Name: 小鼠涎腺照射后通过匹属刺激进行唾液功能评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 了解通过匹罗卡品刺激评估小鼠唾液功能的方法，用于研究唾液腺功能障碍及干预措施。该方案包括小鼠气管切开术、唾液收集和腺体解剖技术，为口腔健康研究提供模块化平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究工作得到了美国国立牙科与颅面研究所（NIDCR）和美国国立卫生研究院国家癌症研究所（NCI）的资助，项目编号为 R56 DE025098、UG3 DE027695 和 F30 CA206296。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。本研究还得到了美国国家科学基金会（NSF）DMR 1206219 项目以及国际牙科研究协会（IADR）口腔护理创新奖（2016 年）的支持。
我们感谢 Eri Maruyama 博士和 Andrew Hollomon 在唾液采集方面的帮助。我们感谢 Pei-Lun Weng 在腺体解剖方面的协助。我们感谢 Matthew Ingalls 在图片准备方面的帮助。我们感谢 Elaine Smolock 博士和 Emily Wu 对本手稿的审阅。

以下所述的所有体内操作均经罗切斯特大学罗切斯特动物资源大学委员会批准。
1. 准备
<ol>
	<li>使用分析天平称取 20 mg 毛果芸香碱。将其溶解于微量离心管中的 2 mL 无菌生理盐水中。 
	注意：由于毛果芸香碱对光敏感且会随时间失去活性，该溶液应在注射当天配制，并在给药前避光保存。</li>
	<li>使用分析天平称重并标记所有收集管和玻璃毛细管。收集管和玻璃毛细管的数量应与小鼠数量一致&#160;。</li>
</ol>
2. 气管切开术
<ol>
	<li>使用分析天平称量 C57/BL6 小鼠的体重。</li>
	<li>使用带有 29G × ½" 针头的 0.5 mL 注射器，通过腹腔注射无菌生理盐水溶液，其中包含每公斤体重 100 mg 的氯胺酮和每公斤体重 10 mg 的赛拉嗪，对小鼠进行麻醉。当小鼠对刺激不再产生反应时（即i.e.&#160;足底回缩反射&#160;消失），通常在注射后 5 至 10 分钟内发生，即可进行下一步操作。</li>
	<li>将润滑剂涂抹于棉签上后，轻轻涂抹于小鼠眼部，并将小鼠仰卧固定于操作台上。&#160;麻醉后的小鼠必须始终置于温暖的表面上。 
	注意：所有步骤均在室温下进行。</li>
	<li>使用手术胶带将小鼠的鼻部、四肢和尾部固定在操作台上。</li>
	<li>用酒精棉片清洁并润湿颈部。 
	注意：此步骤有助于防止毛发进入后续切口。</li>
	<li>用镊子提起腹侧中线部位的颈部皮肤，使用解剖剪进行一个小的浅表切口。将剪刀插入切口，并在皮下缓慢张开刀片，以分离组织层面。</li>
	<li>保持皮肤抬起状态，小心地向嘴下方剪开约 1 cm。</li>
	<li>在初次切口的上下两端各做一个横向切口。用镊子轻轻将皮肤向两侧翻折，以暴露头颈部结构。</li>
	<li>在 8 倍解剖显微镜下观察下颌下腺（中线位置：图 1）。</li>
	<li>使用精细镊子轻轻提起腺体，以暴露覆盖在气管上方的四块肩胛舌骨肌（带状肌）。操作时应避免撕裂或损伤周围血管或排泄导管。</li>
	<li>若需从多只小鼠采集唾液，应在继续下一步前对每只小鼠重复步骤 2.1 至 2.10。 
	注意：本操作可同时安全地用于最多 5 只小鼠。</li>
