Name: 前子宫内胚胎小鼠脑电穿孔和脊髓切片培养迁移 GABAergic 中间神经元的活体成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 了解小鼠胚胎脑电穿孔与脊髓切片培养技术，用于活体成像观察GABAergic中间神经元的切向迁移过程。该方法成本低、操作简便，有助于研究基因突变对神经发育的影响，为自闭症和癫痫等神经发育疾病的诊断提供新思路。

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本工作获得了萨沃伊基金会和CURE癫痫基金会的运营资助，以及加拿大创新基金会向E.R.（共聚焦显微镜）和G.H.（转盘共聚焦显微镜）提供的设备资助。E.R. 获得了职业奖项 魁北克卫生研究基金会 （FRQ-S；临床科学家奖）以及加拿大卫生研究院（CIHR；青年研究者奖）。G.H. 是 FRQ-S 的资深学者。L.E. 获得了萨沃伊基金会颁发的斯特里亚德-萨沃伊博士后培训奖、圣心大学医院中心基金会博士后培训奖以及 FRQ-S 博士后培训奖，后一项奖项由星辰基金会合作资助。本项目由 Brain Canada 通过加拿大脑研究基金资助，并获得加拿大卫生部的资金支持，该资助授予 L.E.

所有涉及动物的实验均经CHU Sainte-Justine研究中心动物研究伦理实践委员会（CIBPAR）批准，并依照加拿大动物护理委员会《实验动物护理与使用指南》（第2版）的规定进行。
本方案经过优化，适用于胚胎发育第13.5天（e13.5）的胚胎电穿孔，此时正处在MGE来源的中间神经元（INs）活跃生成、而CGE来源的INs尚未达到生成高峰的阶段45,46。此外，为了使电穿孔偏向于GABA能中间神经元，我们采用在中间神经元中特异性表达的启动子（例如带有最小增强子的Dlx5/6启动子）47。
1. 电穿孔与器官型脑片培养用溶液的制备
<ol>
	<li>准备 125 mL 无菌培养基。
	<ol>
		<li>在先前经紫外线灭菌并喷洒 70% 乙醇的生物安全柜中，将 125 mL 常规神经元特异性培养基（配方见材料表）量取至无菌瓶内。加入 2.25 mL 的 50 倍无血清神经元特异性添加剂、1.75 mL 的 200 mM 谷氨酰胺（终浓度为 0.5 mM）以及 6.25 mL 已在无菌条件下分装的热灭活马血清。充分混匀后，分装至 15 mL 无菌锥形管中，4 °C 保存。 
		注意：配制好的培养基可在 4 °C 下保存最多 3 周。</li>
		<li>在无菌条件下将 100 倍浓度的 Botteinstein's N-2 配方储备液48 分装为每份 150 µL，-20°C 冻存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备 1 L 无菌人工脑脊液（ACSF）。
	<ol>
		<li>在 1 L 烧杯中量取 800 mL 蒸馏水，加入 25.67 g 蔗糖、5.08 g 氯化钠（NaCl）、2.18 g 碳酸氢钠（NaHCO3）、1.80 g 葡萄糖、0.19 g 氯化钾（KCl）、0.15 g 无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）、1 mL 1 M 的 CaCl2·2H2O 储备液和 2 mL 1 M 的 MgSO4·7H2O 储备液。室温下搅拌至完全溶解，再用蒸馏水定容至 1 L。</li>
		<li>使用 0.22 µm 滤器，在无菌生物安全柜中将溶液过滤至无菌瓶中，4 °C 保存，可保存长达 1 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每次实验前新鲜配制 4% 琼脂糖 ACSF 溶液。
	<ol>
		<li>取 25 mL 已配制好的 ACSF 加入 50 mL 无菌锥形管中，加入 1 g 低熔点琼脂糖。</li>
		<li>在微波炉中加热 45 秒。为防止喷溅，当开始沸腾时，每隔 3–4 秒暂停加热，打开管盖释放压力，重新盖紧后手动振荡混匀。重复此过程直至琼脂糖溶液均匀。实验剩余时间内将琼脂糖溶液保持在 42 °C，以防止凝固。 
		注意：过高的温度会损伤脑组织。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 注射质粒的制备
<ol>
	<li>拉制玻璃显微注射移液管
	<ol>
		<li>设置微量移液管拉制仪的适当参数，将玻璃毛细管固定在指定位置，并确保其与加热丝对中。</li>
		<li>按下拉制按钮。</li>
