染色可获得初步观察结果。&amp;E）石蜡包埋切片染色（3 µm）。对表皮分化质量以及真皮与表皮之间基底膜形成情况的详细分析，需要使用针对表皮分层标志物的特异性抗体进行免疫组织化学分析。该方法可区分位于基底膜附近的未分化、高增殖活性细胞与位于表皮浅层的高度分化及角化细胞 角质层 通过表皮各层之间的特异性形成。免疫组织化学染色结果如图所示 (图4），可实现表皮全层角质形成细胞的分化，类似于正常皮肤：主要为表皮下层的未分化细胞（基底层 和 棘层）对角蛋白14染色呈阳性，而来自上基底层的更分化细胞（颗粒层 和 角质层）对角蛋白10和兜甲蛋白呈阳性染色。因此，丝聚蛋白染色仅可在高度分化的细胞中观察到 角质层最重要的是，层粘连蛋白5染色显示，在人工皮肤重建物中形成了将表皮层与真皮层生理连接的基底膜。这证明已构建出可相互通讯的类器官微环境，可用于黑色素瘤细胞或类球体的生理及病理生理学分析。
为进行黑色素瘤药物筛选，也可将单个黑色素瘤细胞整合至全层皮肤等效物的真皮层中，以允许 从头合成 黑色素瘤巢状形成18,19因此，将黑色素瘤细胞与原代成纤维细胞以5:1的比例混合，共同在200 × g离心5分钟，随后重悬于GNL中，再与胶原混合。结果，黑色素瘤细胞巢将在真皮区自发形成。根据我们的经验，只有处于转移性生长阶段的细胞才能形成良好的细胞巢，而处于RGP或VGP阶段的黑色素瘤细胞则不能15. 这类模型的一个主要缺点是，所形成的黑色素瘤细胞巢的数量和大小无法预测，且可能在不同的皮肤重建样本之间存在差异，这种差异与任何处理因素无关。例如，在真皮层隔室中接种1,000个细胞，可能形成10个由100个细胞组成的细胞巢，或形成100个由10个细胞组成的细胞巢（图5）。这些生物学变量存在三个缺陷：第一，形成的黑色素瘤巢的数量和大小无法预测；第二，转移 体内 通常比黑色素瘤巢更大，并表现出更复杂的瘤内多样性；第三，由于肿瘤巢模型的生命周期有限，治疗需尽早开始，因此实际上是抑制肿瘤的进一步生长，而非引起已有肿瘤巢的消退。
为克服这些局限性，可构建黑色素瘤类器官球体皮肤模型。通过将250个转移性黑色素瘤细胞在悬滴中培养14天20，可重复地生成由活黑色素瘤细胞组成的球状体，呈现致密结构，最终直径约为 500 µm 模拟无血管化的肿瘤结节、微转移灶或实体瘤的毛细血管间微区21,22一般来说，任何黑色素瘤细胞系均适用于通过悬滴法生成球状体；然而，相较于源自早期进展阶段的细胞系，源自更晚期转移性肿瘤阶段的细胞所形成的球状体更为致密。 例如，RGP。
对于某些细胞，提高悬滴培养基的黏度有利于形成结构良好的球状体。可通过向培养基中添加10 - 50%的甲基纤维素实现这一目的。配制甲基纤维素储备液时，将1.2 g甲基纤维素与磁力搅拌子一同放入100 mL玻璃瓶中，121°C高压灭菌。加入100 mL预热至60 °C的培养基，在室温下搅拌20 min，随后在4 °C继续搅拌1 - 2 h。将储备液在5,000 × g离心2 h，收集黏稠的上清液，4 °C保存备用。
通过以下事实可对完整的皮肤黑色素瘤类球体模型进行适当验证：在皮肤模型构建的第1天，可将确定数量的黑色素瘤类球体（至少在统计学意义上）整合入真皮成纤维细胞/Ⅰ型胶原支架中，使其在随后的25至27天表皮分化过程中共同发育。接种后可直接分析类球体的产量，因为类球体在透明的真皮凝胶中呈现为白色斑点，无需任何放大设备即可观察到图2）。结果生成了一个包含已培养的成熟黑色素瘤球体的3D皮肤模型 体外 共计约42天，显示出最高水平的瘤内细胞分化15.
皮肤黑色素瘤类球体模型的苏木精-伊红（H&amp;E）染色显示，其组织学形态和细胞分布与体内非血管化的人类皮肤黑色素瘤转移灶非常相似in vivo15（图6）。在此条件下可清晰区分出两类黑色素瘤细胞亚群：一类是位于外周的增殖性亚群，另一类是主要由皱缩、凋亡或坏死细胞组成的中央亚群，形成所谓的“坏死”中心。通过免疫组织化学方法，可利用抗增殖标志物KI-67的抗体检测存活且增殖的细胞亚群，而坏死中心的细胞则可通过TUNEL染色进行可视化15。这种特定的肿瘤细胞亚群分布由类球体的尺寸（≥500 µm）所决定，其成因是中心区域缺乏营养和氧气，并积累代谢废物。按照本方案操作，可构建一种可靠且可重复的、包含人源黑色素瘤类球体的全层人类皮肤类器官模型，以模拟人类皮肤黑色素瘤转移。该模型的应用包括药物测试、毒素筛选、化妆品成分或激光治疗对黑色素瘤生长的影响研究以及相关治疗评估。