	<li>使用小型解剖剪，尽可能靠近中线切除带状肌的内侧部分。仅切除必要量的组织以暴露气管，并在操作过程中将带状肌移开。应避免划伤任何邻近血管，因为若因明显出血导致血容量减少，匹鲁卡品将无法有效诱导分泌。</li>
	<li>将带状肌从气管表面轻轻翻折移开。</li>
	<li>观察喉部、气管和甲状腺。确保气管表面无组织覆盖。</li>
	<li>使用小型解剖剪，在甲状腺下方/后方的气管处做一水平切口。确保气道通畅且无液体阻塞。</li>
</ol>
3. 唾液采集
<ol>
	<li>移除靠近口腔的胶带，并将解剖台向下倾斜（45°，头侧朝下），以促进唾液流出。</li>
	<li>使用带有29G × ½"针头的0.5 mL注射器，按10 µL/g体重剂量进行腹腔注射匹罗卡品，总剂量为100 mg/kg。</li>
	<li>启动计时器。若需对多只小鼠给药，应迅速操作，并可由助手同时为其余小鼠注射，以减少等待时间。</li>
	<li>使用标准镊子打开口腔，以便毛细管进入。</li>
	<li>当观察到口腔内出现唾液液滴时，将毛细管的近端插入液体中，远端放入位于解剖台下方的收集管中（两管均预先称重）。 
	注：在6至10周龄的C57/BL6雌性小鼠中，注射匹罗卡品后约2分钟内即可出现明显唾液分泌。</li>
	<li>若唾液在口腔内积聚但未通过毛细管流动，请重复上一步操作。确保毛细管未直接贴靠黏膜表面，以免堵塞进液口。</li>
	<li>自匹罗卡品刺激开始后，持续收集唾液共12分钟。确保造口保持通畅。 
	注：此期间潮气量增加以及分泌物（唾液、尿液、粪便）增多属于正常现象。</li>
	<li>若小鼠唾液分泌功能低下（e.g.，因损伤或干预所致），可使用P200移液器将口腔内剩余液体转移至收集管中。若同时收集多只小鼠样本，须确保每次更换吸头。</li>
	<li>在注射匹罗卡品12分钟后，记录收集到的唾液与收集管的总重量。</li>
</ol>
4. 腺体解剖
<ol>
	<li>采用 CO2 窒息法处死小鼠&#160;（参照《美国兽医协会动物安乐死指南：2013年版》），随后进行胸廓切开术，注意保护头颈部结构。因此，避免使用颈椎脱位作为安乐死方法。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于操作台上。将腺体复位于气管上方的原始位置（图1）。</li>
	<li>在解剖显微镜下以8倍放大倍数观察主要腺体：腮腺（PG）、下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG）。为在解剖过程中区分各腺体，需注意腮腺（PG）呈弥散状，位于下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG）的外侧。 
	注意：若需解剖腮腺（PG），应优先进行，因其边界最不清晰且最容易撕裂。</li>
	<li>用镊子夹住腮腺（PG）尾部，将其从下方结构轻轻牵拉，并施加轻柔张力，随后用解剖剪剪断腮腺（PG）头部。</li>
	<li>用镊子刺破包绕下颌下腺（SMG）的被膜，轻柔分离左侧与右侧下颌下腺（SMG）。</li>
	<li>用镊子将下颌下腺（SMG）背侧从附着的非腺体组织中游离出来。</li>
	<li>用镊子拉紧沃顿氏管（Wharton's duct），同时用解剖剪剪断导管，从而将下颌下腺（SMG）从颈部取出。</li>
	<li>用镊子轻柔地将舌下腺（SLG）从下颌下腺（SMG）分离。 
	注意：舌下腺（SLG）位于下颌下腺（SMG）的上外侧区域。</li>
	<li>使用分析天平记录下颌下腺（SMG）的重量。</li>
</ol>

