Name: 哺乳动物基因翻译起始复合体形成的 Toeprinting 分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 学习哺乳动物mRNA翻译起始复合体形成的Toeprinting分析方法，了解IRES介导的翻译机制。该技术可详细分析特定mRNA与核糖体的相互作用，为基因表达调控研究提供重要工具。

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本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金（RGPIN-2017-05463）、加拿大创新基金会约翰·R·埃文斯领袖基金（35017）、阿尔伯塔省创新计划以及阿尔伯塔省经济发展与贸易部资助。

注意：RNA 极易被核糖核酸酶（RNases）降解。需采取标准预防措施以保持 RNA 的完整性。频繁更换手套。在本实验方案的所有步骤中，使用带滤芯的吸头、无核酸酶的塑料耗材和无核酸酶的试剂。所有溶液均使用无核酸酶水或焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水配制。
1. 溶液的配制
<ol>
	<li>配制趾印法缓冲液：20 mM Tris-HCl (pH 7.6)、100 mM KOAc、2.5 mM Mg(OAc)2、5% (w/v) 蔗糖、2 mM 二硫苏糖醇 (DTT) 和 0.5 mM 精脒。
	<ol>
		<li>将 DTT 和精脒分装成单次使用量，于 -20 °C 保存，以避免反复冻融。 
		注意：DTT 和精脒应在使用前立即加入趾印法缓冲液中。不含 DTT 和精脒的缓冲液溶液可于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 85 mM 5'-鸟苷亚氨基二磷酸 (GMP-PNP) 和 91 mM 三磷酸腺苷 (ATP) 分装成小份，于 -20 °C 保存。</li>
	<li>配制 450 mL 的 6% 聚丙烯酰胺-7 M 尿素凝胶混合液：67.5 mL 40% 丙烯酰胺:双丙烯酰胺 (19:1)、189 g 尿素、112.5 mL 5× TBE (Tris/硼酸/乙二胺四乙酸 (EDTA)) 和 120 mL 水。通过在 37 °C 水浴或加热板上搅拌加热溶解尿素。过滤溶液（例如，使用 0.2 μm 硝酸纤维素真空滤膜）。 
	注意：该溶液可在 4 °C 保存至少一个月。 
	警告：单体丙烯酰胺为可通过皮肤吸收的神经毒素。操作时务必避免皮肤接触（即，佩戴手套、实验服和护目镜）。聚丙烯酰胺也应小心处理，因为聚合反应可能无法完全进行。</li>
	<li>配制甲酰胺上样染料：95% 甲酰胺、18 mM EDTA、0.025% (w/v) 十二烷基硫酸钠 (SDS)、0.025% (w/v) 溴酚蓝、0.025% (w/v) 二甲苯青。于 -20 °C 保存。</li>
	<li>将 1 nmol 引物（5' CTCGATATGTGCATCTGTA；5' 端标记 IRDye 800）溶解于 100 μL 水中，得到 10 pmol/μL 的工作浓度。分装成单次使用量（约 10 µL），避光保存于 -20 °C。</li>
</ol>
2. mRNA的制备
<ol>
	<li>通过聚合酶链式反应（PCR）从合适的模板扩增用于合成 mRNA 的 DNA 模板（即，根据具体情况使用基因组DNA或质粒DNA。按照制造商说明书使用高保真DNA聚合酶，反应条件如下（35个循环）：变性，98 °C，10 s；退火，53 °C，20 s；延伸，72 °C，30 s。 
	注意：上游引物（5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG）包含T7启动子序列，可用于RNA转录；下游引物（5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG）包含51个胸腺嘧啶残基，以提供转录RNA的poly-A尾。请注意，RNA也可以 体外 从质粒DNA转录而来。</li>
	<li>使用合适的转录试剂盒 体外 从DNA模板转录含有IRES的RNA或加帽RNA。按照制造商说明书操作。在标准的20 μL反应体系中制备RNA样本。用2单位无RNase的DNase在37 °C处理新合成的RNA 30分钟。</li>
	<li>用无核酸酶水将经DNase处理的RNA稀释至110 µL，加入110 µL酸性酚，&#160;涡旋5秒，室温下以20,000 × g离心3分钟。取100 µL水相转移至新的1.5 mL离心管中，加入10 µL 3 M醋酸钠，涡旋2秒。&#160;加入3倍体积的100%乙醇，涡旋5秒，于-20 °C过夜沉淀RNA。</li>
	<li>离心 &#62;20,000 × g，4 °C 离心 30 分钟，弃上清液。用 500 µL 冰冷的 70%（v/v）乙醇洗涤沉淀，再次离心。尽可能吸尽上清液，将沉淀在空气中干燥 5–10 分钟。注意勿使沉淀脱落。</li>
	<li>将RNA重悬于适量无核酸酶的水中，使其工作浓度为0.5 μg/μL。可立即使用或于-80 °C保存。</li>
</ol>
3. 脚趾印迹反应
<ol>
	<li>在1.5 mL微量离心管中混合15 μL兔网织红细胞裂解液（RRL，未经核酸酶处理）、1 μL（40单位）RNase抑制剂、1 µL 91 mM ATP（终浓度1.82 mM）和1 µL 85 mM GMP-PNP（终浓度1.7 mM）。30 °C孵育5分钟。 
	注意：RRL应分装为单次使用量，以避免反复冻融。一个关键对照是不加RRL的反应，用于阐明由于RNA二级结构导致的逆转录自然暂停现象。&#160;此对照中用趾印缓冲液替代RRL。&#160;</li>
	<li>加入0.5 µg（1 µL）RNA，并在30 °C孵育5分钟。</li>
	<li>加入22 µL趾印缓冲液，并在30 °C孵育3分钟。</li>
	<li>加入0.5 µL（5 pmol）IRDye标记的引物，在冰上孵育10分钟。</li>
	<li>加入2 µL 25 mM dNTPs（终浓度：每种1 mM）、2 µL 100 mM Mg(OAc)2、1 µL禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶（AMV-RT）和3.5 µL趾印缓冲液。最终体积为50 μL。</li>
	<li>在30 °C下孵育反应体系45分钟。</li>
	<li>加入200 µL无核酸酶水，立即用250 µL 25:24:1苯酚:氯仿:异戊醇（pH约8.0）抽提。涡旋5秒，室温下以20,000 × g离心3分钟。将水相转移至新的1.5 mL微量离心管中，加入3倍体积的100%乙醇，涡旋5秒，于-20 °C沉淀过夜。</li>
	<li>在 &#62;20,000 × g 条件下于4 °C离心30分钟，弃上清。用500 µL预冷的70%（v/v）乙醇洗涤DNA沉淀。在 &#62;20,000 × g 条件下于4 °C再离心15分钟。尽可能吸除上清，空气干燥沉淀5–10分钟。注意不要使沉淀脱落。</li>
	<li>将沉淀溶解于6 μL无核酸酶水中，加入3 μL甲酰胺加样染料。</li>
</ol>
4. 测序反应
<ol>
	<li>使用2.1步骤中的DNA模板和3.4步骤中IRDye标记的引物进行标准测序反应，以双脱氧核苷酸（ddNTPs）作为链终止子。采用合适的DNA测序试剂盒，并遵循制造商的说明。</li>
	<li>将每种测序反应产物6 μL与3 μL甲酰胺上样染料混合。</li>
</ol>
5. 测序凝胶的制备与电泳
注意：本实验方案使用荧光凝胶成像仪和尺寸为 21 cm x 23 cm x 0.2 mm 的凝胶，但可根据需要适配于其他测序仪或凝胶尺寸。
<ol>
	<li>用100%乙醇彻底清洗0.2 mm垫片以及短玻璃板（23 × 25 cm）和长玻璃板（30 × 25 cm），然后自然晾干。</li>
