Name: Retroductal 纳米微粒注射液对小鼠颌下腺的治疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 了解通过逆行导管注射将聚合物纳米颗粒直接递送至小鼠颌下腺的局部给药技术。该方法绕过全身循环，为研究唾液腺生物学和开发辐射诱导唾液腺功能障碍的新疗法提供了可重复的实验方案。

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本研究工作得到了美国国立牙科与颅面研究所（NIDCR）和美国国立卫生研究院国家癌症研究所（NCI）的资助，项目编号为 R56 DE025098、UG3 DE027695 和 F30 CA206296。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。本研究还得到了美国国家科学基金会（NSF）DMR 1206219 项目以及国际牙科研究协会（IADR）口腔护理创新奖（2016 年）的支持。
我们感谢Jayne Gavrity在进行IVIS实验中的帮助。我们感谢Karen Bentley在进行电镜实验（EM）过程中的建议和协助。我们感谢Pei-Lun Weng在免疫组织化学（IHC）方面的协助。我们感谢Matthew Ingalls在图片准备方面的帮助。我们感谢Elaine Smolock博士和Emily Wu对本文稿的审阅和宝贵意见。

全部 体内 以下程序已获罗切斯特大学罗切斯特动物资源委员会批准，&#160;纽约
1. 准备
<ol>
	<li>使用带内置金属丝的32G颅内导管管路，截取3 cm长的管段，制成与管路长轴成约45°斜面的尖端。确认金属丝比管路至少长出1 cm。</li>
	<li>将50 µL的PSMA纳米颗粒溶液（图1），或其他注射材料，装入汉密尔顿注射器中。为降低注射过程中发生压力性损伤的风险，将去除金属芯的导管管路连接至注射器，并排出死腔体积。</li>
	<li>检查注射溶液，确保纳米颗粒完全溶解，以防止给药后导管阻塞。</li>
	<li>配制浓度为0.1 mg/mL的阿托品溶液。 
	注意：由于阿托品对光敏感且会随时间降解，该溶液应在注射当天配制，并在使用前避光保存。</li>
</ol>
2. 胰管入口点的获取与可视化
<ol>
	<li>使用分析天平称量 C57/BL6 小鼠的体重。</li>
	<li>使用 0.5 mL 注射器配合 29G × ½" 针头，通过腹腔注射无菌生理盐水配制的 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪麻醉小鼠。当小鼠对刺激无反应时，即可进行下一步操作，通常在注射后 5 至 10 分钟内发生。 
	注意：该操作也可在异氟烷麻醉下进行，但需要使用可让口腔通路保持开放的定制鼻罩。</li>
	<li>为防止操作过程中眼睛干燥，应在眼部涂抹润滑剂，并将小鼠以俯卧位固定于定制平台上。 
	注意：为维持口内操作的适当条件，所有工具在每次使用前均应进行消毒或灭菌。</li>
	<li>将上颌门齿固定在金属横梁上方以打开口腔，并使用弹性带在下颌门齿后方施加向下的张力（图 2A）。</li>
	<li>将小鼠置于体视显微镜下方并调整位置，以便观察下颌底部。</li>
	<li>使用定制的弧形钢制牵开器对颊黏膜双侧施加牵拉力，以扩大口腔开口。</li>
	<li>用钝头镊子夹住舌头并轻轻上提，以暴露口底，从而观察下颌下乳头。 