<ol><li>Bradley, P., O'Hara, J. <a target="_blank" href="http://www.surgeryjournal.co.uk/article/S0263-9319(15)00194-5/pdf">Diseases of the salivary glands.</a> Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).</li>
<li>Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+enhancement+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Caries+Research%22%5BJournal%5D)">Salivary enhancement therapies.</a> Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).</li>
<li>Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+salivary+gland+radiosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of salivary gland radiosensitivity.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).</li>
<li>Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parotid+and+submandibular%2Fsublingual+salivary+flow+during+high+dose+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).</li>
<li>Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+homeostasis+is+maintained+through+acinar+cell+self-duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication.</a> Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).</li>
<li>Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+Glands%3A+Stem+Cells%2C+Self-duplication%2C+or+Both%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both?</a> Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).</li>
<li>Ono, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+effects+of+cevimeline+and+pilocarpine+on+salivary+mechanisms%2C+cardiovascular+response+and+thirst+sensation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats.</a> Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).</li>
<li>Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+salivary+gland+function+by+autonomic+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Auton+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of salivary gland function by autonomic nerves.</a> Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).</li>
<li>Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+agonistic+effects+of+pilocarpine+on+Ca%282%2B%29+responses+and+salivary+secretion+in+the+submandibular+glands+of+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals.</a> Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).</li>
<li>Urita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebamipide+and+mosapride+enhance+pilocarpine-induced+salivation%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation.</a> North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).</li>
<li>Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-mediated+gene+silencing+confers+radioprotection+to+salivary+glands+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo.</a> Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).</li>
<li>Kondo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+in+the+acinar+cells+of+the+murine+major+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands.</a> Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).</li>
<li>Evans, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+impairment+of+salivation+in+Na%2B%2FK%2B%2F2Cl-+cotransporter+%28NKCC1%29-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).</li>
<li>Delanian, S., Lefaix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radiation-induced+fibroatrophic+process%3A+therapeutic+perspective+via+the+antioxidant+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway.</a> Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).</li>
<li>Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+xerostomia%3A+pathophysiology%2C+clinical+course+and+supportive+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Support+Care+Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment.</a> Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).</li>
<li>Lin, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+short-term+%CE%B3-irradiation+effects+on+mouse+salivary+gland+function+using+a+new+saliva+collection+device%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device.</a> Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).</li>
<li>Montenegro, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+differences+between+humans+and+rodents+in+the+ability+to+concentrate+salivary+nitrate%3A+Implications+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+biology%22%5BJournal%5D)">Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research.</a> Redox biology. 10, 206-210 (2016).</li>
<li>Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+and+Functional+Changes+of+Salivary+Gland+Dysfunction+After+Radioactive+Iodine+Ablation+in+a+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Thyroid%22%5BJournal%5D)">Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model.</a> Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).</li>
<li>Imamura, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pilocarpine-induced+saliva+secretion+by+adrenergic+agonists+in+ICR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).</li>
<li>Ma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Secretion+of+Saliva+in+Transgenic+Mice+Lacking+Aquaporin-5+Water+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).</li>
<li>Parkes, M. W., Parks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supersensitivity+of+salivation+in+response+to+pilocarpine+after+withdrawal+of+chronically+administered+hyoscine+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).</li>
<li>Nishiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-Regulated+PAR-2-Mediated+Salivary+Secretion+in+Mice+Deficient+in+Muscarinic+Acetylcholine+Receptor+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516(2007).</li>
<li>Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+analysis+of+aquaporin-8+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).</li>
<li>Kamiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Ray-Induced+Damage+to+the+Submandibular+Salivary+Glands+in+Mice%3A+An+Analysis+of+Strain-Specific+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses.</a> BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).</li>
<li>Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+and+Comparison+of+Salivary+Calcium%2C+Phosphorous%2C+Alkaline+Phosphatase+and+pH+Levels+in+Periodontal+Health+and+Disease%3A+A+Cross-sectional+Biochemical+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Diagnostic+Research%22%5BJournal%5D)">Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).</li>
<li>Droebner, K., Sandner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+salivary+secretion+assay+in+F508del+mice--the+murine+equivalent+of+the+human+sweat+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Modification of the salivary secretion assay in F508del mice--the murine equivalent of the human sweat test.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).</li>
<li>Lamy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+mouse+whole+saliva+soluble+proteome+induced+by+tannin-enriched+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Science%22%5BJournal%5D)">Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet.</a> Proteome Science. 8 (1), 65(2010).</li>
<li>Mahomed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+mucin+immunohistochemistry+in+salivary+gland+tumors+and+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).</li>
<li>Kohlgraf, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+SPLUNC1+in+saliva+with+an+xMAP+particle-based+antibody+capture+and+detection+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay.</a> Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).</li>
<li>Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+ex+vivo+expansion+and+post-irradiation+regenerative+potential+of+juvenile+and+aged+salivary+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2015).</li>
<li>Lombaert, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+salivary+gland+function+after+stem+cell+transplantation+in+irradiated+glands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands.</a> PLoS One. 3 (4), e2063(2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们提出一种多步骤方法来评估唾液腺功能，可用于研究腺体损伤及治疗手段。该方法包括气管造口术、唾液采集和腺体解剖，每一项操作均有其特定的实验应用，可支持对唾液腺生物学进行综合研究。例如，小鼠气管造口术已被用于在阻塞口腔的操作过程中进行常规气道管理。
为了实现100 mg/kg剂量毛果芸香碱刺激下的唾液分泌，需要进行正确的解剖和气管切开。 alternatively，降低毛果芸香碱的剂量可避免气管造口术的需要，因此可用于唾液分泌的纵向评估16。
除了记录唾液分泌外，本方案还提供了一种准确且一致的方法来收集唾液，以用于其他分析。此类研究包括流变学、蛋白质组学、酶活性、唾液渗透压25,26,27以及生物标志物的发现28,<sup cl...

