哺乳动物基因翻译起始复合体形成的 Toeprinting 分析

这种脚趾印分析的总体目标是观察哺乳动物 mRNA 上的翻译起始复合物形成。这种方法可以帮助回答 mRNA 翻译领域的关键问题，例如 IRES 介导的翻译起始。该技术的主要优点是可以对特定 mRNA 上的翻译起始复合物形成进行详细分析。

组装转录反应以从 PCR 扩增的 DNA 模板转录 RNA，编码 XIAP IRES RNA 或其突变体。接下来，添加两个单位的不含 RNase 的 DNase，以去除每 20 μL 反应 RNA 中的 DNA 模板。在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

然后，用不含核酸酶的水稀释 DNase 处理的 RNA，最终体积为 110 μL。接下来，加入 110 μL 酸性苯酚开始 RNA 纯化。涡旋样品 5 秒钟，并在室温下以 20， 000 x g 的离心速度离心 3 分钟。

在苯酚提取之前稀释 RNA 或 CDNA 至关重要。如果体积太低，将难以物理回收水相，并且最终产率会很低。然后，小心地将 100 μL 含 RNA 的水相转移到新的微量离心管中。

加入 10 微升 3 M 乙酸钠，pH 值为 5.5，混合样品。然后，加入 3 倍体积的 100% 乙醇以沉淀 RNA，并将样品涡旋 5 秒钟。在 20 摄氏度下孵育过夜。

第二天，将样品在 4 摄氏度下以 20， 000 x g 离心 30 分钟，然后弃去上清液。然后，用 500 微升冰冷的 70% 乙醇洗涤沉淀并重复离心。小心吸出尽可能多的上清液，不要使沉淀物脱落。

然后，将沉淀风干 5 到 10 分钟。将沉淀重悬于无核酸酶的水中，至终浓度为 0.5 μg/μL。要开始脚趾印测定，向每个 1.5 毫升微量离心管中加入 15 微升未经核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物，其代表野生型 XIAP IRES RNA 及其突变体。

向每个试管中加入 RNase 抑制剂、ATP 和 GMP-PNP。在 30 摄氏度下孵育 5 分钟。之后，向每个试管中加入 1 微升相应的 RNA，并在 30 摄氏度下再孵育 5 分钟。

在孵育期间，将 DTT 和亚精胺加入脚趾印缓冲液中。然后，向每个试管中加入 22 μL 脚趾印缓冲液，并在 30 摄氏度下孵育 3 分钟。接下来，加入 0.5 μL IR 染料标记的脚趾印引物，并在冰上孵育反应 10 分钟。

随后，加入 2 μL dNTP、2 μL 乙酸镁和 1 μL 禽成髓细胞增多症病毒逆转录酶。用脚趾打印缓冲液将最终体积降至 50 μL。然后，让引物在 30 摄氏度下延伸 45 分钟。

在脚趾印反应中添加乙酸镁也很重要，否则逆转录酶将无法发挥最佳功能。在此之后，加入 200 微升无核酸酶的水。加入 250 μL 25：24：1 苯酚：氯仿：异戊醇，pH 值 8.0，开始纯化 cDNA。

涡旋样品 5 秒后，在室温下以 20， 000 x g 的离心速度离心样品 3 分钟。接下来，小心地将含有 DNA 的水相转移到新的微量离心管中。然后，加入 3 倍体积的 100% 乙醇以沉淀 DNA 并涡旋 5 秒。

在 20 摄氏度下孵育过夜。第二天，将试管在 4 摄氏度下以 20， 000 x g 离心 30 分钟，然后弃去上清液。然后，用 500 微升冰冷的 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀，并在 4 摄氏度下以 20， 000 x g 离心 15 分钟。

多地吸出上清液，注意不要使沉淀脱落。然后，将沉淀风干 5 到 10 分钟。将 DNA 沉淀溶解在 6 μL 无核酸酶水中。

然后，加入 3 微升甲酰胺上样染料。使用测序试剂盒制备带有脚趾印引物和编码 XIAP IRES RNA 的 DNA 构建体的双脱氧核苷酸测序梯。然后，将每种测序反应的 6 μL 与 3 μL 的甲酰胺上样染料混合。

清洁和组装板后，倒入凝胶，然后插入梳子。凝胶聚合后，组装测序装置并用 1x TBE 填充储液槽。然后，在 1500 伏电压下预运行 15 分钟，直到达到 55 摄氏度的温度。

用甲酰胺染料将所有样品加热至 85 摄氏度 5 分钟。然后，将每个样品 1 微升加载到 6% 聚丙烯酰胺测序凝胶上，并在 1500 伏电压下运行凝胶 8 小时。最后，使用基于荧光的成像器实时读取条带。

该方法表明 RNA 的确认对于翻译起始复合物的形成至关重要。XIAP mRNA 核糖体复合物的逆转录可在 AUG 下游产生 17 至 19 个核苷酸的典型脚趾印。5'PPT 突变体显示脚趾印形成受损。

然而，当用 5' 帽转录时，会发生起始复合物的形成。同样，3'PPT 突变体也显示趾印形成受损。然而，带有 5' 帽的转录会导致起始复合物的形成。

同时携带 5'PPT 和 3'PPT 突变的双 PPT 突变体能够在没有 5'帽的情况下形成起始复合物。在没有 RRL 和 GMP-PNP 以及 Poly A 尾的情况下，起始密码子突变体的趾印形成受到严重损害。将 CDNA 产物与双脱氧核苷酸测序梯进行比较。

人 β 珠蛋白或 HBB mRNA 在没有 5' 帽的情况下没有脚趾印。然而，起始复合物在 HBB 的加帽 5'UTR 上形成，在 AUG 下游产生 16 至 18 个核苷酸的脚趾印。一旦掌握，这项技术可以在三天内完成，包括制备体外转录模板和 RNA（如果作得当）。

按照此程序，可以执行其他方法（如结构探测）来回答其他问题，例如 IRES 的野生型或突变型变体的二级结构。该技术发展起来后，为 mRNA 翻译领域的研究人员探索体外 IRES 介导的翻译铺平了道路。观看本视频后，您应该对如何对哺乳动物 mRNA 进行脚趾印和分析翻译起始复合物的形成有一个很好的了解。

不要忘记酸-苯酚、苯酚：氯仿：异戊醇和丙烯酰胺可能非常危险。使用这些试剂时应穿戴适当的个人防护装备。