	<li>将30 mL 6%聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶混合液与200 μL 10%（w/v）过硫酸铵（APS）和20 μL四甲基乙二胺（TEMED）混合。小心倾注凝胶，避免产生气泡，并插入“锯齿状”凝胶梳。室温下静置1小时，使凝胶充分聚合。</li>
	<li>组装测序装置，并向储液槽中加入1× TBE缓冲液。</li>
	<li>在1500 V条件下预电泳15分钟，直至达到55 °C的最佳运行温度。</li>
	<li>将样品与上样染料混合液（来自步骤3.9或4.2）在85 °C加热5分钟，取1 μL上样至测序凝胶中。</li>
	<li>在1500 V条件下电泳8小时。仪器将实时读取条带信号。</li>
	<li>拆卸装置，并妥善处理丙烯酰胺凝胶和电泳缓冲液。</li>
</ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15803138">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+just+scanning%3A+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li>
<li>Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Eukaryotic+Initiation+Factors+during+Cellular+Stress+and+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression.</a> J Nucleic Acids. 2016, 8235121(2016).</li>
<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Anthony, D. D., Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+40+S+and+80+S+complexes+with+mRNA+as+measured+by+sucrose+density+gradients+and+primer+extension+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition.</a> J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).</li>
<li>Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+inhibition+analysis+of+translation+initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extension inhibition analysis of translation initiation complexes.</a> Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).</li>
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<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Thakor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mRNA+recruits+the+ribosome+via+eIF3-PABP+bridge+to+initiate+internal+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation.</a> RNA Biol. , 1-15 (2016).</li>
<li>Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+IRES-mediated+translation+of+the+c-myc+and+BiP+mRNAs+by+the+poly%28A%29+tail+is+independent+of+intact+eIF4G+and+PABP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP.</a> Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).</li>
<li>Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+search+for+structurally+similar+cellular+internal+ribosome+entry+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites.</a> Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).</li>
<li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+a+single+GTP+is+used+in+the+formation+of+80+S+initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes.</a> J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).</li>
<li>Arnaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+34-Kilodalton+Isoform+of+Human+Fibroblast+Growth+Factor+2+Is+Cap+Dependently+Synthesized+by+Using+a+Non-AUG+Start+Codon+and+Behaves+as+a+Survival+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).</li>
<li>Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+48S+translation+preinitiation+complexes+into+80S+initiation+complexes+as+revealed+by+toeprinting%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting.</a> FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295(2014).</li>
<li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331(2017).</li>
<li>Beck, H. J., Janssen, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Translation+Initiation+Regulation+Mechanism+in+Escherichia+coli+ptrB+Mediated+by+a+5%27-Terminal+AUG%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG.</a> J Bacteriol. 199 (14), (2017).</li>
</ol>

