Name: CRISPR 指南对小鼠前列腺病毒传递的基因改变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 了解利用CRISPR/Cas9技术通过病毒递送对小鼠前列腺进行基因编辑的方法。该技术可实现原位基因表达改变，为前列腺癌研究提供新型动物模型，帮助研究人员在活体环境中快速分析并验证多个基因的功能。

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MR 获得了丹麦癌症协会（R146-A9394-16-S2）提供的博士后奖学金资助。MFB 和 MKT 获得了 AUFF NOVA（AUFF-E-2015-FLS-9-8）的资助。MR 和 MFB 还获得了奥胡斯大学健康学院研究生院的联合资助。E.F.W. 实验室获得了西班牙经济部基金（SAF2015-70857，由欧洲区域发展基金 ERDF-EU 共同资助）以及欧洲研究理事会高级基金（741888 - CSI-Fun）的支持。
我们感谢西班牙国家癌症研究中心基因、发育与疾病部门的 Liliana Fajardo Mellor 对本文稿的审阅与宝贵意见。

本方案涉及对实验小鼠进行外科手术。所有动物实验必须经过机构动物护理和使用委员会（IACUC）的 individually 审查和批准。由于该方法基于动物恢复和存活，因此必须始终确保适当的麻醉、疼痛管理和无菌手术环境。在手术期间以及麻醉恢复前，使用加热垫以防止低体温。
1. 开始前的注意事项
<ol>
	<li>根据所用病毒的不同，可能需要不同的滴度；请相应稀释病毒。 
	注意：本示例中，将腺相关病毒用 PBS 稀释后，以 1 × 1012 IU/mL 的滴度进行注射。该病毒为 9 型血清型，携带针对 Pten 的引导 RNA，并在泛素启动子驱动下表达 Cre 蛋白（图 1）。Pten 的缺失可导致前列腺上皮中 pAKT 水平升高及细胞增殖增加13。</li>
	<li>手术时使用 8&#160;周龄的雄性小鼠，以确保前列腺充分发育。 
	注意：本实验所用小鼠为 C57BL/6J 背景的 Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 基因敲入小鼠12（图 1）。</li>
	<li>现配现用全身麻醉混合液，并尽可能保持无菌。 
	注意：为促进动物术后恢复，强烈推荐使用麻醉拮抗剂。
	<ol>
		<li>配制总量为 5 mL 的麻醉剂：将 0.15 mL 盐酸美托咪啶（1 mg/mL）、0.4 mL 咪达唑仑（5 mg/mL）和 0.25 mL 丁丙诺啡（10 mg/mL）加入 4.2 mL 无菌生理盐水中混合均匀。 
		注意：根据机构动物护理指南，也可采用其他麻醉方法，如吸入式异氟烷。</li>
		<li>为逆转术后盐酸美托咪啶的作用，将 0.1 mL 阿替美唑（5 mg/mL）与 4.9 mL 无菌生理盐水混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过适当的消毒和灭菌措施准备无菌手术环境。手术器械使用前需经高压灭菌。</li>
</ol>
2. 病毒递送至小鼠前列腺
<ol>
	<li>使用无菌1 mL注射器和27G × ½"针头，通过腹腔注射对动物进行麻醉。麻醉剂量为每克体重0.01 mL。若手术操作持续时间超过30分钟，每隔30分钟追加初始剂量的1/3以维持麻醉状态。</li>
	<li>通过评估肌肉松弛度、足底回缩反应和眼睑反射来判断麻醉深度。当观察到反射消失时，剃除动物下腹部的毛发。</li>
	<li>使用无菌棉签将兽用眼科软膏小心涂抹于动物眼部，以防止因角膜反射缺失导致失明。</li>
	<li>用70%乙醇和10%聚维碘酮擦拭脱毛的腹部，以消毒手术区域。&#160;从手术区域中心向外周擦拭。&#160;</li>
	<li>使用无菌手术剪在腹部中下部正中线处进行约1 cm的垂直皮肤切口。</li>
	<li>用精细尖头镊子提起腹膜，以防止损伤其下方的器官。小心地进行 &#60; 使用手术剪刀经腹膜做8 mm切口。 
	注意：与人类不同，啮齿类动物的前列腺由四个独立的叶组成。前叶与精囊相连。</li>
	<li>轻轻移开脂肪组织，暴露精囊。使用环形镊子小心提起精囊，直至可辨认前叶前列腺。图1).</li>
	<li>注射总体积为 30 µL 的病毒（3 x 1010 使用0.5 mL胰岛素注射器（配30G × 8 mm针头）将病毒颗粒溶液注射至前前列腺上皮组织中。操作时应尽量减少液体渗漏，并确保溶液被组织吸收，形成一个小气泡。随后将精囊复位至腹腔内。</li>
	<li>使用6-0可吸收缝线，配以13 mm、3/8圆、锥形针，用2-3针间断单纯缝合缝合腹膜。</li>
	<li>用无菌的 4.8 x 6.5 mm 皮肤缝合钉将皮肤固定，用镊子提起皮肤以避免损伤腹膜。</li>
	<li>为获得更好的恢复效果，使用无菌1 mL注射器和27G × ½"针头，按0.01 mL/g体重剂量通过腹腔注射给予麻醉拮抗剂。小心将动物放回其笼中。</li>
</ol>
3. 术后操作步骤
<ol>
	<li>手术后将小鼠置于加热垫上保持1小时，以防止低体温，直至其完全恢复。如果使用了拮抗剂，动物通常在注射后几分钟内苏醒。</li>
	<li>每天监测动物伤口愈合情况及疼痛表现。如有需要，根据机构的动物护理指南给予额外的镇痛药物。</li>
	<li>待伤口闭合后，于术后4-5天拆除皮肤夹。</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+incidence+and+mortality+worldwide%3A+sources%2C+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454(2015).</li>
<li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19937345">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li>
<li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+JUNB%2FAP-1+promotes+invasive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy%2C+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li>
<li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li>
<li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+prostate%3A+an+historical+survey+of+divergent+views%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们描述了一种通过病毒注射改变小鼠前列腺前叶基因表达的方法，从而建立一种强大的新型前列腺癌小鼠模型（图2）。腺病毒的成功递送最早由 Leow et al. 于2005年报道8。我们此前已证明，编码Cre重组酶蛋白的腺病毒可替代耗时的Cre等位基因交叉繁育，实现组织特异性基因删除9（图2D）。由于该病毒仅感染少数细胞9，该模型可模拟人类肿瘤克隆扩增的过程14,15，非常适合用于癌症研究（图2B）。
CRISPR/Cas9 技术的发现为 体内 基因编辑开辟了新的机遇。现在可以同时修改多个基因，从而以节...