<img alt="孔中细胞培养阶段；浸没式和气液界面方法；实验示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：三维类器官皮肤重建模型在培养基中浸没培养及气液界面培养。 在第0天，将原代角质形成细胞接种于真皮隔室顶部，该隔室由嵌入I型胶原基质中的原代成纤维细胞构成。三维皮肤重建模型在EGM培养基中浸没培养7天，随后从插入物壁脱离并开始收缩。在第8天，将插入物转移至6孔板中，并在气液界面进行培养，以促进表皮多层结构的形成。 <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="真皮隔室中的肿瘤类球体培养、显微镜观察、三维细胞生长研究装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：嵌入真皮隔室的黑色素瘤类球体呈现为白色斑点。 在制备三维皮肤重建模型的真皮隔室时，可将确定数量的黑色素瘤类球体加入成纤维细胞与I型胶原的混合物中。一旦真皮凝胶固化，黑色素瘤类球体即显现为白色斑点。
<img alt="皮肤细胞分离过程示意图；从活检到培养；儿童和成人皮肤样本。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：三维类器官皮肤模型构建示意图。 去除皮肤样本中的脂肪组织，并将其切成较小的组织块。在 4 °C 下用分散酶溶液孵育过夜，有助于表皮与真皮的分离。分离得到的原代成纤维细胞和角质形成细胞应分别培养，并分别在第 4–6 代和第 3–4 代之间使用。随后，可按照本实验方案中所述步骤进行三维皮肤模型的构建。<a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="全层皮肤替代物与人皮肤对比；苏木精-伊红染色、角蛋白、丝聚蛋白、层粘连蛋白染色；显微镜分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图 4三维类器官皮肤重建物显示出与正常人皮肤相似的分化水平。皮肤等效物的石蜡切片 (A）与正常人皮肤相比（B）用角蛋白14（红色：λex 554 nm；λem 568 nm）和10，兜甲蛋白（绿色：λex 490 nm；λem 525 nm），波形蛋白（绿色：λex 490 nm；λem 525 nm）和层粘连蛋白5（绿色：λex 490 nm；λem 525 nm），并使用共聚焦荧光显微镜进行分析。细胞核通过DAPI染色显示（蓝色：λex 340 nm；λem 488 nm）。对三维全层皮肤替代物的免疫组织化学检测显示，表皮具有正常的分层结构，形成类似于正常人皮肤的清晰表皮层。其中，表皮下层细胞表达角蛋白14呈阳性染色，而表皮上基底层中更为分化的细胞则显示角蛋白10和兜甲蛋白的阳性染色。接近表皮表面的高分化细胞也呈阳性染色。 角质层 表达的丝聚蛋白。层粘连蛋白5染色显示，基底膜形成，以生理方式将表皮区与真皮区连接（最下层面板）。该图源自Voersmann 等15 经许可。 <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>
<img alt="皮肤组织病理学显微图像，显示表皮和真皮层，细胞结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：自发形成的黑色素瘤细胞巢的数量和大小无法预测。通过将确定数量的黑色素瘤细胞与原代成纤维细胞混合，并共同包埋于I型胶原基质中，可在全层皮肤等效物的真皮区实现de novo黑色素瘤细胞巢的形成。自发形成的黑色素瘤细胞巢的数量和大小只能在约21天后、三维皮肤重建模型成熟时进行分析。如两个样本（A）和（B）所示，不同皮肤重建模型之间的黑色素瘤细胞巢数量和大小可能存在差异。因此，这类模型的验证较为困难，且难以预测其治疗效应。<a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="皮肤组织的组织学示意图，显示在100倍放大下毛囊横切面的放大视图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：整合至皮肤等效物中的黑色素瘤类球体可重现人类皮肤黑色素瘤转移的关键特征。 H&amp;E染色的肿瘤类球体石蜡切片在皮肤等效物中的结果显示，这些类球体与无血管化的人类皮肤黑色素瘤转移灶具有关键特征的相似性 在体内. 可明显区分出两个细胞亚群：外围的活细胞亚群，以及主要由皱缩的、凋亡或坏死的细胞组成的中央亚群，形成“坏死”核心。这种肿瘤细胞亚群的分布由类球体的大小所决定。该图已根据 Voersmann 的原图修改 等15 经许可。 <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