		<li>小心地从热拉制仪上取下新制备的显微注射移液管，并将其放入盒子或洁净的培养皿中备用，以避免损伤尖端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在生物安全柜中放置本实验所需的所有仪器（见图1A），用70%乙醇充分喷洒生物安全柜内的所有仪器，并用紫外灯对仪器和环境进行15–20分钟的灭菌处理。</li>
	<li>在灭菌过程中，将质粒置于冰上（4 °C）解冻。</li>
	<li>从储存液（4 µg/µL）中量取10 µL质粒至洁净的1.5 mL离心管中，加入0.01%的亮蓝FCF染料。轻轻混匀，短暂离心后置于冰上保存，直至使用。 
	注意：应根据制造商说明书，使用无内毒素大提试剂盒制备大提DNA。DNA可溶解于TE缓冲液或无核酸酶的H2O中；质粒与染料溶液的混合步骤可在非无菌条件下进行。大提所得质粒应分装保存，避免多次冻融。分装后的质粒应在使用前不超过2小时内与染料混合，且不应再次冷冻用于后续实验。</li>
	<li>灭菌完成后，按以下步骤准备纳米注射仪：
	<ol>
		<li>从先前制备并存放于洁净盒子或培养皿中的玻璃显微注射移液管中选择一根，使用小镊子以斜面方式剪切其尖端，使其外径约为15 µm。 
		注意：此处提供的外径为近似值，旨在为使用者提供本实验所用参数的参考。该尺寸已优化，可在注射质粒时顺利穿透颅骨而不损伤脑组织，同时保证DNA溶液的顺利加载与释放。可通过在明场显微镜下将剪切后的玻璃显微注射移液管尖端与微米级标尺对比，测量其外径。</li>
		<li>使用注射器从移液管未拉制的一端注入矿物油，以排出所有空气。</li>
		<li>根据制造商说明书，将已填充矿物油的玻璃显微注射移液管插入纳米注射仪中。</li>
		<li>排出玻璃移液管中约2/3体积的矿物油（保留足够油量以防止空气进入）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心地将已准备好的显微注射移液管插入含有质粒/染料溶液的离心管中，使玻璃移液管吸入质粒/染料溶液。</li>
</ol>
3. 从怀孕雌性小鼠中收集胚胎
<ol>
	<li>每天监测繁殖期雌鼠是否出现阴道栓，最好在每天同一时间（下午早些时候）进行观察。观察到阴道栓的第一天记为胚胎发育0.5天（e0.5）。 
	注意：此处描述的实验可在野生型小鼠中进行。然而，为了便于识别内侧神经节隆起（MGE）并标记所有GABA能中间神经元（INs）（或特定亚群，如源自MGE的INs），可使用转基因动物（例如：GAD67EGFP；携带Cre报告等位基因的Dlx5/6Cre等47,49）。在此情况下，所注射的实验质粒应表达另一种荧光蛋白（例如mCherry或TdTomato），以便可视化转染的中间神经元（呈黄色），并与未转染的中间神经元（呈绿色）进行比较。</li>
	<li>在胚胎发育13.5天（e13.5）时通过颈椎脱位法处死雌鼠。 
	注意：处死时使用的麻醉剂可能影响中间神经元的迁移和存活50,51，应避免使用。</li>
	<li>通过剖腹产方式收集胚胎，步骤如下：
	<ol>
		<li>用70%乙醇充分喷洒雌鼠腹部。用一把无菌镊子提起腹部皮肤，另一只手使用无菌手术剪从腹部剪开皮肤。</li>
		<li>使用第二把无菌镊子和剪刀提起腹膜，并剪开，操作时需小心避免损伤子宫。</li>
		<li>使用第三把无菌镊子和剪刀提起子宫角并将其从盆腔中剪下。将分离出的子宫角置于一个无菌的60 mm培养皿中，培养皿内盛有添加了氨基酸、维生素和无机盐的神经基础培养基（参见材料表中提供的商品化产品）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌生物安全柜中，使用两把精细镊子（每只手各一把）将胚胎从胎盘中分离，并通过断头法分离头部。</li>
	<li>将无菌的3 mL塑料移液管尖端斜面剪开，吸取胚胎头部，并转移至一个新的无菌60 mm培养皿中，该培养皿底部铺有固化的黑色石蜡，并盛有与上述相同的补充神经基础培养基。 
	注意：此步骤可最大限度减少污染物（如鼠毛、血液）的转移。黑色石蜡用于在解剖过程中稳定头部。这些操作过程中培养基无需氧合。</li>
</ol>
4. 脑室内质粒注射及 离体 MGE的电穿孔
注意：以下步骤必须在先前准备好的生物安全柜内的无菌条件下进行。
<ol>
	<li>将装有断头样本、并铺有黑色石蜡的60 mm培养皿置于生物安全柜内的双目显微镜下，培养皿中需含有基于神经组织的补充培养基。</li>
	<li>用左手持精细镊子固定头部，使头部前端朝右，右手使用纳米注射器向右侧侧脑室注射1–2 µL质粒/染料溶液。 