过去十年中，前列腺癌的检测和治疗已取得显著进展。然而，随着预期寿命的延长，前列腺癌的发病率仍在持续上升。全球每年约有110万例新发病例，使其成为男性癌症相关死亡的最常见原因之一1。前列腺癌发展较为缓慢，但当疾病进展至晚期转移阶段时，由于治疗选择有限，预后往往较差。迄今为止，仅发现少数几个基因是该癌症常见的驱动因素，而肿瘤的高度异质性和多灶性特征进一步阻碍了生物标志物及可靶向治疗的致病驱动因子的发现2,3。
传统生成GEMMs的技术常因其复杂性、耗时和成本而受到限制。条件性基因敲除模型已被广泛用于研究前列腺癌候选基因，这些基因在生殖系中失活时会导致胚胎致死4。最常见的模型是通过额外的杂交育种，将由修饰后的Probasin5或PSA6启动子驱动的前列腺特异性Cre重组酶整合到GEMM中。在这些模型中，目标基因将在大多数前列腺上皮细胞中被靶向，导致整个器官出现增生，可能影响动物的泌尿道功能7。
通过将Cre蛋白以病毒载体形式注射至小鼠前列腺前叶，可仅靶向少数细胞，从而解决这一问题8。根据各实验室的技术条件、专业技能和研究目标，该方法具有多种可行的变异方案。已有研究表明，使用靶向JunB和Pten的腺病毒9，或靶向Pten和Trp53的慢病毒10等策略均能成功实现。在病毒载体或基因工程小鼠模型（GEMM）中引入荧光素酶等报告基因，还可通过生物发光成像技术对疾病进展进行无创监测11。
基于CRISPR/Cas9技术的基因组编辑为研究癌症提供了全新且快速的方法，可通过快速生成体细胞敲除模型来实现12。通过病毒递送靶向小鼠前列腺前叶的单导向RNA（sgRNA），可建立生理上更为相关的前列腺癌模型。通过该方法，携带特定突变的单个细胞可形成具有增殖和侵袭能力的克隆。此外，使用针对多个靶基因的导向RNA将产生具有不同基因改变的细胞克隆，从而允许肿瘤异质性以及癌症进展过程中的自然选择压力，进而揭示每个基因改变或上位性机制的重要性。
本文介绍了一种将病毒颗粒递送至小鼠前列腺以改变基因表达的方法。通过一个小的腹部切口，暴露小鼠前前列腺叶，并将病毒颗粒注射入该叶中。术后5天可从皮肤移除手术夹，前列腺癌的分析可在术后8周开始。总体而言，该方法是一种快速且成本效益高的操作，对小鼠影响较小，并可在不损害小鼠健康的情况下促进较大肿瘤的形成。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh&lt;/sup&gt;/J 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>26175</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml U-100 胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>324825</td><td>用于病毒注射</td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD</td><td>300013</td><td>用于麻醉注射</td></tr><tr><td>30 G 1/2'' 针头</td><td>BD</td><td>304000</td><td>用于麻醉注射</td></tr><tr><td>6-0 Polysorb 缝合线</td><td>Medtronic</td><td>GL889</td><td>用于缝合腹膜</td></tr><tr><td>一次性无菌手术巾</td><td>多个供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>多个供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘消毒垫</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-70</td><td></td></tr><tr><td>剃毛机</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>用于剃除腹部毛发</td></tr><tr><td>Dumont 镊子</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Halsey 微型持针器</td><td>F.S.T</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>F.S.T</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>窄齿镊</td><td>F.S.T</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>环形镊</td><td>F.S.T</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>伤口夹系统手柄（含夹子）</td><td>F.S.T</td><td>12030-01</td><td>用于闭合皮肤</td></tr><tr><td>伤口夹移除器</td><td>F.S.T</td><td>12030-04</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>已使用不同型号</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td></td><td></td><td>由动物设施提供</td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td></td><td></td><td>由动物设施提供</td></tr><tr><td>盐酸美托咪定</td><td></td><td></td><td>由动物设施提供</td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td></td><td></td><td>由动物设施提供</td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>眼膏</td><td>Takeda</td><td>7242</td><td></td></tr><tr><td>病毒（AAV，AV）</td><td>多个供应商</td><td></td><td>本方案中使用的病毒为实验室自制</td></tr><tr><td>pAKT 抗体</td><td>CST</td><td>4060</td><td>使用 1:200 稀释度</td></tr><tr><td>GFP 抗体</td><td>CST</td><td>2956</td><td>使用 1:100 稀释度</td></tr></tbody></table>