作者无利益冲突需要披露。

趾印法是一种强大的技术，可直接在高度受控条件下测定特定RNA支持翻译起始复合物形成的能力。本方案描述了一种简化的用于哺乳动物RNA的趾印法技术。采用兔网织红细胞裂解液（RRL）作为核糖体、真核起始因子（eIFs）、起始tRNA和IRES的便捷来源。 转-作用因子（ITAFs）。实验者可提供其选择的RNA，并可选择性地向趾印反应中添加特定的辅助因子。例如，48S 与 80S翻译起始复合物可根据趾印荧光强度的分布进行区分7起始复合物的形成取决于所使用的鸟嘌呤核苷酸类型。对于本文讨论的XIAP IRES而言，GMP-PNP与ATP共同作用可稳定48S前起始复合物，其特征表现为+17≥+18的趾印分布&#62;+19. GMP-PNP 是一种不可水解的 GTP 类似物，可抑制核糖体亚基的结合，从而在 48S 阶段阻断翻译起始13相比之下，GTP、ATP 或 ATP 加 GTP 能够稳定 80S 起始复合物，其特征为 +17 位点的趾印分布&#60;+18&#62; +198</s...

由于翻译过程消耗了细胞的大部分能量，因此翻译受到严密调控是合理的1。相反，在应激反应和疾病状态（如癌症）中，常可观察到翻译的失调以及随之而来的蛋白质产出改变1,2。转录调控的一个主要优势在于细胞能够快速改变其蛋白质产出，以响应各种刺激3。因此，翻译调控代表了一种能够影响细胞存活与死亡的重要机制1,2,3。在翻译的各个步骤中，起始阶段是调控最严格且最复杂的环节3。简而言之，大多数真核生物mRNA含有一个5' m7G帽结构，该结构几乎总是其翻译所必需的。帽依赖性起始需要真核起始因子eIF4E、eIF4A和eIF4G（即帽识别复合物）与mRNA的5'端结合。包含eIF2结合的起始tRNA和eIF3的43S前起始核糖体复合物，通过eIF4G与eIF3的相互作用被招募至mRNA的5'端。据认为，前起始复合物在eIF4A（一种RNA解旋酶）的协助下沿mRNA扫描，直至定位到起始密码子（AUG）。随后形成48S起始复合物，并将tRNA送入核糖体的P位点。最终，60S和40S核糖体亚基结合形成80S起始复合物，继而进入翻译延伸阶段1,3,4。相比之下，内部核糖体进入位点（IRESes）可通过直接将40S核糖体亚基招募至起始密码子，从而绕过对5'帽结构的需求3。生理应激条件下，由于关键的通用真核起始因子（eIFs）发生修饰，导致整体mRNA翻译受到抑制。然而，非经典翻译起始机制使得某些mRNA的选择性翻译得以进行，这些mRNA通常编码应激反应蛋白，而非经典翻译起始的失调与癌症等疾病状态相关1,2。特定的RNA调控元件（如细胞内的IRESes）可介导此类mRNA的翻译2,3。
转录调控中一个特别有趣的研究方向是理解特定mRNA的规范翻译与非规范翻译的机制。趾印法（Toeprinting）是一种能够对特定RNA的翻译起始机制进行深入研究的技术。 体外趾印分析的总体目标是评估目标RNA在不同条件下与核糖体形成翻译起始复合物的能力，以确定哪些序列、结构元件或辅助因子对于高效的翻译起始是必需的。例如，在缺乏5'帽子结构时，核糖体的招募可能受到阻碍，而内部核糖体进入位点（IRES）的存在则可能促进核糖体的招募。
该技术的原理是 体外 转录目标RNA，在含有翻译组分（或纯化组分）的细胞提取物中孵育，以形成起始复合物，随后用特异性引物对RNA进行逆转录。稳定的RNA-核糖体复合物将导致逆转录在核糖体的3'边缘停滞，即所谓的“趾印”（toeprint）5,6,7.
在本实验方案中，核糖体亚基、eIFs、tRNAs 以及 IRES 反式作用因子（ITAFs）均由兔网织红细胞裂解液（RRL）提供，操作便捷。该方案的另一优势在于使用荧光标记的引物和基于荧光的凝胶成像系统，而非放射性标记引物。这省去了额外步骤，包括引物的放射性标记、凝胶干燥以及曝光至增感屏的过程。荧光条带可在电泳运行过程中实时记录，从而获得更高的分辨率。本文以无帽结构的X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）IRES RNA 为例进行说明，尽管该技术也可用于分析带帽结构的mRNA8。
与在细胞裂解物中检测翻译过程最终产物的西方印迹分析不同，趾印分析（toeprinting）是一种 体外 研究RNA上翻译起始复合物形成的简化方法。该简化方法可对调控翻译起始的底物或因子进行高精度的详细研究（例如，加帽或未加帽的mRNA，IRES结构，poly-A尾的有无，特定蛋白因子的提供 等等因此，趾印法可用于研究不同的翻译模式8 或mRNA结构（如IRES）对蛋白质合成的影响9,10.