	注意：乳头表现为舌下两侧的两个浅色突起（图 2B）。</li>
	<li>为便于观察及进一步在口腔内进行操作，可在舌头与颊黏膜之间放置棉球。</li>
</ol>
3. 导管插管与导管置入
<ol>
	<li>使用精细的弯镊夹住带导丝的导管管路。为在插管过程中获得最佳手动控制，应将管路与镊子的弯曲弧度对齐（图3A）。</li>
	<li>在解剖显微镜下，将镊子和导丝移入视野。 
	注意：导丝应从管路末端伸出。</li>
	<li>使用导丝末端轻柔地对一侧下颌下乳头基部施加压力，造成一个微小的浅表黏膜穿刺（直径0.076 mm），以利于后续插入导管管路（直径0.25 mm）。若遇到阻力，应使用锋利的解剖剪为管路和导丝末端剪出新的斜面。</li>
	<li>穿刺完成后，撤出导丝，并在解剖显微镜下确认穿刺部位有唾液渗出。避免对导丝进行剧烈或突然的移动（无论是撤出还是插入），以防引起出血或破坏导管完整性。</li>
	<li>将导丝回撤至管路内部（图3B）。</li>
	<li>为确保注射管路能够顺利进入Wharton管开口，将带有导丝作为刚性引导的管路插入先前制作的穿刺孔中（图2C）。 
	注意：若操作不够迅速，局部肿胀可能阻碍再次插入。</li>
	<li>为防止因长时间阻塞导管而产生反压，需暂时撤出管路。检查并确认在显微镜下可见下颌下乳头处存在开放的穿刺孔。若出现明显出血，应取出导丝，并在对侧下颌下乳头从步骤3.2重新开始尝试。</li>
	<li>在不移动小鼠的情况下，给予1 mg/kg阿托品溶液腹腔注射，以减少操作过程中的唾液分泌。等待5–10分钟。</li>
	<li>握住注射器管路末端，在解剖显微镜下将其插入开口处（图3C）。若遇到阻力，应剪出新的斜面末端并重新尝试。</li>
	<li>当管路就位进入下颌下乳头后，缓慢向前推进3–5 mm进入导管。随后松开镊子夹持的管路。</li>
	<li>为增强管路与下颌下乳头之间的密封性，用纱布轻轻按压界面处1分钟以吸干液体。</li>
	<li>检查确认在干燥过程中管路位置未发生移动。</li>
</ol>
4. 注射
<ol>
	<li>以 10 µL/min 的速率注射材料。观察以确认小鼠仍处于镇静状态，且无痛苦迹象（图 2D）。 
	注意：注射 15–50 µL 的体积耐受性良好。注射较大体积可能导致气压性损伤。</li>
	<li>注射完成后，保持注射器压力 5 分钟，以提高材料在华通氏管和下颌下腺（SMG）内的滞留效果（图 4）。定期检查下颌下乳头，确保导管未从导管开口脱出。</li>
	<li>使用精细镊子夹住导管，轻柔地从下颌下乳头处撤出导管。 
	注意：观察到少量液体从乳头流出属于正常现象。</li>
	<li>在将小鼠移离操作台前，取出口腔内的牵开器和棉球。 
	注意：动物必须在恢复足够意识、能够维持胸卧位之前不得无人看管。此外，应确保小鼠在完全恢复前不与其他小鼠同笼饲养。</li>
</ol>
5. 验证与分析
注意：一个 体内 成像系统（IVIS）可用于评估注射后荧光标记纳米颗粒的滞留情况（如注射后1 h和24 h所示） 图5).
<ol>
	<li>为了更清晰地通过皮肤观察下颌下腺（SMG）内的荧光信号，可使用剃毛或化学脱毛剂去除覆盖在下颌下腺区域的腹部毛发。 
	注意：在动物安乐死后，也可取出下颌下腺组织，用4%多聚甲醛固定过夜，并通过免疫组织化学染色，以确认荧光标记的纳米颗粒（NP）在注射后一天仍存在于组织中（图6）。</li>
</ol>