在此，我们介绍一种用于构建三维类器官黑色素瘤球体皮肤模型的方案，该模型可重现器官/肿瘤的结构特征和多细胞复杂性 体内 但同时允许进行系统的实验干预。

黑色素细胞（人类皮肤的色素细胞）发生恶性转化会导致黑色素瘤的形成，这是一种侵袭性极强的癌症，其发病率呈上升趋势……

该三维类器官黑色素瘤球体皮肤模型的总体目标是重现体内器官或肿瘤的结构特征和多细胞复杂性，同时允许进行系统性的实验干预。该方法有助于回答黑色素瘤研究领域中的关键问题，例如肿瘤与宿主的相互作用以及治疗干预效果。该技术的主要优势在于，我们能够模拟体内无血管转移灶的三维结构。该技术的意义延伸至黑色素瘤的治疗，因为它反映了肿瘤的异质性。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为原代细胞的质量至关重要，且在细胞处理过程中不使用抗生素。该技术的意义延伸至黑色素瘤的治疗，因为它反映了肿瘤的异质性。该方法的可视化演示至关重要，因为正确操作三维黑色素瘤皮肤模型非常关键。首先，根据常规细胞培养方案，使用含10%胎牛血清（FCS）的RPMI培养基培养黑色素瘤细胞451LU。为生成黑色素瘤球状体，用PBS洗涤培养的黑色素瘤细胞。然后加入5毫升1倍的胰蛋白酶EDTA磷酸盐缓冲液。在室温下孵育3至5分钟。加入5毫升含10%胎牛血清（FCS）的RPMI培养基以中和胰蛋白酶。然后将细胞悬液转移至离心管中。在200 × g条件下离心5分钟以收集细胞。用含有10% FCS的RPMI重悬细胞沉淀。接下来，对细胞进行计数，并将细胞悬液稀释至最终浓度为每毫升10,000个细胞。使用电子多通道移液器，在无菌非黏附性10厘米细胞培养皿盖内表面均匀点样40个25微升的细胞悬液小滴。随后，迅速而平稳地将皿盖翻转，盖在含有5毫升PBS的细胞培养皿上。将悬滴培养皿置于含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中培养10至14天。初次点样后第5天，使用电子移液器向每个液滴中加入10 µL含10%FCS的RPMI培养基。培养10至15天后，用PBS轻柔冲洗培养皿盖，收集球形细胞团。将球体收集至新的非黏附性细胞培养皿中。为构建皮肤重建模型的真皮部分，将孔径为8微米的膜插件放入24孔细胞培养板中。每个插件中，用中和凝胶溶液重悬100,000个成纤维细胞。接下来，将成纤维细胞悬液与I型胶原蛋白按1:3的比例迅速混合，总体积为500 µL，注意避免产生气泡。然后使用移液器将悬液加入每个插入物中。在无菌操作台内，将插入物置于室温下静置30分钟（不加培养基），使真皮凝胶充分沉降。 接下来，用DMEM覆盖凝胶，并在37摄氏度下孵育过夜。过夜孵育后，从真皮凝胶中移除DMEM，并在37摄氏度下用EGM再平衡2小时，以生成皮肤重建物的表皮部分。然后使用移液器从凝胶中移除EGM。