<table><tbody><tr><td>DEPC（焦碳酸二乙酯）</td><td>Sigma</td><td>D5758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TRIS 碱，超纯级</td><td>JT Baker</td><td>4109-01</td><td></td></tr><tr><td>KOAc（乙酸钾）</td><td>Bio Basic</td><td>PB0438</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（四水合乙酸镁）</td><td>Bio Basic</td><td>MB0326</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖，分子生物学级</td><td>Calbiochem</td><td>573113-1KG</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PNP（5&amp;prime;-[&amp;beta;,&amp;gamma;-亚氨基]三磷酸鸟苷三钠盐水合物），0.1 M 溶液</td><td>Sigma</td><td>G0635</td><td></td></tr><tr><td>ATP（5&amp;prime;-三磷酸腺苷）二钠盐，100 mM 溶液</td><td>Sigma</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>19:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺，40%</td><td>Bio Basic</td><td>A0006</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Bio Basic</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 瓶口过滤器，0.2 &amp;micro;m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.101</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（二钠盐，二水合物）</td><td>Bio Basic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio Basic</td><td>SB0485</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Bio Basic</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯青 FF</td><td>Bio Basic</td><td>XB0005</td><td></td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 体外转录试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 体外转录试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>酸性酚:氯仿（5:1）</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>25:24:1 酚:氯仿:异戊醇</td><td>Invitrogen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>兔网织红细胞裂解液（RRL）。不得经过核酸酶处理。</td><td>Green Hectares, USA</td><td></td><td>联系 Green Hectares，索取 1:1 RRL:水混合液</td></tr><tr><td>RiboLock RNase 抑制剂（40 U/&amp;micro;L）</td><td>Thermo Fisher</td><td>E00382</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>56172, 56173, 56174, 56175</td><td>等体积混合，得到每种 25 mM 的储存液。</td></tr><tr><td>AMV-RT，10 U/&amp;micro;L</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Sequenase Version 2.0 DNA 测序试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>707701KT</td><td></td></tr><tr><td>Model 4200 IR2 DNA 分析仪</td><td>LI-COR</td><td></td><td>产品已停产</td></tr><tr><td>APS（过硫酸铵）</td><td>Bio Basic</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Basic</td><td>TB0508</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Turbo Dnase</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳动物mrna上翻译起始复合物形成的脚印分析