<ol><li>Miranda-Rius, J., Brunet-Llobet, L., Lahor-Soler, E., Farre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+Secretory+Disorders%2C+Inducing+Drugs%2C+and+Clinical+Management%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Salivary Secretory Disorders, Inducing Drugs, and Clinical Management.</a> International Journal Of Medical Sciences. 12 (10), 811-824 (2015).</li>
<li>Acauan, M. D., Figueiredo, M. A. Z., Cherubini, K., Gomes, A. P. N., Salum, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy-induced+salivary+dysfunction%3A+Structural+changes%2C+pathogenetic+mechanisms+and+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy-induced salivary dysfunction: Structural changes, pathogenetic mechanisms and therapies.</a> Archives of Oral Biology. 60 (12), 1802-1810 (2015).</li>
<li>Dirix, P., Nuyts, S., Vander Poorten, V., Delaere, P., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+xerostomia+after+radiotherapy+on+quality+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Supportive+Care+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">The influence of xerostomia after radiotherapy on quality of life.</a> Supportive Care in Cancer. 16 (2), 171-179 (2008).</li>
<li>Vissink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+management+of+salivary+gland+hypofunction+and+xerostomia+in+head-and-neck+cancer+patients%3A+successes+and+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Clinical management of salivary gland hypofunction and xerostomia in head-and-neck cancer patients: successes and barriers.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (4), 983-991 (2010).</li>
<li>Delporte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fluid+secretion+after+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+to+irradiated+rat+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (7), 3268-3273 (1997).</li>
<li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+in+salivary+glands%3A+from+the+bench+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Gene delivery in salivary glands: from the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1812 (11), 1515-1521 (2011).</li>
<li>Beahm, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+approaches+to+the+submandibular+gland%3A+A+review+of+literature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Surgical approaches to the submandibular gland: A review of literature.</a> International Journal of Surgery. 7 (6), 503-509 (2009).</li>
<li>Zheng, C., Shinomiya, T., Goldsmith, C. M., Di Pasquale, G., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+and+reproducible+in+vivo+gene+transfer+to+mouse+parotid+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+diseases%22%5BJournal%5D)">Convenient and reproducible in vivo gene transfer to mouse parotid glands.</a> Oral diseases. 17 (1), 77-82 (2011).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Radiation-Induced+Salivary+Hypofunction+Following+hKGF+Gene+Delivery+to+Murine+Submandibular+Glands%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prevention of Radiation-Induced Salivary Hypofunction Following hKGF Gene Delivery to Murine Submandibular Glands.</a> Clinical Cancer Research. 17 (9), 2842-2851 (2011).</li>
<li>Okazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+rat+salivary+gland+tissue+repair+by+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Acceleration of rat salivary gland tissue repair by basic fibroblast growth factor.</a> Archives of Oral Biology. 45 (10), 911-919 (2000).</li>
<li>Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-mediated+gene+silencing+confers+radioprotection+to+salivary+glands+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo.</a> Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).</li>
<li>Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+irradiation-induced+salivary+hypofunction+by+microvessel+protection+in+mouse+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands.</a> Molecular Therapy. 15 (12), 2101-2106 (2007).</li>
<li>Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersed+donor+salivary+gland+cells+are+widely+distributed+in+the+recipient+gland+when+infused+up+the+ductal+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree.</a> Biotechnic & Histochemistry. 84 (6), 253-260 (2009).</li>
<li>Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+radiation+therapy-induced+salivary+gland+dysfunction+in+mice+by+post+therapy+IGF-1+administration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration.</a> BMC Cancer. 10, 417-417 (2010).</li>