然后将重悬于100微升EGM培养基中的100,000个角质形成细胞小心地接种到每块凝胶表面。将重建组织在37摄氏度下孵育一个半小时，使角质形成细胞黏附至真皮凝胶上。使用移液器吸头小心去除插入物壁上残留的凝胶。接下来，向每个重建组织中加入800 µL EGM培养基，在37°C、5% CO₂条件下培养7天。使用小而宽的移液器吸头小心去除内壁残留的凝胶。第8天，将插入物转移至6孔板的各个独立孔中。随后向每个孔中加入1.2至1.4 mL转移性黑色素瘤培养基，仅覆盖皮肤重建组织的底部。然后在37°C、5%二氧化碳条件下培养10至17天。每个孔仅加入1.2至1.4 mL转移性黑色素瘤培养基，使皮肤重建组织从孔底部获得培养基供应，但不被培养基完全覆盖。为了将黑色素瘤类球体整合到全层皮肤重建模型的真皮部分，使用 PBS 轻轻冲洗悬滴细胞培养皿的盖子，使类球体脱离。对于每个全层皮肤重建模型，在无菌的非黏附性细胞培养皿中收集 10 至 20 个类球体。使用巴斯德吸管小心去除多余的 PBS。接下来，用最小体积的 EGM 吸取类球体，然后将其转移至含有 100,000 个成纤维细胞的所需体积的凝胶中和溶液中。对于每个插入物，将类球体悬液与 I 型胶原按 1:3 的比例混合，终体积为 500 µL。最后，按照先前所述的方案生成类器官全层皮肤重建模型。通过将正常人皮肤与皮肤重建模型进行比较，以验证三维类器官皮肤重建模型的可靠性。石蜡切片的苏木精-伊红染色显示，皮肤重建模型的真皮层和表皮层与正常皮肤相似。对正常人皮肤和皮肤重建组织进行免疫组织化学分析，以比较表皮分化情况。针对表皮分层标志物——角蛋白14、角蛋白10、兜甲蛋白和丝聚蛋白的免疫染色显示，皮肤重建组织与正常皮肤之间的角蛋白分化水平相似。针对层粘连蛋白5的免疫染色表明，基底膜已形成，可生理连接皮肤重建组织中的表皮与真皮部分，类似于正常皮肤的结构。黑色素瘤类球体皮肤重建的石蜡切片经苏木精-伊红染色显示，黑色素瘤类球体的细胞分布与体内非血管化的人类黑色素瘤皮肤转移灶相似。组织学检查揭示了黑色素瘤细胞中存在周边增殖亚群和中央坏死亚群。一旦掌握该技术，若操作得当，约需40天即可完成。在进行该操作时，使用高质量的原代细胞至关重要。该技术建立后，为黑色素瘤研究者探索在模拟体内环境的体外条件下的反应性铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何构建人源三维类器官黑色素瘤皮肤模型。

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癌症研究

3D 脊髓黑色素瘤球形皮肤模型

在本报告中，我们描述了一种三维皮肤重建模型，该模型在结构和组成上模拟了人类皮肤。该皮肤重建模型已被用于研究黑素细胞的生理特性、黑色素瘤的进展以及真皮干细胞的命运。此外，该模型还可作为药物评估的临床前工具。...