唾液腺疾病包括分泌调节异常或功能受损所导致的综合征，从而引起唾液分泌过多（流涎症）或分泌不足（口干症和低分泌症）1。在这两种情况下，人们都希望进一步深入了解唾液腺生物学，以最终推动治疗策略的开发2。
唾液腺是高度放射敏感的器官，在头颈部肿瘤放射治疗过程中常受到损伤，导致永久性口干（xerostomia）3,4。然而，与其他放射敏感组织不同，唾液腺的细胞更新速率相对较低，其分泌功能丧失的机制尚不明确5,6。在这种特殊的损伤情况下，组织再生和放射防护策略需要对唾液功能进行评估。在实验上，小鼠唾液采集是评估唾液腺对辐射及治疗药物反应的重要工具。
本文介绍了一种利用强效毒蕈碱受体激动剂匹鲁卡品（pilocarpine）刺激并定量唾液分泌的方法7。匹鲁卡品可通过刺激自主神经系统诱导腺体分泌8,9。为正确完成该检测，需进行气管切开术，以确保小鼠在实验过程中保持气道通畅，并降低因口腔内积聚分泌物导致的窒息和吸入性风险10。
这是一个终末性操作，最终切除三大唾液腺：腮腺（PG）、下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG）。在功能研究中，需记录腺体重量，通常用于标准化唾液量的测定11,12,13。该数据在放射研究中尤为重要，因为腺体萎缩是预期的结果之一14,15
关于刺激性唾液分泌的实验操作和报告方式，文献中存在较大差异16。例如，文献中毛果芸香碱（pilocarpine）的使用剂量跨度至少达到三个数量级17,18,19,20,21,22,23。本文介绍一种经过优化的高剂量毛果芸香碱实验方案，旨在提高方法执行的可重复性，同时提供一个模块化的技术平台（包括气管切开术、唾液采集和腺体解剖），可根据需要进行调整应用。
除了实验方案的演示外，我们还提供了在对下颌下腺区域进行分次辐射（4次，每次6.85 Gy）后2周时唾液流量的代表性功能数据。

<table><tbody><tr><td>盐酸毛果芸香碱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>毛果芸香碱</td></tr><tr><td>学生用范纳斯弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-9</td><td>气管切开用弹簧剪</td></tr><tr><td>无菌生理盐水溶液</td><td>Medline</td><td>RDI30296H</td><td>生理盐水</td></tr><tr><td>Dumont #7 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>弯头镊子</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>直头镊子</td></tr><tr><td>标准型镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>钝头镊子</td></tr><tr><td>精细钨碳合金剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>解剖剪刀</td></tr><tr><td>微量血细胞比容肝素化毛细管</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362566</td><td>毛细管</td></tr><tr><td>润滑性眼膏</td><td>Refresh</td><td>N/A</td><td>Refresh Lacri-Lube</td></tr><tr><td>山羊多克隆抗 Nkcc1 抗体</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 抗体</td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>ver6.0</td><td>统计分析软件</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>眼膏涂抹用棉签</td></tr><tr><td>0.5 cc 胰岛素注射器，29G × 1/2&quot;</td><td>BD</td><td>7629</td><td>腹腔注射用注射器</td></tr></tbody></table>

