Name: 利用体外大鼠脑切片研究变性主要事件的一种替代方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学习利用离体大鼠脑切片技术研究神经退行性病变早期分子事件的方法。该技术通过配对半脑切片实现对照与处理条件的直接比较，可检测tau蛋白磷酸化及淀粉样蛋白β水平变化，为理解神经退行性疾病机制提供重要实验手段。

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本工作由 Neuro-Bio Ltd. 资助。我们感谢 Neuro-Bio 的 Giovanni Ferrati 博士和 Sergio Rotondo 博士对本文稿提出的评论与建议。

所有动物实验均在获得批准的方案下进行。
注意：本节提供了实验过程中主要步骤的执行顺序及建议的时间间隔（图1）。此外，实验方案的逐步说明配有示意图面板，展示了从脑组织取出到孵育结束后组织匀浆过程中的关键操作步骤（图2）。有关材料清单、装置搭建方法以及后续进行WB分析步骤的详细信息，此前已有描述22。
1. 手术工具、振动切片机设置&#160;和处理准备
注意：在开始实验步骤之前，请执行以下操作：
<ol>
	<li>配制两种不同的人工脑脊液（aCSF），一种用于脑切片，另一种用于孵育步骤，具体方法如前所述29。简而言之，工作浓度&#160;（单位：mmol）&#160;两种aCSF中的前者用于 &#34;切片&#34; aCSF：120 NaCl，5 KCl，20 NaHCO₃3，2.4 CaCl2，2 MgSO₄4，1.2 KH2PO4，以及10葡萄糖；6.7 HEPES盐和3.3 HEPES酸；pH：7.1。而对于 &#34;记录&#34; aCSF：124 NaCl，3.7 KCl，26 NaHCO₃3，2 CaCl2，1.3 MgSO₄4，1.3 KH2PO4，以及10葡萄糖；pH：7.1。</li>
	<li>充分混匀溶液&#160;然后放入&#160;将切片用 aCSF 冷却并充氧，以确保在取出脑组织及后续切片过程中保持低温。记录用 aCSF 保持室温（RT），并持续供氧。</li>
	<li>将器械置于解剖罩下，用于断头和脑组织取出。 即，剪刀，外科解剖器械套装（剪刀、镊子、刀片）和刮勺。</li>
	<li>设置振动切片机参数，选择切片厚度（本实验为300 µm）、频率为7、速度为6。将振动切片机的切片腔置于相应位置，并在其周围放置冰块。</li>
	<li>打开碳酰气（95% O₂，5% CO₂）气源2, 5% CO₂2）阀门以供氧 &#34;切片&#34; 在脑组织切片过程中使用人工脑脊液（aCSF），选择最低流速，约为2 mL/min。</li>
	<li>取两支15 mL离心管用于准备待测条件。在其中一支试管中加入10 mL的 &#34;记录&#34; 仅 aCSF（对照组）以及另一组中 10 mL 的 &#34;记录&#34; 含 2 µM T30 的 aCSF（处理组）。将两支试管涡旋混匀后置于冰上，待后续用于实验装置准备阶段（第 3 节）。</li>
</ol>
2. 麻醉、脑组织提取&#160;和切片
注意：本研究使用了9只野生型P14雄性Wistar大鼠。脑组织的提取及其后续切片是该实验方案的关键步骤，必须在10分钟内快速完成，以防止或至少减缓组织退化过程。
<ol>
	<li>在诱导室内的棉层上加入1.5 mL 100% w/w异氟烷，将动物放入其中并盖上盖子。等待动物深度麻醉，确认足底反射消失后，使用断头器将动物断头。</li>
	<li>在取出脑组织的过程中，将动物头部置于盛有冰冻切片用aCSF的容器中（图2A - C）。</li>