病毒递送crispr向导rna至小鼠前列腺以实现基因改造

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

随着前列腺癌发病率不断上升，鉴定新的肿瘤驱动因子或调控因子至关重要。用于前列腺癌研究的基因工程小鼠模型（GEMM）受限于肿瘤异质性及其复杂的微进化动态。传统的前列腺癌小鼠模型主要包括生殖系和条件性基因敲除、癌基因的转基因表达以及异种移植模型等。在这些模型中引入新生突变（de novo mutations）的过程复杂、耗时且成本高昂。此外，大多数传统模型会靶向前列腺上皮的大部分区域，而人类前列腺癌通常仅在少数细胞亚群中以孤立事件的形式发生和发展。理想的研究模型不仅需要模拟前列腺癌的起始过程，还需能够模拟疾病向晚期进展的过程。
本文介绍一种通过病毒颗粒转导靶向前列腺上皮中少数细胞的方法。将经过基因改造的病毒递送至小鼠前列腺，可实现对前列腺上皮细胞基因表达的调控。病毒的类型和剂量将决定被靶向细胞的数量：少量细胞转导可用于肿瘤起始研究，而大量细胞转导则适用于基因治疗。通过手术方式将病毒注射至前叶，远离尿道，使得该模型中的肿瘤可在不影响动物排尿功能的情况下生长。此外，由于仅靶向部分前列腺上皮细胞，该技术可实现肿瘤的克隆性扩增，从而模拟人类肿瘤的起始、进展以及通过基底膜侵袭的过程。
这种新型技术提供了一个具有更高生理相关性的强大前列腺癌模型。动物所受的痛苦被限制在最低程度，而且由于无需额外的动物繁育，总体动物使用数量得以减少。同时，新候选基因和通路的分析得到加速，从而也更具成本效益。

