成体细胞外囊泡的分离与表征 日本血吸虫

本实验的总体目标是从体外培养的成年日本血吸虫培养基中分离出细胞外囊泡。该方法可高效地从体外培养的成年日本血吸虫培养基中分离细胞外囊泡（EV）。该技术的主要优势在于能够高效地从短期体外培养基中分离细胞外囊泡，从而最大限度地减少因应激导致的非生理性EV分泌。

演示将由我实验室的技术员 Juntao Liu 进行。将寄生虫收集到一个 500 毫升的烧杯中，用 200 毫升温热的 PBS 轻柔且彻底地洗涤三次。每次洗涤时间应短暂，并利用重力沉降法分离寄生虫。

接下来，将约200对线虫接种到90毫米的培养皿中。在培养皿中，使用重力沉降法再洗涤寄生虫两次。洗涤时使用添加了青霉素-链霉素的温热RPMI培养基。

用不含抗生素的40毫升培养基替换第二次洗涤液。然后，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养寄生虫2小时。2小时后，将培养基从培养板转移至离心管中，随后在4摄氏度、2,000 g条件下离心30分钟，收集虫卵和虫体碎片。

然后，收集上清液并转移至新的离心管中。接着，使用孔径为0.22微米的注射器滤器过滤上清液，并将滤过的溶液收集到截留分子量为3.5千道尔顿的透析袋中。随后，将溶液在4°C条件下用8% PEG8000溶液透析过夜。

此步骤对于提高细胞外囊泡的产量至关重要。第二天，将透析后的溶液转移至新管中，并加入总体积0.5倍的外泌体总提取试剂。混匀溶液至均一状态，并在约5 °C条件下孵育过夜。

次日早晨，在约5°C条件下，以15,000 g离心混合物一小时。随后吸出并弃去上清液，将EV沉淀重悬于2毫升PBS中。沉淀可能不可见。

进行蛋白质印迹分析时，首先测定样品的蛋白浓度，例如使用BCA法。然后，在22.5微升RIPA裂解缓冲液中加入10至20微克的EVs。接着，加入7.5微升4倍上样缓冲液，并在95摄氏度下加热混合物5分钟。

热处理后，在12% SDS-PAGE凝胶上分离细胞外囊泡蛋白。电泳完成后，将蛋白转印至PVDF膜上。用抗CD63抗体以1:1,000的稀释比例孵育膜。

然后，以1:5,000的稀释比例用抗兔IgG-HRP处理膜。接着使用ECL检测试剂显影膜，并在化学发光成像系统上进行分析。首先将五微克样品转移至聚丙烯超速离心管中，并用RPMI-1640培养基调整体积至12毫升。

然后，在 4 摄氏度下以 110,000 g 离心样品 90 分钟。离心后，小心吸出并弃去上清液。接着，通过向沉淀中加入 1 毫升稀释液 C，制备 2X 细胞外囊泡悬液。

通过轻柔吹打重悬沉淀。现在，配制新鲜的2倍染色液：在微量离心管中，将2微升PKH67乙醇染料加入1毫升稀释液C中，充分混匀。

然后，通过混合两种溶液并在室温下孵育四分钟对样品进行染色。接着，加入 4 毫升胎牛血清（FBS）终止染色，并静置一分钟。然后，加入 RPMI-1640 培养基将体积调至 12 毫升，离心悬浮液以分离染色的囊泡。

弃去上清液并丢弃。然后，将沉淀的PKH67标记的EVs重悬于12毫升RPMI-1640培养基中。随后，再次进行离心，但此次将囊泡收集于1毫升PBS中。

进行摄取实验时，在六孔板中培养哺乳动物细胞过夜。次日早晨，向每孔加入5微克PKH67标记的囊泡，并继续培养2至4小时。孵育结束后，移除培养基，用PBS洗涤细胞两次。

然后，固定细胞15分钟，用PBS洗涤两次，成像前用DAPI染色。感染后28天从兔子体内收集肝阶段的血吸虫。随后从血吸虫虫体中收集细胞外囊泡并进行分析。

通过马尔文纳米颗粒分析测定，其粒径范围在100至400纳米之间，大部分颗粒集中在约220纳米。透射电子显微镜显示，细胞外囊泡呈圆形，直径在100至200纳米之间。Western印迹分析表明，所分离的细胞外囊泡可被CD63抗体识别，CD63是典型的细胞外囊泡标志物。

PKH67标记的细胞外囊泡被NCTC克隆1469细胞摄取后的荧光显微镜观察显示，这些细胞外囊泡主要分布在受体细胞的细胞质中。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从成年日本血吸虫体外培养液中分离细胞外囊泡（EV）。