	<li>使用手术刀切开颅骨表面的皮肤，然后沿中线用剪刀从后部开始向前剪开颅骨，直至到达嗅球（OBs）上方的骨骼（图2A）。</li>
	<li>用一对镊子将颅骨两侧向外拉开，以暴露脑组织（图2B）。将刮勺插入脑腹侧，轻柔地将脑组织取出，并将其保持在冰冻的&#34;slicing&#34; aCSF中约5分钟以保持湿润（图2C）。</li>
	<li>将脑组织置于滤纸上，用刀片切除小脑（图2D）。将脑组织垂直粘附于振动切片机的切片盘上，放入切片室中，加入冰冻的&#34;slicing&#34; aCSF，并通入氧气（图2E）。</li>
	<li>调整切片间隔，开始进行脑组织切片（图2F）。收集包含目标区域的切片，如内侧隔核（MS）、Broca斜角带（DBB）和无名质（SI），具体方法如前所述22。从上到下，这三片切片分别包含基底前脑（BF）的头侧（R）、中间（I）和尾侧（C）部分（图2G）。</li>
	<li>使用小剪刀沿中线将每一片切片分为两半，得到两个对称的半切片（图2H），在同一解剖平面上分别用于对照组和处理组。</li>
	<li>将半切片保留在振动切片机室中5 - 10分钟，然后用玻璃移液管将其转移至盛有灌流记录用aCSF的鼓泡容器中，在室温（RT）下静置约30分钟以恢复。</li>
	<li>在此期间，准备三个玻璃瓶，每瓶加入3 mL仅含记录用aCSF的溶液（按步骤1.6预先配制），用于对照组；另准备三个玻璃瓶，每瓶加入3 mL富含T30的aCSF溶液（按步骤1.6预先配制），用于处理组。</li>
</ol>
3. 实验准备
<ol>
	<li>将半切样本转移至对应的玻璃小瓶中（图 2I以获得三段连续的半切片（包括前部、中部和后部基底前脑区域）作为对照组（绿色框， 图 2J）以及处理组对应的匹配样本（红色框， 图2J).</li>
	<li>转移&#160;使用两把不同的刷子分别处理对照半脑切片和处理组半脑切片，以避免不同条件之间的任何污染。</li>
	<li>用相应的盖子密封每个玻璃小瓶，并插入供氧针头（21G）图 2J）。将装置的主管连接至碳氧混合气源（图 2K）。在整个孵育期间以不低于2 mL/min的最低流速向脑片灌注氧气，以避免脑组织移动及实验过程中可能发生的机械损伤。开始5小时的孵育，并在5分钟内完成步骤3.1至3.3。 
	注意：需频繁检查（每15–20分钟）所有小瓶是否均有氧气供应，并确认氧气流速不会将组织从瓶底吹起。</li>
</ol>
4. 样品匀浆
<ol>
	<li>孵育结束后停止供氧，取下所有小瓶的盖子。使用适当的毛刷将半脑切片转移至含有250 µL裂解缓冲液的1.5 mL离心管中，并将离心管保持在冰上（图2L）。配制裂解缓冲液时，将1× PBS与磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂混合液按1:100稀释后混合，并使用不同的研磨杵匀浆组织，以防止样品间交叉污染&#160;。整个操作过程应在10至15分钟内完成&#160;。</li>
	<li>将脑组织裂解液在4 °C条件下以1,000 × g离心5分钟。将上清液转移至新的离心管中，并将样品保存于-80 °C。</li>
</ol>
5. 蛋白质浓度测定与蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>测定每个样品的蛋白浓度，随后按照先前所述方法准备用于 Western blot 分析的等分试样22。</li>
	<li>进行统计分析，以评估处理对蛋白表达的影响。</li>
</ol>