通过分次放射治疗后匹鲁卡品刺激进行小鼠唾液功能评估

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

口干症常在干燥综合征的自身免疫反应中或在主要唾液腺受到放射性损伤后出现。在这些情况下，关于疾病发病机制和有效干预措施的问题仍然存在。一种能够对唾液腺功能进行评估的优化技术，对于研究外分泌腺的生物学、功能障碍及治疗手段具有重要价值。本文介绍了一种逐步实施匹鲁卡品刺激唾液分泌的方法，包括气管切开术以及三种主要小鼠唾液腺的解剖步骤。我们还详细描述了在这些操作过程中所涉及的小鼠头颈部的正确解剖结构。该方法具有可扩展性，可同时处理多只小鼠，从而提高实验流程的效率。我们的目标是提高这些方法的可重复性，而每种方法在该领域内均有进一步的应用价值。除了唾液采集外，我们还讨论了用于量化和标准化这些组织功能能力的评估指标。文中提供了代表性数据，来自接受分次放射治疗（4次，每次6.85 Gy）后2周唾液腺功能受抑的下颌下腺。

进行高剂量匹鲁卡品刺激唾液采集时，必须保持气道通畅，以防止口腔分泌物引起误吸或窒息。此处提供了气管造口术的示意图（图1）气管切开后，须保持造口无组织和液体阻塞。
为增强采集唾液时的毛细作用，应将小鼠头部朝下放置 45° 角度。这些步骤可以在 &gt;1只小鼠，尽管不建议一次超过5只小鼠（图2收集完成后，建议迅速称量试管，以避免蒸发损失。
采集唾液后，对小鼠实施安乐死。不应采用颈椎脱位法，因其可能损伤头颈部结构。将小鼠放回解剖台，腺体应复位至气管上方的原始位置。由于位置和组织疏松的特点，应首先开始剥离咽旁腺（PG）（图3）。下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG...