<li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-Like+Growth+Factor-1+Preserves+Salivary+Gland+Function+After+Fractionated+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (2), 579-586 (2010).</li>
<li>Marmary, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26759233">Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL-6 modulation.</a> Cancer Research. , (2016).</li>
<li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19403-19407 (2012).</li>
<li>Arany, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+gene+knockdown+mediated+by+nanocomplexed+siRNA+reduces+radiation+damage+in+primary+salivary+gland+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic gene knockdown mediated by nanocomplexed siRNA reduces radiation damage in primary salivary gland cultures.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (6), 1955-1965 (2012).</li>
<li>Benoit, D. S. W., Henry, S. M., Shubin, A. D., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-responsive+polymeric+siRNA+carriers+sensitize+multidrug+resistant+ovarian+cancer+cells+to+doxorubicin+via+knockdown+of+polo-like+kinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">pH-responsive polymeric siRNA carriers sensitize multidrug resistant ovarian cancer cells to doxorubicin via knockdown of polo-like kinase 1.</a> Molecular pharmaceutics. 7 (2), 442-455 (2010).</li>
<li>Malcolm, D. W., Varghese, J. J., Sorrells, J. E., Ovitt, C. E., Benoit, D. S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Biological+Fluids+on+Colloidal+Stability+and+siRNA+Delivery+of+a+pH-Responsive+Micellar+Nanoparticle+Delivery+System%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The Effects of Biological Fluids on Colloidal Stability and siRNA Delivery of a pH-Responsive Micellar Nanoparticle Delivery System.</a> ACS Nano. , (2017).</li>
<li>Baranello, M. P., Bauer, L., Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28styrene-alt-maleic+anhydride%29-based+diblock+copolymer+micelles+exhibit+versatile+hydrophobic+drug+loading%2C+drug-dependent+release%2C+and+internalization+by+multidrug+resistant+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(styrene-alt-maleic anhydride)-based diblock copolymer micelles exhibit versatile hydrophobic drug loading, drug-dependent release, and internalization by multidrug resistant ovarian cancer cells.</a> Biomacromolecules. 15 (7), 2629-2641 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture-Targeted+Delivery+of+%CE%B2-Catenin+Agonists+via+Peptide-Functionalized+Nanoparticles+Augments+Fracture+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Fracture-Targeted Delivery of β-Catenin Agonists via Peptide-Functionalized Nanoparticles Augments Fracture Healing.</a> ACS Nano. 11 (9), 9445-9458 (2017).</li>
<li>Baranello, M. P., Bauer, L., Jordan, C. T., Benoit, D. S. W. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12195-015-0391-x">Micelle Delivery of Parthenolide to Acute Myeloid Leukemia Cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 455-470 (2015).</li>
<li>Kuriki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannulation+of+the+Mouse+Submandibular+Salivary+Gland+via+the+Wharton%27s+Duct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e3074(2011).</li>
<li>Nair, R. P., Zheng, C., Sunavala-Dossabhoy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroductal+Submandibular+Gland+Instillation+and+Localized+Fractionated+Irradiation+in+a+Rat+Model+of+Salivary+Hypofunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li>
<li>Wang, Y., Malcolm, D. W., Benoit, D. S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+and+sustained+delivery+of+siRNA%2FNPs+from+hydrogels+expedites+bone+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled and sustained delivery of siRNA/NPs from hydrogels expedites bone fracture healing.</a> Biomaterials. 139 (Supplement C), 127-138 (2017).</li>
<li>Hoffman, M. D., Van Hove, A. H., Benoit, D. S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradable+hydrogels+for+spatiotemporal+control+of+mesenchymal+stem+cells+localized+at+decellularized+bone+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Degradable hydrogels for spatiotemporal control of mesenchymal stem cells localized at decellularized bone allografts.</a> Acta Biomaterialia. 10 (8), 3431-3441 (2014).</li>
<li>Nguyen, C. Q., Yin, H., Lee, B. H., Chiorini, J. A., Peck, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL17%3A+potential+therapeutic+target+in+Sjogren%27s+syndrome+using+adenovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">IL17: potential therapeutic target in Sjogren's syndrome using adenovirus-mediated gene transfer.</a> Laboratory Investigation. 91 (1), 54-62 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