<ol><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
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<li>Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ex+Vivo+Model+to+Investigate+the+Underlying+Mechanisms+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291(2017).</li>
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</ol>

作者声明存在竞争性财务利益。Susan A. Greenfield 是私营公司 Neuro-Bio Limited 的创始人兼总裁，并持有该公司股份。Emanuele Brai 和 Antonella Cogoni 是 Neuro-Bio Ltd 的员工。

本方案的主要特点在于&#160;成熟的 离体 脑部技术，可实现同步检测&#160;来自同一解剖平面的两个对称半切片，在特定条件（对照或处理）施加后监测其反应；因此提供了尽可能严格控制的实验范式。能够在时间、剂量和作用位点特异的情况下，评估与神经元损伤相关的多种神经化学物质，如在神经退行性事件中所见22，代表了一个关键特征。该方法结合了以下优势： 体内 生理环境与那些 体外 制备过程，例如精确获取目标区域并构建理想的细胞外环境。本方案是对广泛用于脑切片的常规操作步骤的改进。 离体 电生理记录25,26,27 和光学成像28,29,30，或 体外...

AD 是一种慢性病理过程，其特征是逐渐发生的神经退行性损害，可影响大脑多个区域，如内嗅皮层（EC）、基底前脑（BF）、海马（HC）和嗅球（OB）。1,2,3,4,5阿尔茨海默病（AD）发展的晚期阶段导致进行性认知功能下降，使该疾病成为最常见类型的痴呆，约占所有病例的70%6尽管人们已广泛尝试理解导致阿尔茨海默病（AD）的初始阶段，但目前尚无明确的实验证据阐明这些阶段。此外，最流行的理论——淀粉样蛋白假说 &#34;淀粉样蛋白假说&#34; - 由于其在解释阿尔茨海默病的病理生物学机制方面无法提供完整的图景，也未能提供已被证实有效的药物治疗靶点，正日益受到质疑7,8,9.
另一种日益受到关注的理论认为，神经退行性疾病早期发生的机制与主要在阿尔茨海默病（AD）中易感的神经元集群有关3,10,11,12,13,14。这一位于基底前脑（BF）、中脑和脑干内的异质性细胞枢纽，向多个脑区投射，例如内嗅皮层（EC）、海马（HC）和嗅球（OB）15,16。尽管这些神经元在形态和神经递质合成方面具有多样性，但它们共同表达乙酰胆碱酯酶（AChE），而AChE也可能具有非酶功能17,18。作为新型信号分子的这一非经典作用，可介导&#160;钙离子（Ca2+）流入神经元，进而根据Ca2+的剂量、可利用性及神经元年龄，引发营养性或毒性事件17,18,19。
在神经退行过程中，所观察到的细胞丢失可能因此与这种非酶学功能相关17,18,20，该功能归因于从乙酰胆碱酯酶（AChE）C末端切割产生的30个氨基酸肽段（T30）20。与先前在细胞培养和光学成像18,21实验体系中获得的结果一致，我们通过一种基于包含基底前脑（BF）结构的大鼠脑片离体（ex vivo）的新方法证明，&#160;T30可诱导&#160;类似阿尔茨海默病（AD）的表型22。具体而言，该新方法相较于细胞培养提供了更接近生理状态的实验环境，因其在数小时的时间窗口内保留了组织的多种特性，包括解剖结构和神经环路的完整性。我们应用此方案探究神经退行早期阶段发生的事件，监测T30施加后的急性反应。
尽管已有大量文献报道利用脑切片研究与神经元损伤或神经发生相关的分子通路23,24，但本方案首次提供了一种比常用的器官型脑切片更为直接且灵敏的检测方法。然而，与器官型脑切片类似，这种急性脑切片技术也可用于多种用途，例如评估神经保护性或神经毒性分子、发现特定过程中发生的原发性分子变化、免疫组织化学分析，以及针对中枢神经系统相关疾病的药理学检测。

<table><tbody><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S7653</td><td>aCSF 配制用试剂</td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P9333</td><td>aCSF 配制用试剂</td></tr><tr><td>碳酸氢钠 (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S5761</td><td>aCSF 配制用试剂</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁 (MgSO4 (7H2O))</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>63138</td><td>aCSF 配制用试剂</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾 (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P5655</td><td>aCSF 配制用试剂</td></tr><tr><td>Hepes 盐</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>H7006</td><td>aCSF 配制用试剂</td></tr><tr><td>Hepes 酸</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>H3375</td><td>aCSF 配制用试剂</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>G7528</td><td>aCSF 配制用试剂</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>223506</td><td>aCSF 配制用试剂</td></tr><tr><td>T30 肽</td><td>Genosphere Biotechnologies, France</td><td></td><td>测试的 AChE 来源肽</td></tr><tr><td>手术解剖工具包</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>货号: MOUSEKIT</td><td>脑组织取出步骤</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Swann-Morton, UK</td><td>BS 2982</td><td>脑组织取出步骤</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>11566873</td><td>脑组织切片前处理</td></tr><tr><td>胶水</td><td></td><td></td><td>脑组织切片前处理</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica, Germany</td><td>VT1000 S</td><td>切片</td></tr><tr><td>毛刷</td><td></td><td></td><td>组织操作</td></tr><tr><td>氧气罐</td><td></td><td></td><td>切片及孵育阶段</td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>BP2438-4</td><td>匀浆步骤</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1284-1650</td><td>匀浆步骤</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Roche complete PIC, USA</td><td>4693116001</td><td>匀浆步骤</td></tr><tr><td>研磨杵</td><td>Starlab, UK</td><td>I1415-5390</td><td>匀浆步骤</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm 蛋白质定量试剂盒</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>22660</td><td>蛋白质浓度测定</td></tr></tbody></table>