为评估病毒对小鼠前列腺的递送效果，于手术后三个月收集样本进行分析。Rosa26-LSL-Cas9-EGFP小鼠12 在暴露于病毒表达的Cre蛋白的细胞中表达GFP。使用荧光显微镜检测前列腺样本，以鉴定具有GFP信号的区域图2A）。GFP信号表明前列腺上皮中存在Cre活性，但无法指示CRISPR向导RNA是否已诱导基因编辑。免疫组织化学切片显示局灶性区域的细胞pAKT高表达（图2B），表明丧失 Pten13. 使用 pAKT 和 GFP 进行免疫荧光共染色以鉴定双阳性细胞（图2C)。这证实了腺相关病毒对前列腺细胞的转化作用。总体而言，这些结果表明 体内 利用腺相关病毒和Rosa26-LSL-Cas9-EGFP小鼠可在前列腺上皮中进行CRISPR/Cas9基因编辑。</...

本方案描述了一种新建立的将病毒递送至小鼠前列腺的方法。该技术可通过CRISPR/Cas9技术、基因过表达或Cre重组酶递送，实现基因表达的原位调控，并建立一种新型的小鼠前列腺癌模型。

病毒递送CRISPR向导RNA至小鼠前列腺以实现基因改造

随着前列腺癌发病率不断上升，识别新的肿瘤驱动因子或调控因子至关重要。基因工程小鼠模型（GEMM）……

本手术操作的总体目标是通过病毒递送CRISPR Cas9向导RNA，在小鼠前列腺中改变基因表达，以诱导前列腺癌。该方法有助于在体内环境中分析和验证新基因，从而推动前列腺癌生物学领域的新问题研究。该技术的主要优势在于，仅需靶向部分前列腺细胞（类似于人类情况），即可实现多个基因的快速基因编辑。刚接触该操作的人可能会因器官大小以及手术成功所需的精确度而起初感到困难。为新鲜配制总共 5 毫升的麻醉剂，需混合 0.15 毫升浓度为 1 毫克/毫升的盐酸美托咪定、0.4 毫升浓度为 5 毫克/毫升的咪达唑仑和 0.25 毫升浓度为 10 毫克/毫升的丁丙诺啡，然后加入 4.2 毫升无菌生理盐水。为了逆转手术后盐酸美托咪定的作用，将0.1毫升浓度为5毫克/毫升的阿替美唑与4.9毫升无菌生理盐水混合，作为麻醉拮抗剂。通过适当的消毒和灭菌措施建立无菌手术环境，并对手术器械进行高压灭菌。为了将病毒递送至前列腺，在按照文本方案麻醉一只8周龄雄性小鼠后，通过评估肌肉松弛度、足底回缩反应和可触及的反射来检查麻醉深度。当观察到反射消失时，剃除动物下腹部的毛发。使用无菌棉签，小心地将兽用眼科软膏涂抹于动物眼部，以防止因干眼症导致的失明。随后，用70%乙醇和10%聚维碘酮擦拭已剃毛的腹部，以消毒手术区域。接下来，使用无菌手术剪，在腹部下端正中线处做一个约一厘米长的垂直皮肤切口。然后，用尖头镊子轻轻提起腹膜，以防止损伤其下方的器官；并用手术剪小心地在腹膜上做一个八毫米或更短的切口。轻柔地将脂肪组织拨至一侧，以暴露精囊。 然后，使用环形镊子小心地提起精囊，直至能够辨认出前叶前列腺。接着，用一支0.5毫升的胰岛素注射器和30号8毫米长的针头，向前叶前列腺上皮内注射总体积为30 µL的病毒溶液。尽量减少液体渗漏，并确保液体被组织吸收，形成一个小气泡。然后，将精囊放回腹腔内。为确保液体在组织内以微小气泡形式被吸收且无渗漏，注射时应平行于精囊，并沿前列腺前叶的形态进行。使用锥形针头和13毫米3/8圆弧缝线，以6-0可吸收缝线对会阴部进行2至3针单纯间断缝合。然后，用镊子提起皮肤，避免损伤腹膜；使用三个无菌的4.8 × 6.5毫米夹子固定皮肤。为促进术后恢复，使用无菌的1毫升注射器和27号½英寸针头，按每克体重0.1毫升的剂量，通过腹腔注射给予麻醉拮抗剂。随后，小心将动物放回其笼中。手术后将笼子放在加热垫上一小时，以防止低体温，直至动物完全恢复。动物在注射后几分钟内应苏醒。根据正文方案，继续每天监测和处理动物。当伤口闭合后，移除皮肤夹。为了评估病毒对小鼠前列腺的递送效果，在手术后三个月对样本进行了分析。如下图所示，本研究中使用的小鼠在暴露于病毒表达的Cree蛋白的细胞中表达了GFP。GFP 信号显示了前列腺上皮中的 Cree 活性，但无法表明该活性是否由 CRISPR 引导序列诱导了基因编辑所致。这些免疫组织化学切片鉴定出某些局灶区域的细胞高表达 pAKT，提示 P10 的缺失。在这些图示中，pAKT 与 GFP 的共染色鉴定出双阳性细胞，证实了腺相关病毒对前列腺细胞的转化作用。总体而言，这些结果表明，在体内可通过 Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 小鼠和腺相关病毒在前列腺上皮中实现 CRISPR-Cas9 基因编辑。一旦掌握该技术，操作可在 15 分钟内完成。该技术为前列腺癌领域的研究铺平了道路，使得能够在体内同时检测多个基因的功能。观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何将底物递送至小鼠前列腺。请务必注意，某些病毒可能具有极高危险性，因此在进行这些操作时，应始终采取适当的预防措施。