逆行导管注射对于唾液腺的局部药物递送至关重要。该技术可用于干燥综合征和放射性涎腺炎等疾病的治疗药物筛选9,10,28。通过逆行导管注射将药物直接递送至下颌下腺，相较于全身给药具有显著优势，有望减少脱靶效应，包括免疫系统激活11。在避免药物于周围组织蓄积的同时，实现局部药物递送的最大化，还可使治疗药物在更宽的剂量范围内进行测试，而这是全身给药难以达到的。
本文提供了一种详细且经过更新的方法，用于通过华通氏管将聚合物纳米材料递送至小鼠下颌下腺，并包含故障排除和质量控制步骤20。例如，正确使用导丝有助于导管的准确定位。此外，在注射过程中采用干燥吸水固定导管，而非使用氰基丙烯酸酯类胶水，可最大限度地降低黏膜损伤的风险。该方法可用于向小鼠递送多种化合物，并可在同一小鼠身上进行多次给药操作，以评估重复给药的时间进程...

唾液腺功能障碍有多种病因，包括舍格伦综合征（一种由自身免疫介导的功能性分泌组织丧失）和放射性唾液减少症（RIH），后者是头颈部肿瘤放疗后常见的后遗症1唾液功能的丧失会使个体易患口腔和全身感染、龋齿、消化和吞咽功能障碍、言语障碍以及重度抑郁症。1,2,3因此，患者生活质量显著下降，且目前的干预措施仅限于缓解症状，而非治愈疾病4. 为了研究新的治疗方法 体内因此，将生物活性化合物直接施用于唾液腺具有重要意义。
逆行导管注射是一种将生物活性化合物直接递送至唾液腺并评估其在疾病、损伤或正常组织稳态条件下功效的重要方法。三大唾液腺分别为腮腺（PG）、下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG），均通过排泄导管将分泌物排入口腔。小鼠下颌下腺的解剖结构允许通过舌下口腔底部的Wharton导管进行直接插管5。插管完成后，可将溶解的药物直接注入下颌下腺。逆行导管递送后，腺体周围的组织包膜限制了药物向腺体外的扩散，该包膜可调控与周围结构之间的物质交换6。人类下颌下腺及其导管结构与小鼠相似，在下颌下腺手术和唾液腺内镜检查中通常需要对其进行操作7。在人类和小鼠中，腮腺亦可通过颊黏膜上的Stensen导管进行通路获取8。
在辐射诱导的涎腺损伤（RIH）小鼠模型中，经导管逆行注射（SMG retroductal injection）已被用于递送多种治疗剂，包括生长因子、原代细胞、腺病毒载体、细胞因子以及抗氧化化合物，以调控细胞对损伤的反应，并减轻继发性组织损伤5,9,10,11,12,13,14,15,16。逆行导管注射在临床上最显著的成功案例是：在头颈部癌症患者接受放疗后，通过该方法递送腺病毒载体，以定向表达水通道蛋白（Aquaporin 1；AQP1）17。
此前，我们已开发出一种经逆行导管注射的聚合物纳米颗粒-siRNA 系统，并证实其可有效保护唾液腺功能免受放射性损伤11,18,19,20。作为前期工作的延伸，本文中我们展示了利用可负载并递送原本难溶性药物的荧光标记纳米颗粒（NP）进行逆行导管下颌下腺（SMG）注射的实验方案21,22,23。
我们通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合方法合成了由苯乙烯-马来酸酐共聚物-嵌段-聚苯乙烯（PSMA）组成的两亲性嵌段共聚物纳米颗粒（NP），具体方法如前所述21。通过溶剂交换，这些聚合物可自发组装成具有疏水内核和亲水外壳的胶束型纳米颗粒结构21。纳米颗粒被标记了Texas-Red荧光染料，以便在不处死动物的情况下验证其向腺体的递送情况。活体动物成像及颌下腺免疫组织化学结果展示了注射后1小时和1天的情况。
这一经过改进且可重复的插管方案应能使其他研究者成功实现逆行导管注射。我们预计，这一优化的技术将在未来成为 体内 研究与治疗开发24,25.