我们介绍了一种详细的唾液采集方法，包括小鼠气管造口术以及三大唾液腺的分离。

唾液分泌减少常在干燥综合征的自身免疫反应中或在主要唾液腺受到放射性损伤后出现。在……

本实验的总体目标是通过匹鲁卡品刺激来评估小鼠的唾液分泌功能。该方法可用于研究唾液腺功能障碍的自然发展过程，也可用于评估任何潜在干预措施的有效性。我们的实验方案提供了一个模块化的技术平台，包括小鼠气管切开术、唾液采集以及腺体解剖。在临床上，该技术可用于评估口干或唾液分泌过多的研究，也可应用于其他需要气道管理的口腔内操作。初次学习本方案者可能会发现气管造口和腺体解剖步骤具有挑战性。我们希望本视频能帮助您学习正确的腺体分离技术以及相关解剖学知识。使用分析天平称取20毫克匹鲁卡品，然后将其溶解于2毫升无菌生理盐水中。匹鲁卡品溶液必须在使用当天新鲜配制。接下来，称量该实验所需的所有收集容器，并称量小鼠以准确计算给药剂量。使用 C57 black 6 品系。麻醉小鼠后，通过脚趾夹捏法确认麻醉效果，使用棉签涂抹眼药膏，并将小鼠置于仰卧位。然后，用手术胶带固定其四肢、鼻子和尾巴。接着，使用酒精棉片清洁并润湿颈部。现在，用镊子夹住颈部腹侧中线位置，并用剪刀做一个小的浅表切口。然后，将剪刀插入切口，于皮下缓慢张开剪刀刃以分离组织层面。在保持皮肤抬起的同时，于口部下方一厘米处小心地进行第二次切割。接着，在第一次切口的下方和上方各做两个侧向切口。现在，使用镊子轻轻分开皮肤，以暴露头颈部的解剖结构。在八倍放大倍率的解剖显微镜下继续操作。使用精细镊子轻轻提起下颌下腺，以暴露覆盖在气管上方的四块肩胛舌骨肌。避免撕裂或损伤周围的血管或排泄管。若需从多只小鼠收集唾液，应先将所有小鼠处理至该步骤，再继续后续操作。一人可同时操作最多五只小鼠。现在，继续手术操作，使用小型解剖剪沿中线附近切除带状肌的内侧部分。切除足够暴露气管并防止肌肉干扰手术操作的肌肉量即可。在解剖带状肌时，尤其需要注意避免划伤附近的血管。切口可能导致因出血引起的血容量减少，从而使毛果芸香碱在诱导唾液分泌时失效。操作时，将胸骨舌骨肌等带状肌从气管处向外侧牵开，以暴露喉部、气管和甲状腺。确保气管表面无组织覆盖，保持清晰可见。最后，使用小型解剖剪刀在甲状腺下方的气管处做一横向切口，切勿使用解剖刀。务必确保该气道通畅且无液体阻塞。进行唾液采集时，首先移除口腔附近的胶带，然后将解剖台倾斜至45度角，以引导唾液向头侧流动。接下来，使用带有29号半英寸针头的0.5毫升注射器进行腹腔注射毛果芸香碱。然后启动计时器。若需对多只小鼠进行注射，应在助手协助下迅速操作。接下来，使用标准镊子打开口腔，并将毛细管放置到位。几分钟内应有唾液珠形成。将毛细管的一端插入唾液中，另一端放入位于解剖台下方的收集管中。根据需要，调整试管位置以吸取唾液。避免接触黏膜组织，因为黏液可能堵塞入口。从注射开始计时，收集唾液持续 12 分钟。整个过程中，应保持造口清晰通畅。若小鼠唾液分泌功能低下，使用P200微量移液器将口腔内的液体转移至收集管中。每只小鼠必须使用不同的收集管或移液器吸头。完成所有采集后，重新称量采集容器。通过二氧化碳窒息法处死小鼠后，小心地进行胸廓切开术，并将小鼠仰卧放置于解剖显微镜载物台上。然后，将腺体重新放置于原始手术部位。在八倍放大倍数下，观察主要腺体，即腮腺（PG）、下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG）。腮腺（PG）呈弥散状，位于下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG）的外侧。应首先解剖腮腺（PG）。用镊子夹住PG的尾部，将其从下方结构中轻轻拉出。施加轻柔的张力，然后用解剖剪剪下PG的头部。接着，用镊子撕开包围SMG的囊膜。然后，轻轻分离左、右下颌下腺。接着，将下颌下腺的背侧从周围非腺体组织中游离出来。为摘除下颌下腺，用镊子夹紧沃顿管，再用解剖剪剪断导管。舌下腺位于下颌下腺的上外侧。分离两腺体时，用两把镊子分别夹住两个腺体，并将其中一把镊子的一个齿尖置于两腺体之间的组织平面内。随后缓慢施加张力，两个腺体将逐渐分离。分离腺体组织后，立即重新称量收集容器。作为分析的阳性对照，将小鼠下颌下腺进行照射，并与对照组进行比较。在每次6.85 Gy、共四次分割照射后的两周，唾液功能显著下降。总唾液分泌量以及按腺体湿重标准化后的分泌量均显示唾液功能能力下降，表明该检测方法具有敏感性。接下来，分离下颌下腺。这些腺体可进行固定、切片和染色。采用苏木精和伊红染色法比较有无匹罗卡品刺激下的组织大体结构。此外，对组织进行膜钠-钾-氯共转运蛋白NKCC1的免疫染色。无论是否进行匹罗卡品刺激，两种染色结果均显示组织具有相似的细胞形态。观看本视频后，您应能充分掌握通过匹鲁卡品刺激评估小鼠唾液功能的方法。一旦熟练掌握，整个操作可在一小时内完成。该方法可使唾液研究人员收集全唾液以量化腺体功能，并能够干净、可重复地分离出三种主要的唾液腺。在进行此操作时，尤其是处理多只小鼠的情况下，必须迅速操作，并在正确的时间点终止唾液采集。按照本方案，可从全唾液中测定其成分和酶活性，同时可对腺体组织进行处理，用于组织学或免疫染色分析。

