使用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在 C. elegans 中快速简便地生成基因组点突变的流程

本实验的总体目标是利用单链寡核苷酸同源定向修复模板和CRISPR/Cas9核糖核蛋白，在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中产生基因组点突变。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如确定与神经退行性疾病相关的遗传变异所导致的病理后果。该技术的主要优势在于能够快速生成基因组点突变，从而可在内源性调控环境下对遗传变异进行功能研究，同时避免了蛋白质过表达所带来的局限性。

进行 sgRNA 靶点选择时，打开此处所示的网页。输入约 60 个碱基对的序列，该序列应包含目标编辑位点两侧的侧翼区域。根据文本方案选择 C.Elegans 基因组和原间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif）后，点击提交。

在结果页面中，选择与目标编辑位点最接近且排名最高的靶序列。收到后，将含有冻干 sgRNA 的管子在室温下以至少 12,000 g 离心一分钟。向管中加入 60 微升无核酸酶的 TE 缓冲液，并使用 p200 移液器轻轻吹打 15 至 20 次，使 sgRNA 充分重悬。

最终浓度为 50 微摩尔。设计一条包含目的突变、一个独特的同框限制性内切酶位点、NGG PAM 序列中一个或两个 G 的同义突变，以及位于首尾突变位点两侧、长度为 50 个碱基对的 5' 和 3' 同源臂的单链寡核苷酸（ssODN）HDR 模板。收到后，将装有冻干 ssODN 的离心管按前述方法离心，然后使用无核酸酶的双蒸水（DD H2O）轻轻重悬 ssODN，使其最终浓度为 100 微摩尔。

配制注射混合液时，将此处所示试剂在4摄氏度、最大转速下离心两分钟。按照所列顺序，将试剂加入无核酸酶的PCR管中，然后使用P20移液器轻轻且充分混匀管内成分。

将离心管在室温下孵育十分钟。按照文本方案注射P0代线虫后，将其转移至接种了OP50的大肠杆菌、直径为35毫米的NGM平板上，在室温下恢复培养1至2小时。随后，使用铂金丝线虫挑取工具，将单个注射过的P0代线虫分别转移至各自接种了OP50的大肠杆菌、直径为35毫米的NGM平板上。

注射后两天，使用荧光显微镜鉴定含有在咽部表达 mCherry 的 F1 后代的 P0 平板。选择三个含有最多 mCherry 阳性 F1 个体的 P0 平板。从每个选定的 P0 平板中，使用线虫挑取工具分别挑取 8 至 12 只 mCherry 阳性的 F1 个体，共计 24 至 36 只 mCherry 阳性的 F1 个体。

让单个F1代线虫在室温下自体受精并产卵一至两天。产卵一至两天后，使用线虫挑取工具将F1代线虫转移至含有7 µL线虫裂解缓冲液的单个PCR条状管盖中。将PCR管在最大转速下于室温离心一分钟，使线虫沉降至管底。

然后将离心管置于负80摄氏度下冷冻一小时。接着使用下列程序在热循环仪中裂解冻存的线虫。然后按照本表所示配制PCR主混合液。

向干净的 PCR 管中加入 21 微升 PCR 预混液，然后加入 4 微升线虫裂解液，通过移液充分混匀。随后按照制造商的指南运行 PCR 程序。使用 DNA 纯化浓缩试剂盒，根据制造商的说明纯化 PCR 反应产物。

然后向离心柱中加入10微升水，稀释DNA。配制限制性内切酶预混液后，取10微升加入每个纯化的PCR反应体系中，于37摄氏度孵育1至2小时。随后，使用1×TAE缓冲液在120伏电压下，将消化后的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。

通过观察酶消化样品中是否存在指示潜在编辑动物的条带，来检测样品。在鉴定出潜在编辑动物后，取剩余的三微升虫体裂解液，重复PCR反应。随后立即将完成的反应产物上样至1%琼脂糖凝胶，经电泳分离后，使用凝胶回收试剂盒提取目标条带。

使用F1引物进行Sanger测序，以鉴定正确编辑的个体。最后，为了从经验证的杂合编辑个体中获得纯合个体，挑选单个F2代（8至12只），并根据文本方案进行基因分型和序列验证。为展示基于CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）方法的简便性、可行性和高效性，本研究靶向秀丽隐杆线虫（C. elegans）的sod-1基因，将与人类疾病相关的G93A突变引入线虫基因组中。

该凝胶图像显示了24只mCherry阳性F1动物的基因分型结果。其中10只含有单等位或双等位修饰，10只为野生型，3只为潜在的插入缺失突变（indels），1只为PCR失败样本。为了证明荧光mCherry标记可富集基因组修饰，从三个P0培养板中分别挑选了八只mCherry阴性动物进行分析。

仅有一只动物被正确修饰，其余23只为野生型。该图显示了从全长凝胶中提取的PCR产物的色谱图，证明ssODN HDR模板中设计的精确核苷酸变化已成功且忠实地整合到该纯合F1代动物的基因组中。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四到五天内用于在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中生成并鉴定基因组点突变。

在进行该实验操作时，重要的是要始终使用无细胞核污染的试剂和技术，包括无RNase的水、带滤芯的移液器吸头以及手套。完成本实验步骤后，可进一步开展细胞学、分子生物学及行为学检测，以研究可能与目标突变相关的表型特征。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用嵌合单导向RNA和CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物，在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中精确地产生基因组点突变。