<table><tbody><tr><td>盐酸毛果芸香碱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>Pilocarpine</td></tr><tr><td>学生用Vannas弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-9</td><td>气管切开用弹簧剪</td></tr><tr><td>无菌生理盐水溶液</td><td>Medline</td><td>RDI30296H</td><td>生理盐水</td></tr><tr><td>Dumont #7 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>弯头镊子</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>直头镊子</td></tr><tr><td>标准型镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>钝头镊子</td></tr><tr><td>精细钨碳合金剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>解剖剪刀</td></tr><tr><td>微量血细胞比容肝素化毛细管</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362566</td><td>毛细管</td></tr><tr><td>润滑性眼膏</td><td>Refresh</td><td>N/A</td><td>Refresh Lacri-Lube</td></tr><tr><td>山羊多克隆抗Nkcc1抗体</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 抗体</td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>ver6.0</td><td>统计分析软件</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>眼膏涂抹用棉签</td></tr><tr><td>0.5cc 胰岛素注射器，29G x 1/2&quot;</td><td>BD</td><td>7629</td><td>腹腔注射用注射器</td></tr></tbody></table>

逆行导管纳米颗粒注射至小鼠下颌下腺

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

唾液腺治疗的两个常见目标是预防和治愈自身免疫性或放射性损伤后出现的组织功能障碍。通过将生物活性化合物局部递送至唾液腺，可安全地实现比全身给药更高的组织药物浓度。此外，还可显著减少因腺体外组织蓄积所导致的脱靶效应。在这一背景下，逆行导管注射是一种广泛用于研究唾液腺生物学及病理生理学的方法。已有研究表明，通过逆行导管途径递送生长因子、原代细胞、腺病毒载体以及小分子药物，可在损伤情况下支持唾液腺功能。我们先前已证实，通过逆行导管注射纳米颗粒-siRNA策略可在放射损伤后维持唾液腺功能。本文详细描述了一种高效且可重复的经由沃顿管（Wharton's duct）向小鼠下颌下腺递送纳米材料的方法（图1）。我们阐述了如何进入口腔，并概述了插管沃顿管所需的操作步骤，同时在操作过程中通过若干观察指标进行质量控制。

通过逆行导管注射可将纳米颗粒（NPs）递送至小鼠下颌下腺（图1）。在此，我们递送了50 µg标记有Texas Red荧光染料的PSMA纳米颗粒。
正确放置小鼠可便于接触并清晰观察口腔底部（图2A-B）。下颌乳头可辨认为舌下两个肉质突起。在完成插管（图2C）和注射阿托品后，可将注射器导管插入下颌乳头（图2D）。
为便于插管，首先使用导管管路内的金属导丝在下颌下乳头处刺一个小孔（图3A）。完成此步骤后，应将导...

下颌下腺的局部药物递送在理解唾液腺生物学以及开发新型治疗手段方面具有重要意义。本文介绍了一种经过改进且更为详细的经导管逆行注射方案，旨在提高递送的准确性和实验的可重复性。本文所展示的应用为聚合物纳米颗粒的递送。