使用替代方法研究神经退行性变早期事件 离体 大鼠脑切片

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

尽管&#160;大量试图建立可靠动物模型的研究&#160;这反映了神经退行性变背后的主要过程，但其中被广泛接受的却寥寥无几。在此，我们提出&#160;一种新方法&#160;改编自著名的 离体 脑片技术，可提供更接近 体内-样情景而非 体外 用于研究阿尔茨海默病（AD）中观察到的触发细胞变性的早期事件。该方法包含简单且易于重复的操作步骤，能够在一个生理环境中保持所选脑区的解剖细胞结构及其局部功能。可从同一脑组织中获取不同解剖区域，从而能够在特定部位、剂量和时间依赖的条件下，对相关处理措施开展多项实验。潜在局限性&#160;这可能影响与该方法相关的实验结果，与组织的保存状况有关。 即， 切片和孵育步骤中其解剖完整性的维持情况以及切片厚度，均可能影响生化和免疫组织化学分析结果。该方法可应用于多种目的，例如探究生理或病理条件下涉及的分子机制、药物筛选或剂量-反应实验。最后，本方案还可减少行为学研究中所使用的动物数量。此处报道的应用方法最近才首次在 离体 包含基底前脑（BF）的大鼠脑切片，基底前脑是阿尔茨海默病（AD）主要受累的脑区之一。已有研究表明，给予源自乙酰胆碱酯酶（AChE）C末端的毒性肽可诱导出类似AD的表型，并沿BF的前后轴引发AD相关蛋白的差异表达，这些蛋白包括α7烟碱型受体（α7-nAChR）、磷酸化Tau蛋白（p-Tau）和淀粉样蛋白β（Aβ）。

本文所示方案表明，毒性多肽 T30 的施用以位点依赖的方式调节含基底前脑（BF）切片中 α7-nAChR、p-Tau 和 Aβ 的表达（图 3A）。与对照侧相比，尼古丁受体在 rostral 处理的半切片中显著增加（切片 1，p = 0.0310）（图 3B），而中间切片在两种条件下未显示任何变化（切片 2，p = 0.1195）（图 3B）。在后部区域，T30 暴露部分相较于其对照侧出现显著降低（切片 3，p = 0.0476）（图 3B）。施用 T30 后，p-Tau 水平在前部区域显著高于对照对应侧（切片 1，p = 0.0158）（图 3C）。另一方面，其余两个含 BF 的切片在两种条件下均未显示显...

我们提出一种方法，该方法能够&#160;为神经退行性变早期事件提供进一步见解，并基于已建立的 离体 脑技术，结合了以下优势 体内 和 体外 实验。此外，它还提供了在同一解剖平面上直接比较处理组与未处理组的独特机会。

尽管已有大量研究致力于开发能够反映神经退行性变主要过程的可靠动物模型，……

本实验的总体目标是同时研究来自同一解剖平面的两片对称半切脑片，并监测处理后的效应。该方法有助于回答分子神经科学领域中的关键问题，例如影响神经退行性过程相关关键分子的初始事件。该技术的主要优势在于能够提供并介导神经退行性事件背后分子级联反应的研究平台。尽管该方法可用于研究神经退行性疾病中的初级事件，也可应用于探究不同疾病的动物模型或其他器官和组织的特性。首先准备两种不同的人工脑脊液，一种用于脑切片，另一种用于孵育步骤。配制切片用ACSF后，混匀溶液并置于冰上。同样地，配制记录用ACSF，但将其保持在室温。对两种溶液均进行氧合处理。接下来，在解剖罩内准备好用于断头和取出脑组织的器械。然后设置振动切片机的参数，根据需要设定切片厚度。例如300微米。将频率设为7，速度设为6。然后插入振动切片机样品室，并用冰包围。进行脑切片时，打开碳酰气阀门以氧合切片用的ACSF。选择约每分钟两毫升的最低流速。现在取两个15毫升离心管，准备tus条件。取一支试管加入10毫升记录用ACSF作为对照。另一支试管加入10毫升含有处理药物的记录用ACSF，本实验中为含2微摩尔T30的溶液。将两根试管涡旋混匀，并置于冰上直至使用。用手术刀在颅骨表面的皮肤上做切口。然后使用剪刀从嗅球上方的骨骼开始，沿中线向后剪开颅骨。然后，用镊子向两侧横向拉开颅骨以暴露脑组织。将解剖刀从脑腹侧插入，轻轻将脑组织取出，并将其置于冰冻的切片用人工脑脊液（ACSF）中保持湿润，约5分钟。在冰冷的ACSF中静置后，将脑组织转移至滤纸上。去除小脑后，将脑组织垂直黏附于振动切片机的切片盘上。然后将其转移至装有冰冻切片ACSF的切片室中。现在开始向灌流 chamber 的溶液中通入氧气。然后调整切片间隔，继续进行脑组织切片。使用常规方法收集包含目标区域的切片。现在用小剪刀沿中线小心地将每个组织块纵向剖分为两个对称的半切片。每对半切片分别用于对照和处理条件。剖分后，将半切片在振动切片机槽中静置 5 至 10 分钟。休息后，用玻璃移液管将半脑切片轻轻转移至含有室温记录用ACSF的充气容器中。然后让半脑切片恢复约30分钟，再进行后续操作。在休息期间，为对照组准备三个玻璃小瓶，每瓶加入3 mL记录用ACSF；另为处理组准备三个玻璃小瓶，每瓶加入3 mL含有T30的ACSF。30分钟静置后，须在五分钟内将样品转移至水浴装置中。首先使用毛刷将连续的半脑切片加入对照溶液，随后换用另一把毛刷，将对侧半脑切片转移至处理溶液中。接下来，使用带有21号针头的塑料密封塞封闭样品瓶，以便向样品输送碳氧混合气体。以最低流速（例如每分钟2毫升）输送氧气，以防止脑组织移动，从而避免对组织造成可能的机械损伤。至此，装置设置完成。现在开始进行5小时的孵育。孵育结束后，停止供氧并打开小瓶盖。然后用适当的刷子将半片组织轻轻转移至含有250 µL冰上预冷裂解缓冲液的