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

翻译起始是蛋白质合成的限速步骤，也是细胞调控其蛋白质产出的关键节点。蛋白质合成的调控对于细胞应激反应至关重要，而其失调则与多种疾病状态（如癌症）密切相关。例如，尽管细胞应激会通过抑制帽依赖性起始来降低全局翻译水平，但某些应激反应蛋白仍可通过非帽依赖的方式被选择性翻译。特定的RNA调控元件，如细胞内核糖体进入位点（internal ribosome entry sites, IRESes），能够介导这些特定mRNA的翻译。鉴定此类mRNA并表征其调控机制，一直是分子生物学研究的重要方向。趾印法（toeprinting）是一种用于研究RNA结构与功能（特别是与翻译起始相关）的方法。趾印法的目标是评估 体外 转录的RNA在多种条件下与核糖体形成稳定的复合物，以确定参与核糖体结合的序列、结构元件或辅助因子——这是高效翻译起始的前提。结合其他技术，如蛋白质印迹分析和多核糖体分析，引物延伸抑制实验（toeprinting）可对翻译起始调控机制进行系统而可靠的表征。

我们此前已描述过XIAP IRES支持帽非依赖性翻译起始的能力 体外8,10趾印法是探究XIAP IRES起始复合物作用机制细节的关键技术。编码含有XIAP IRES的mRNA的DNA构建体（图1A）是 体外 转录后进行趾印分析。此处使用的XIAP IRES mRNA突变体变体如图所示 图1B. XIAP mRNA-核糖体复合物的逆转录产生了典型的阻滞信号，位于AUG下游+17至+19 nt处（图1C，泳道 1这表明核糖体被招募到起始密码子，并形成了稳定的核糖体-RNA复合物5,</su...

趾印法旨在测量 体外 在多种条件下，转录的RNA与核糖体形成翻译起始复合物。本方案描述了一种用于趾印法分析哺乳动物RNA的方法，可用于研究帽依赖性翻译和IRES驱动的翻译。