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CRISPR 指南对小鼠前列腺病毒传递的基因改变

本视频介绍了一种利用腺病毒递送系统在前列腺细胞中编辑特定基因的方法。该方法可实现基因表达的原位和局部调控，结合CRISPR技术，用于构建新型的小鼠前列腺癌模型。...

利用基因工程小鼠模型模拟前列腺癌：一种通过CRISPR/Cas9介导的局部基因编辑技术在小鼠前叶前列腺细胞中的应用

CRISPR/Cas9 系统有望使靶向基因组编辑技术在科学界变得易于获取且成本低廉。本实验方案旨在演示如何利用 CRISPR/Cas9...

高滴度CRISPR逆转录病毒与慢病毒的设计、包装及通过立体定位注射递送

本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外...

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

本实验方案的目的是演示前列腺癌细胞的前列腺内注射，随后进行阉割。在具有临床相关性的肿瘤微环境和免疫健全宿主的背景下，建立依赖雄激素及去势抵抗性前列腺癌的原位临床前模型，对于研究该疾病至关重要。...

一种用于雄激素依赖性和去势抵抗性前列腺癌的生物发光与荧光同基因小鼠原位模型

在此，我们提供了一项详细的实验方案，用于执行 体内...

腺相关病毒介导的 CRISPR 心脏基因编辑在小鼠中的应用

我们介绍一种将DNA质粒递送至小鼠膀胱尿路上皮细胞的新方法 体内...

通过电穿孔法将质粒DNA递送至小鼠膀胱尿路上皮的新方法

本文介绍一种快速、直接的体内CRISPR/Cas9筛选方法，该方法通过超声引导下的子宫内胚胎慢病毒注射，同时评估多个基因在免疫功能健全小鼠皮肤和口腔中的功能。...

利用体内CRISPR/Cas9筛选技术同时评估小鼠皮肤和口腔中的基因功能

本方案描述了Gja1基因中一个M213L突变，该突变可维持全长连接蛋白43的正常生成，但阻止较小的GJA1-20k内部翻译异构体的翻译。...

在保留全长蛋白表达的同时移除 mRNA 中的内部翻译起始位点

本方案描述了一种高通量的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）基因编辑工作流程，用于微小RNA（miRNA）簇网络分析，可在单次实验中快速构建一系列基因修饰的细胞系，这些细胞系携带不同miRNA簇成员的特异性缺失组合，缺失片段长度可达35...

用于微小RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

本文介绍一种简单的方法，旨在高效产生名为“CRISPR RNP...

通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

我们介绍一种将引导RNA通过逆转录病毒转导至Cas9转基因小鼠原代T细胞的实验方案，为研究Th17细胞分化过程中的基因编辑提供了一种高效的替代方法。...

逆转录病毒CRISPR/Cas9介导的基因靶向技术用于体外研究Th17细胞分化

了解利用CRISPR/Cas9技术通过病毒递送对小鼠前列腺进行基因编辑的方法。该技术可实现原位基因表达改变，为前列腺癌研究提供新型动物模型，帮助研究人员在活体环境中快速分析并验证多个基因的功能。

病毒递送CRISPR向导RNA至小鼠前列腺以实现基因改造

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