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

利用体外大鼠脑切片研究变性主要事件的一种替代方法

来自胚胎啮齿类动物大脑的器官型脑片培养被广泛用于研究大脑发育。尽管在体系统常常具有一些优势，……...

E18 大鼠脑组织器官型切片培养

本文概述了制备大鼠和转基因小鼠海马脑片的实验步骤，用于研究与脑衰老及年龄相关性神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）相关的突触改变。...

用于研究衰老和淀粉样蛋白病变期间突触改变的大鼠和转基因小鼠急性海马脑片制备

本报告展示了一种机械分离单个有活性神经元的技术，该神经元保留了附着的突触前末梢。经振动解离获得的神经元具有制备快速、药理学控制优良以及在无邻近细胞干扰的情况下改善空间钳制的优点。该方法可用于突触结构的成像及膜片钳记录。...

从啮齿类动物脑片中振动解离神经元以研究突触传递和成像突触前终末

本视频展示了评估鼻周皮层-海马体器官型脑片中神经元死亡的技术。神经元死亡发生 通过 进展性癫痫发作——类似 体内...

用于评估离体癫痫模型中细胞死亡的神经元死亡检测法

本视频演示了制备大鼠脑半切片并用神经毒性肽处理以模拟神经退行性变的过程。该方案可通过在同一解剖平面上直接比较对照组和处理组切片，来分析神经退行性变事件。...

大鼠冠状脑片的神经毒性肽处理

神经元膜运输动态调控质膜蛋白的可用性，并显著影响神经传递。 迄今为止，在成年神经元中测量内吞运输仍具挑战性。 本文中，我们描述了一种高效且定量的方法，可在急性脑切片中体外（ex...

脑片生物素化：一种 离体 成年神经元中区域特异性血浆膜蛋白运输的测量方法

我们建立了一种脑切片模型，可用于研究兴奋性毒性介导的脑损伤所涉及的分子机制。 该技术可获得具有活性的成熟脑组织，在部分保留神经元回路、细胞间相互作用及突触后区室的同时，减少了实验所需的动物数量。...

脑微切片的兴奋性毒性刺激作为一种方法 体外 卒中模型

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使用优化方法制备急性脑切片 N甲基-D-葡糖胺保护回收法

本方案描述了从小鼠中制备表现出自发尖波涟漪活动的水平海马-内嗅皮层（HEC）切片的方法。切片在简化的界面式孵育室中孵育，并在浸没条件下用快速流动的人工脑脊液进行记录，以促进组织供氧及网络水平自发活动的出现。...

急性小鼠脑切片以研究海马区自发性网络活动

本方案展示了一种简单且可靠的用于研究的方法 原位 轴突生长与生长锥动态。该方法描述了如何制备 离体...

在体 可视化急性离体胚胎脑切片培养中轴突生长与生长锥动态

学习利用离体大鼠脑切片技术研究神经退行性病变早期分子事件的方法。该技术通过配对半脑切片实现对照与处理条件的直接比较，可检测tau蛋白磷酸化及淀粉样蛋白β水平变化，为理解神经退行性疾病机制提供重要实验手段。

使用替代方法研究神经退行性变早期事件离体大鼠脑切片

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