哺乳动物mRNA上翻译起始复合物形成的脚印分析

翻译起始是蛋白质合成的限速步骤，也是细胞调控其蛋白质表达水平的关键环节。调控……

本趾印分析的总体目标是观察翻译起始复合物在哺乳动物 mRNA 上的形成。该方法有助于解答 mRNA 翻译领域的关键问题，例如由 IRES 介导的翻译起始。该技术的主要优势在于能够对特定 mRNA 上的翻译起始复合物形成进行详细分析。组装转录反应体系，以PCR扩增的DNA模板为模板转录XIAP IRES RNA或其突变体RNA。随后，向每20微升RNA反应体系中加入2单位无RNase的DNase，以去除DNA模板。37摄氏度孵育30分钟。然后，用无核酸酶的水将经DNase处理的RNA稀释至终体积为110 µL。接着，加入110 µL酸性酚以开始RNA纯化。将样品涡旋振荡5秒，并在室温下以20,000 × g离心3分钟。在进行苯酚抽提前，必须将RNA或cDNA进行稀释。如果体积过小，则难以有效地回收水相，最终得率会很低。然后，小心地将含有RNA的水相100微升转移至新的微量离心管中。加入10 µL 3 M乙酸钠（pH 5.5），混匀样品。然后加入三倍体积的100%乙醇以沉淀RNA，涡旋混匀样品5秒。在20 °C下孵育过夜。第二天，在 4°C 条件下以 20,000 × g 离心 30 分钟，弃去上清液。随后用 500 微升预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀，并重复离心步骤。小心吸除尽可能多的上清液，注意不要扰动沉淀。然后将沉淀在空气中干燥5到10分钟。用无核酸酶的水重悬沉淀，使其终浓度为0.5微克/微升。开始进行趾印分析时，向每个1.5毫升微量离心管中加入15微升未经核酸酶处理的兔网织红细胞裂解液，这些管中分别含有野生型XIAP IRES RNA及其突变体。向每支试管中加入RNase抑制剂、ATP和GMP-PNP。在30摄氏度下孵育5分钟。随后，向每支试管中加入1微升相应的RNA，并在30摄氏度下继续孵育5分钟。在孵育期间，将DTT和亚精胺加入到引物延伸阻滞缓冲液中。然后，向每个离心管中加入22微升引物延伸阻滞缓冲液，在30摄氏度孵育3分钟。接着，加入0.5微升IR荧光标记的引物延伸阻滞引物，将反应体系置于冰上孵育10分钟。随后，加入 2 µL dNTPs、2 µL 醋酸镁和 1 µL 禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶。用 toeprinting 缓冲液将终体积调至 50 µL。然后，在 30 °C 下孵育 45 分钟，进行引物延伸。向趾印反应中加入乙酸镁也至关重要，否则逆转录酶无法发挥最佳功能。随后加入 200 微升无核酸酶水。加入 250 微升 25:24:1 酚:氯仿:异戊醇（pH 8.0），以开始 cDNA 的纯化。将样品涡旋振荡5秒后，在室温下以20,000 × g离心3分钟。随后，小心地将含有DNA的水相转移至新的微量离心管中。然后加入三倍体积的100%乙醇以沉淀DNA，并涡旋振荡5秒。在20摄氏度下孵育过夜。第二天，在4摄氏度下以20,000 × g离心30分钟，弃去上清液。随后，用500微升预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，在4摄氏度下以20,000 × g离心15分钟。尽可能吸除上清液，注意不要扰动沉淀。然后将沉淀在空气中干燥5到10分钟。将DNA沉淀溶解于6 µL无核酸酶的水中。然后，加入3 µL甲酰胺上样染料。使用测序试剂盒，以toeprinting引物和编码XIAP IRES RNA的DNA构建体来制备双脱氧核苷酸测序梯度。随后，将每种测序反应的6 µL与3 µL甲酰胺上样染料混合。清洗并组装好胶板后，倒入凝胶并插入梳子。待凝胶聚合完成后，组装测序装置，并向槽内加入1× TBE缓冲液。随后在1500伏电压下预电泳15分钟，直至温度达到55摄氏度。将所有样品与甲酰胺染料在85摄氏度下加热5分钟。然后，将每个样品取1微升加样至6%聚丙烯酰胺测序凝胶上，在1500伏电压下电泳运行8小时。最后，使用基于荧光的成像仪实时读取条带。该方法表明，RNA 的确认对于翻译起始复合物的形成至关重要。XIAP mRNA 核糖体复合物的反转录在 AUG 起始密码子下游 17 至 19 个核苷酸处产生典型的阻滞信号（toeprints）。5'PPT 突变体显示出阻滞信号形成的缺陷。然而，在带有5'帽结构进行转录时，会形成起始复合物。类似地，3'PPT突变体也表现出趾印信号形成受损。然而，带有5'帽结构的转录可导致起始复合物的形成。同时携带5'PPT和3'PPT突变的双PPT突变体能够在无5'帽结构的情况下形成起始复合物。在缺乏RRL、GMP-PNP和poly A尾的情况下，起始密码子突变体的趾印信号形成受到显著抑制。将cDNA产物与双脱氧核苷酸测序梯进行比较。人β珠蛋白（human beta globin）或HBB mRNA在缺乏5'帽结构时不会出现趾印（toeprint）信号。然而，在带有5'帽结构的HBB 5'非翻译区（5'UTR）上可形成起始复合物，产生位于AUG起始密码子下游16至18个核苷酸处的趾印信号。若操作得当，掌握该技术后可在三天内完成，包括体外转录模板和RNA的制备。完成此操作后，还可进行其他方法，例如结构探针实验，以回答更多问题，如IRES的野生型或突变体变体的二级结构。该技术建立后，为mRNA翻译领域的研究人员探索IRES介导的体外翻译铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何对哺乳动物mRNA进行阻滞测序（toeprinting），以及如何分析翻译起始复合物的形成。请勿忘记，酸性酚、酚:氯仿:异戊醇和丙烯酰胺可能具有极高危险性。使用这些试剂时应穿戴适当个人防护装备。