唾液腺治疗的两个常见目标是预防和治愈由自身免疫或辐射损伤引起的组织功能障碍。通过局部……

本实验的主要目标是将纳米材料直接递送至小鼠下颌下腺。该技术的主要优势在于可实现化合物对下颌下腺的直接递送，同时避免进入全身循环系统。该技术的应用前景包括治疗头颈部恶性肿瘤放疗后引起的唾液腺功能障碍。通常，初次使用该方法的研究人员可能在动物处于镇静状态时难以定位并插管下颌下腺导管。开始此操作时，剪取一段长约三厘米的32号带金属内芯的颅内导管管路，将其末端削成与管体长轴呈约45度的斜面。确认金属内芯比导管管路至少长出一厘米。将导管末端切成斜面可便于导管插入导管。如果导管在操作过程中发生弯曲，应重新切割出新的斜面。接下来，用 Hamilton 注射器吸取 50 µL 的 PSMA 纳米颗粒溶液或其他注射材料。为降低注射过程中对导管造成损伤的风险，将导管管路连接至注射器并排出死体积。检查注射溶液，确保纳米颗粒完全溶解，以防止导管阻塞。然后配制浓度为 0.1 毫克/毫升的阿托品溶液。为了观察导管入口点，将一只已麻醉的小鼠俯卧于定制的固定台上。随后在小鼠眼睛上涂抹眼膏，以防止手术过程中眼睛干燥。接着，将上颌门齿固定在金属横梁上，并使用弹性绷带在下颌门齿后方施加向下的张力。将小鼠置于解剖显微镜下，以观察下颌底部。使用定制的弯曲钢制拉钩向两侧颊黏膜施加张力，以扩大口腔开口。为观察下颌下乳头，用钝头镊子夹住舌头并轻轻从口腔底部提起。在舌与颊黏膜之间放置一小块棉球，以便进一步操作口腔内区域。进行导管插管和导管置入时，用带有金属内芯的导管管路进行夹持。为在插管过程中获得最佳的手动控制效果，应将管路与镊子的弯曲弧度保持一致。使用解剖显微镜，将镊子和导丝移入视野中。利用导丝插入物，轻轻对一侧下颌下乳头基部施加压力，造成浅表黏膜穿刺，以利于后续导管管路的进入。若遇到阻力，使用锋利的解剖剪为管路和导丝插入物剪出新的斜面尖端。穿刺后，拔出针芯，然后在解剖显微镜下观察，确认穿刺部位有唾液渗出。随后，将针芯进一步从导管内回撤。避免用力或突然移动针芯，以防引起出血或损伤导管完整性。为确保注射导管能够插入沃顿管开口，将带有金属导丝作为刚性引导的导管插入先前制作的穿刺口。为防止因导管长时间阻塞而产生反向压力，请撤出导管。在显微镜下确认下颌下乳头处可见开口。若出现可见出血，需取出导丝，并在对侧下颌下乳头重新尝试操作。接着，在不移动小鼠的情况下，腹腔注射每公斤体重一毫克的阿托品溶液，以减少操作过程中的体位抬高。然后，等待五到十分钟。在解剖显微镜下，将注射器导管插入开口处。若遇到阻力，需在导管上剪出一个新的斜面端口，并重新尝试插入。一旦导管进入下颌下乳头管，缓慢向前推进三至五毫米。然后，松开镊子夹持的导管。为加强导管与下颌下乳头之间的密封性，用纱布轻轻按压界面处约一分钟以吸干水分。检查确认在干燥过程中导管位置未发生移动。在此操作中，以每分钟10 µL的速率注射材料。确保小鼠保持镇静状态，且无痛苦迹象。注射后，维持注射器压力5分钟，以提高材料在下颌下腺导管（Wharton's duct）及下颌下腺内的滞留效果。定期检查下颌下乳头，确保导管未从导管开口脱出。保持注射压力将提高逆行导管递送的效果。使用精细镊子，夹住导管并轻柔地从下颌下乳头处撤出。在将小鼠移离操作台之前，先从口腔中移除牵开器和棉球。为验证纳米颗粒的递送效果，活体成像系统显示，注射后一小时，小鼠接受治疗的一侧出现红色荧光信号的侧向分布。此图像表明，注射24小时后，纳米颗粒信号已显著减弱。为确认注射后24小时纳米颗粒在下颌下腺中的存留情况，对腺体进行切片并采用荧光成像观察。图中显示的是未注射的对照组下颌下腺，经水通道蛋白5和角蛋白5染色，分别标记分泌性腺泡和导管细胞。在经导管逆行注射纳米颗粒的下颌下腺中，水通道蛋白5和角蛋白5染色显示腺体形态正常，且纳米颗粒被腺泡和导管细胞均摄取。一旦掌握，若操作得当，该技术可在20分钟内完成。在进行此操作时，重要的是要避免任何可能移位导管或破坏导管与下颌下乳头之间密封的多余动作。操作完成后，可进一步采用免疫染色、RNA提取或流式细胞术等其他方法，以评估下颌下腺中的基因表达或纳米材料的定位。该技术建立后，为唾液腺研究人员筛选和测试用于预防口干症的化合物提供了新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过导管插入沃顿管，将纳米材料直接递送至小鼠下颌下腺的方法。

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Research

科研

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Bioengineering

生物工程

Retroductal 纳米微粒注射液对小鼠颌下腺的治疗

本文描述了一种通过沃顿氏管（Wharton's...