三维人类皮肤重建模型：研究正常皮肤与黑色素瘤进展的工具

在本视频中，将来源于人类的黑色素瘤细胞皮下植入免疫缺陷小鼠的 flank 区域。PDX 模型可实现对黑色素瘤细胞的临床前研究，更好地重现 in vivo...

患者来源的异种移植模型构建：一种生成黑色素瘤小鼠模型的技术

本视频介绍了利用黑色素瘤细胞通过悬滴法生成三维球状体的技术。所生成的...

悬滴法：一种生成三维黑色素瘤球体的技术

本视频详细介绍了生成 体外 用于研究黑色素瘤进展的三维类器官皮肤重建模型。该皮肤模型可模拟器官的结构及多细胞复杂性 体内.

类器官全层皮肤重建的生成：利用人皮肤样本建立三维皮肤模型的操作流程

研究髓质胸腺上皮细胞 体外 在很大程度上并不成功，因为现有的二维培养系统无法模拟 体内 该3D培养系统——一种改良的皮肤类器官培养模型——在模拟胸腺上皮细胞（mTEC）的增殖、分化以及异位基因表达的维持方面表现出更优效果。...

支持髓质胸腺上皮细胞增殖、分化及异位基因表达的三维类器官共培养模型

侵袭周围正常组织是恶性肿瘤的一个显著特征。本文提供了一种简单且半自动化的微孔板检测方法，用于检测细胞对天然三维生物基质的侵袭能力，该方法已成功应用于多种人类晚期癌症模型。...

三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

我们介绍了两种互补的方法，利用荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）结合图像分析或流式细胞术，以鉴定并分离三维球状体中处于内层G1期阻滞和外层增殖区域的细胞。...

基于成像和流式细胞术的三维黑色素瘤球体中细胞位置与细胞周期的分析

与传统的基于塑料培养皿的组织培养检测方法相比，患者来源的异种移植（PDX）模型能更可靠地再现黑色素瘤的分子和生物学特征，并能更准确地预测治疗反应。本文介绍了我们建立新型 PDX 模型以及对已有 PDX...

一种黑色素瘤患者来源的异种移植模型

建立了一种基于肿瘤细胞与基质成纤维细胞异质相互作用的新型三维球体模型。本文介绍了肿瘤细胞与基质成纤维细胞的共培养、延时成像及共聚焦显微镜技术，用于可视化球体的形成过程。该三维模型为研究肿瘤-基质相互作用及筛选抗癌治疗药物提供了一个恰当的研究平台。...

一种新型的由基质成纤维细胞调控的三维肿瘤球模型，用于研究肿瘤-基质相互作用及药物发现

乳腺上皮细胞与内皮细胞之间的串扰在乳腺癌进展、肿瘤生长及转移中起着重要作用。本研究利用乳腺癌细胞与血管和/或淋巴管内皮细胞共同构建球状体，并验证其作为研究模型的适用性 体外...

乳腺上皮和内皮细胞球体作为乳腺癌研究潜在的功能性体外模型

在此，我们介绍一种通过培养新鲜黑色素瘤组织解离后的细胞悬液来生成黑色素瘤患者来源类器官的实验方案。这些类器官能够真实地再现患者特异性的肿瘤特征 体外 为研究肿瘤免疫抑制机制、药物筛选、耐药机制及癌症监测方法提供了创新途径。...

利用黑色素瘤患者来源类器官模型揭示治疗新机遇

学习构建三维器官型黑色素瘤球形皮肤模型，用于模拟体内肿瘤结构并研究肿瘤与宿主相互作用。该方法利用悬滴技术生成球体，结合成纤维细胞和角质形成细胞重建皮肤，为黑色素瘤治疗研究提供可靠的体外实验平台。

一种三维类器官黑色素瘤球体皮肤模型

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