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哺乳动物基因翻译起始复合体形成的 Toeprinting 分析

对含有新生肽酰-tRNA的核糖体进行生化分析的主要障碍在于，同一样品中存在其他核糖体，这些核糖体并未参与待分析的特定mRNA序列的翻译。我们开发了一种简单的方法，可特异性纯化仅含有目标新生肽酰-tRNA的核糖体。...

分离含有肽基-tRNA的翻译核糖体用于功能与结构分析

本文介绍了一种用于分析真核细胞在应激条件下mRNA翻译起始变化的方法。该方法基于正在翻译的核糖体与非翻译核糖体在蔗糖梯度中沉降速度的差异进行分离。...

应激条件下通过多聚核糖体分析检测翻译起始

本方案介绍了多核糖体分级分离的关键改进方法，用于研究体内中枢神经系统（CNS）样本的翻译组。通过分离并比较总RNA与核糖体结合的RNA组分，可实现对翻译和转录调控的全局评估。...

in vivo 中通过多聚核糖体分级分离研究中枢神经系统翻译组

核糖体在蛋白质合成中起着核心作用。通过蔗糖密度梯度离心法对多核糖体（多聚体）进行分级分离，可直接在全基因组范围内测定各个mRNA的翻译效率。此外，该方法还可用于对与核糖体和多核糖体相关的分子（如分子伴侣和信号分子）进行生物化学分析。...

多聚核糖体分级分离及哺乳动物转译组的全基因组规模分析

本文描述了一种用于可视化并定量亚细胞区室中局部翻译事件的方法。该方法仅需基础的共聚焦成像系统及试剂，具有快速、经济高效的特点。...

定量免疫荧光法检测全局限域性翻译

本文描述了仅需短合成DNA和RNA寡核苷酸以及纯化的RNA聚合酶II（Pol II）即可组装Pol II延伸复合物的方法。这些复合物可用于研究与Pol...

用于解析共转录 RNA 加工事件的人工 RNA 聚合酶 II 延伸复合物

追踪单个翻译事件可实现对帽依赖性翻译机制的高分辨率动力学研究。本文中我们展示了一种 体外 基于荧光标记抗体与表位标记新生肽段之间相互作用成像的单分子检测方法。该方法可实现对活性翻译过程中起始及肽链延伸动力学的单分子表征 体外...

一个 体外 单分子成像分析帽依赖性翻译动力学实验方法

本方案描述了一种报告基因检测方法，用于研究单个卵母细胞中mRNA翻译的调控过程 体外...

利用单卵母细胞报告基因检测法定义体外成熟过程中母源mRNA翻译程序

我们介绍一种利用甲醛交联在活酵母和哺乳动物细胞中快速稳定翻译（蛋白质生物合成）复合物的技术。该方法能够解析瞬时中间产物以及动态的RNA:蛋白质相互作用。交联后的复合物可用于多种下游应用，例如基于深度测序的分析方法、显微镜观察和质谱分析。...

快速 体内 真核细胞中翻译复合物的固定与分离

本文描述了在低温条件下通过固态研磨破碎哺乳动物细胞，从所得细胞粉末制备细胞提取物，并利用抗体偶联的微米级顺磁性珠进行亲和捕获以分离目标蛋白复合物的实验方案。...

从冷冻研磨的哺乳动物细胞中进行蛋白质复合物亲和捕获

学习哺乳动物mRNA翻译起始复合体形成的Toeprinting分析方法，了解IRES介导的翻译机制。该技术可详细分析特定mRNA与核糖体的相互作用，为基因表达调控研究提供重要工具。

哺乳动物mRNA上翻译起始复合物形成的脚印分析

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