murine-salivary-functional-assessment-via-pilocarpine-stimulation

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

小鼠涎腺照射后通过匹属刺激进行唾液功能评估

本文描述了一种通过沃顿氏管（Wharton's...

通过沃顿管插管小鼠下颌下唾液腺

成年哺乳动物新生神经元的功能仍是当前研究的活跃领域。电离辐射可抑制新神经元的生成。利用计算机断层扫描引导的局部照射（CFIR），现可通过三维解剖定位特定的神经前体细胞群，来评估成年神经发生的生物学功能。...

功能性质疑成年下丘脑神经发生：基于局灶性放射学抑制的研究方法

下丘脑, 神经发生, 成年神经发生, 放射抑制, 神经干细胞, 神经前体细胞, 辐照, 焦点性照射, 脑功能成像, 功能分析

唾液腺功能低下是头颈部放疗的主要不良反应，会降低患者的生活质量。在临床转化之前，必须先在动物模型中验证新疗法的有效性。本方案描述了大鼠下颌下腺的逆行导管给药和局部照射方法。...

下颌下腺逆行灌注与局部分次照射在唾液功能低下大鼠模型中的应用

我们描述了一种利用靶向外周照射在小鼠中诱导类似疲劳行为的方法。选定的非致死照射剂量可导致小鼠自主转轮跑动活动减少，持续约一周时间。...

一种由外周照射诱导疲劳的小鼠模型

唾液腺功能低下是自身免疫性疾病和放射治疗常见的后果。在这些疾病的动物模型中，对唾液腺功能进行可重复评估存在技术上的挑战。本文介绍了一种简单、准确且可重复测量小鼠唾液分泌的方法。...

一种小鼠唾液腺功能的检测方法

下颌下腺的局部药物递送在理解唾液腺生物学以及开发新型治疗手段方面具有重要意义。本文介绍了一种经过改进且更为详细的经导管逆行注射方案，旨在提高递送的准确性和实验的可重复性。本文所展示的应用为聚合物纳米颗粒的递送。...

逆行导管纳米颗粒注射至小鼠下颌下腺

利用三维类器官培养技术观察唾液腺的形态和功能标志物，可能为揭示辐射后组织损伤的机制提供新的见解。本文介绍了一种实验方案，用于在暴露于电离辐射前后，对50–90...

下颌下腺和腮腺类器官培养物的辐射处理模型关键再现了体内特征

免疫荧光成像受限于仅能通过单一时相的静态图像来观察复杂且具有时间依赖性的生物学过程。本研究介绍了一种在精密切割的小鼠下颌下腺组织切片上进行的活体成像方法。该方法可实现实时观察稳态期间的细胞间相互作用，以及再生与修复过程。...

探究唾液腺中的细胞间相互作用 通过离体实验 活细胞成像

本文介绍了一种在超声引导下对腺体层或肌肉层进行火针治疗的方案，用于治疗脑卒中后气管切开患者流涎症。...

超声引导下火针针灸治疗气管切开患者流涎症

本文描述了一种针对小鼠前 compartment 肌肉的神经肌肉电刺激（NMES）的啮齿类动物模型，该方法是一种安全且经济的临床手段。该模型的优势在于可对一种 readily available...

一种通过神经肌肉电刺激实现肌肉训练的小鼠模型

了解通过匹罗卡品刺激评估小鼠唾液功能的方法，用于研究唾液腺功能障碍及干预措施。该方案包括小鼠气管切开术、唾液收集和腺体解剖技术，为口腔健康研究提供模块化平台。

通过分次放射治疗后匹鲁卡品刺激进行小鼠唾液功能评估

探索更多视频