通过沃顿管插管小鼠下颌下唾液腺

本视频介绍了一种导管内注射技术，通过该技术将注射混合物递送至小鼠乳腺的导管中。...

导管内注射：将注射混合物递送至小鼠乳腺导管

该视频演示了一种超声引导下的注射技术，用于将治疗性药物注入人类患者的唾液腺中。...

超声引导下向人体唾液腺注射治疗药物

本文介绍了一种非侵入性地向小鼠乳腺导管递送水溶性试剂的实验方案。该方法通过将试剂局部注射至乳腺乳头，特异性地靶向乳腺导管。此技术可适用于多种化合物，包括siRNA、化疗药物和小分子化合物。...

乳腺导管内注射实现药物对小鼠乳腺的局部递送

淋巴结是协调免疫反应的免疫组织，也是疫苗的关键靶点。生物材料已被用于更有效地靶向淋巴结，并控制抗原或佐剂的递送。本文介绍了一种结合上述理念的技术，即将生物相容性聚合物颗粒注射至淋巴结中。...

淋巴结内注射可生物降解聚合物颗粒

唾液腺功能低下是头颈部放疗的主要不良反应，会降低患者的生活质量。在临床转化之前，必须先在动物模型中验证新疗法的有效性。本方案描述了大鼠下颌下腺的逆行导管给药和局部照射方法。...

下颌下腺逆行灌注与局部分次照射在唾液功能低下大鼠模型中的应用

我们描述了一种手术暴露并稳定小鼠下颌下唾液腺以进行活体成像的方案，该方案采用直立式活体显微镜技术。此方案可轻松适用于小鼠及其他小型啮齿类动物头颈部其他外分泌腺的活体成像研究。...

小鼠下颌下唾液腺直立试活体显微镜观察标本制备

唾液腺已被提议作为基因治疗的组织靶向部位，尤其是在基因转移疫苗接种领域。我们利用逆行腮腺输注在非人灵长类动物模型中展示了基因递送。...

通过腮腺管逆行灌注非人灵长类动物腮腺以实现载体介导的基因递送

在本实验方案中，通过向测试动物模型的面静脉注射不同分子量的荧光示踪剂，评估下颌下腺（SMG）的内皮屏障功能。 体内...

体内 小鼠下颌下腺血管通透性检测

免疫荧光成像受限于仅能通过单一时相的静态图像来观察复杂且具有时间依赖性的生物学过程。本研究介绍了一种在精密切割的小鼠下颌下腺组织切片上进行的活体成像方法。该方法可实现实时观察稳态期间的细胞间相互作用，以及再生与修复过程。...

探究唾液腺中的细胞间相互作用 通过离体实验 活细胞成像

本文描述了在动物模型中将携带RNA寡核苷酸的磁性氧化铁纳米颗粒递送至转移性乳腺癌的体内给药方案，为癌性核酸的治疗性沉默提供了一种具有临床可行性的方法。...

监测纳米药物在小鼠乳腺癌转移灶中的蓄积

了解通过逆行导管注射将聚合物纳米颗粒直接递送至小鼠颌下腺的局部给药技术。该方法绕过全身循环，为研究唾液腺生物学和开发辐射诱导唾液腺功能障碍的新疗法提供了可重复的实验方案。

逆行导管纳米颗粒注射至小鼠下颌下腺

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