一种用于研究的麻醉无特定病原体鸡结扎肠段模型 产气荚膜梭菌 毒力

该方法有助于解答鸡坏死性肠炎研究领域中的关键问题，例如比较引起该疾病的特定产气荚膜梭菌菌株的毒力。该技术的主要优势在于，显著减少了通常进行类似杂食性动物实验所需的鸡只数量。

尽管该方法可用于评估产气荚膜梭菌菌株的毒力潜力，也可应用于其他肠道病原体，如艰难梭菌或肠炎沙门氏菌。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为手术操作需要专门培训，且仅应由在实验前已掌握缝合等外科技术的研究人员进行。对一只10周龄的无特定病原体白来航鸡实施麻醉后，设置生命体征监测设备，并通过轻柔牵拉手动去除腹部羽毛。

接下来，使用洗必泰葡萄糖酸盐溶液和软毛刷擦洗手术部位。从中心向外围轻柔擦洗皮肤五分钟，过程中不得逆向操作。然后，使用无菌纱布，交替用洗必泰葡萄糖酸盐溶液和异丙醇对手术部位进行三次擦拭。

再次从中心向外围进行，然后铺巾。首先打开手术区域上方的铺巾，接着使用3号手术刀在腹部做L形低中线皮肤切口，起始于靠近胸骨1厘米处，终止于泄殖腔前方1厘米处。接下来，从第一个切口的内侧端垂直延伸L形切口，做第二个切口，起始于第一个切口的内侧端，并沿骨盆线向腹腔左侧继续延伸5厘米。

此切口将便于肠道的取出。接下来，采用相同的L形切口打开腹膜和腹肌，以进入腹腔。此时气囊将暴露出来，须用浸有生理盐水的纱布保持湿润。

接下来，沿左侧腹壁将Snook绝育钩插入腹腔，绕过腹部气囊，钩出肠管。然后用干纱布轻轻将肠管进一步外置，以暴露空肠。将肠管铺开，并通过频繁喷洒生理盐水以及覆盖浸有生理盐水的纱布来保持其湿润。

取出肠道时必须非常轻柔，因为过度牵拉可能导致肠系膜血管破裂，进而引起肠道缺血性损伤，严重影响手术结果。将肠道外置后，从空肠开始将肠道制成一系列肠袢。每个肠袢可用于不同的处理。

在近端空肠处，使用聚谷氨酰胺多股合成可吸收材料进行简单的结扎，注意避免结扎主要的肠系膜血管。接着，在距离近端结扎处约2厘米的位置进行远端结扎，以完成第一个肠段的结扎。所有近端与远端结扎之间的间距应约为2厘米。

每对结扎线形成一个环，即一个闭合的肠段。接下来，在各环之间创建一个肠段。在第一个肠环远端结扎线的近侧端上方0.5厘米处放置一个简单的结扎线。

该结扎位于环间中部，可减少环与环之间可能发生的交叉污染。接下来，在环间结扎处近端0.5厘米处继续创建另一个环。此处共形成9个环和8个环间段，覆盖26厘米的肠段。

可根据需要调整环的数量。接下来，将产气荚膜梭菌菌株注入环中。在环的对系膜侧，使用26号针头以45度角注入0.2毫升BHI溶液，其中包含处于对数生长期的100万个菌落形成单位的细菌。

在此情况下，共进行九次注射循环，其中五种不同菌株交替注入，而中间的循环仅注入载体作为阴性对照。注入病原体后，轻轻将肠道复位至气囊下方腹腔的背侧区域，然后闭合腹腔。

使用聚谷氨酸多股合成可吸收材料，沿骨盆以简单的连续缝合方式缝合腹膜和腹肌。接着，从胸骨到耻骨联合，继续用相同的材料和简单的连续缝合方式缝合腹膜和腹肌。随后，使用聚谷氨酸多股合成材料，以简单的连续缝合方式闭合皮肤。

首先，沿骨盆缝合，然后从胸骨缝合至绒毛尿囊膜（cloiche）。关闭切口后，在感染期间应合理使用镇痛药，对鸡实施全身麻醉，以尽量减少动物疼痛。持续进行麻醉监测，以确保麻醉深度足够。

在达到所需的感染时间后（例如本实验中的七小时），处死禽鸟并采集肠道组织。使用3号手术刀切取0.5至1厘米长的肠段，随后将该肠段转移至10%福尔马林溶液中，进行过夜固定，以供进一步的组织病理学分析。

然后，使用同一手术刀刀片在同一环段上切下剩余的组织，并将该组织转移至微量离心管中，用于细菌的分离。每次使用新的手术刀刀片，对每个环段重复此操作。注射后7小时，注入无菌对照培养基的肠段其黏膜刷状缘完整，无坏死现象。

肠段各层出现轻度充血并不少见。接种病原体产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）7小时后，绒毛顶端被侵蚀，并在顶端周围形成坏死性侵入灶。在绒毛周围的坏死物质中，可见成簇的大杆状细菌。

有时坏死是由于操作不当所致，可能被误认为是由细菌引起的病变。一个明显的迹象是在组织学切片中缺乏细菌。此外，肌层中的血管因大量变性红细胞的积聚而显著扩张，提示存在血管充血。

这是由于结扎的肠系膜血管可能对肠道造成了过度的物理性牵拉所致。缺血的肠段在手术过程中可通过显微镜轻易识别。结扎后数分钟内，随着严重的血管充血，浆膜会由正常的粉红色变为深蓝色，而非其正常的粉红色泽。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过在鸡模型的肠道上结扎来创建多个肠段。一旦掌握该手术操作，若操作得当，排除感染时间，整个过程可在三小时内完成。在尝试该操作时，重要的是要始终使鸡保持深度麻醉状态，以控制疼痛，并在所有操作过程中（包括手术阶段及感染后阶段）监测其生命体征。

采用此方法后，可进一步进行细菌分离或直接鉴定等操作，例如通过 PCR 检测基因，以回答有关初始接种病原体的回收与鉴定等外部问题。该技术的发展为研究产气荚膜梭菌致病机制的研究人员提供了探索鸡坏死性肠炎的新途径。请务必注意，活体动物实验可能存在极大的变异性。

在进行该操作时，应始终对鸡进行持续的麻醉监护等预防措施。