	注意：可通过将救援质粒与表达shRNA的质粒按等摩尔浓度混合后共电穿孔，进行共表达实验。</li>
	<li>对注射后的脑组织进行电穿孔。
	<ol>
		<li>将头部置于电极之间，负极置于头部背侧，与头部平行，正极置于头部腹侧，以靶向内侧神经节隆起（MGE）。</li>
		<li>电极位置调整妥当后，施加4次40 V的方波脉冲，每次持续50 ms，脉冲间隔为500 ms。</li>
		<li>使用已放置在生物安全柜内的镊子清除电极上残留的组织。 
		注意：这些参数是针对本实验所用电穿孔仪专门优化的。若使用其他类型的电穿孔仪，建议用户预先进行优化测试。</li>
		<li>对所有剩余脑组织重复步骤4.1至4.3。 
		注意：尽管本方案描述的是单个脑组织的操作流程，但可连续注射最多4个脑组织后再依次进行电穿孔，从而提高实验通量。当在同一实验中依次注射两种或多种不同质粒（例如对照质粒或实验质粒）时，该策略尤为有利（便于窝内对照比较）。此外，还可通过将电极完全平行于脑表面放置，同时对脑组织双侧进行注射和电穿孔，以进一步提高产量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 脑组织解剖与器官型脑片培养
<ol>
	<li>在生物安全柜的无菌环境中操作时，将脑组织从颅骨中解剖出来。
	<ol>
		<li>将针插入双眼以固定头部，针尖需避开脑组织，防止损伤，头部下方垫一层黑色石蜡以稳定位置。</li>
		<li>用一对精细镊子夹住颈部左侧，再用另一对精细镊子从后向前撕开颅骨表面的皮肤。</li>
		<li>一手用镊子从侧面固定头部，另一手用另一对镊子在脑干水平小心剪开颅骨，并轻轻向上提起颅骨。每对镊子沿矢状面（中线）向前剪切，再向两侧剪开，以分离颅骨碎片。</li>
		<li>提起脑干，小心剪断脑膜和颅神经，直至脑组织完全脱离颅骨。 
		注意：5.1 中描述的所有步骤均须在生物安全柜内严格无菌条件下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将脑组织包埋于 4% 低熔点琼脂糖中，用于切片。
	<ol>
		<li>将上述制备的琼脂糖溶液（保持在 42 °C 液态）注入一个 35 mm 的培养皿中。</li>
		<li>使用预先剪切的转移移液管，迅速将电穿孔后的脑组织转移至含琼脂糖的培养皿中。将培养皿置于室温下。</li>
		<li>用金属棒轻轻搅拌琼脂糖，使脑组织保持在孔中央（防止下沉），并将脑组织调整为与培养皿平行的头尾方向。当琼脂糖开始凝固时停止搅拌，以避免损伤脑组织。</li>
		<li>使用剃刀片切割脑组织周围的琼脂糖，形成一个矩形块，脑组织周围保留 1 - 2 毫米的边缘。确保脑组织的前端与琼脂糖块前缘垂直，以便后续切片时准确定位。</li>
		<li>对每个脑组织重复上述操作。 
		注意：可通过将多个脑组织置于不同高度并分别塑形成独立的琼脂糖块，实现一次切割多个脑组织（最多 3 个）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>振动切片机冠状切片及脑片培养。
	<ol>
		<li>将一份 100X N-2 补充剂（150 µL）置于冰上解冻，并在无菌条件下加入 15 mL 分装的培养基中。</li>
		<li>将 750 µL 培养基（含 1X N2 补充剂）加入 6 孔培养板的每一孔中。</li>
		<li>使用弯头镊子将一个细胞培养插件（直径 30 mm，孔径 0.4 µm，PTFE 材质）放入每孔含培养基的孔中。</li>
		<li>向振动切片机浴槽中加入持续充氧的人工脑脊液（ACSF），并用冰块包围浴槽将其冷却至 4 °C，或使用制冷型振动切片机。</li>
		<li>将振动切片机的切片速度设为 0.150 mm/s，频率设为 80 赫兹。</li>
		<li>将琼脂糖块粘附于振动切片机平台，脑组织前端朝下，腹侧面向操作者。</li>
		<li>以冠状面切割脑组织，获得厚度为 250 µm 的切片（在 4 °C 下进行）。</li>
		<li>使用灭菌的刮铲收集包含内侧神经节隆起（MGE）的 2 - 3 个切片，并将同一动物的所有脑片小心地放置于一个 30 mm 直径的膜插件上，避免切片重叠。将插件放入 6 孔培养板的一个孔中（孔内含 750 µL 添加补充剂的培养基，如上所述）。或者，也可将每个切片单独置于 12 孔板中直径为 13 mm 的膜插件上，每孔加入 500 µL 添加补充剂的培养基。推荐的培养基体积可确保脑片通过培养基获得营养，同时不被完全浸没。 
		注意：5.3.6 和 5.3.7 步骤通常不在完全无菌条件下进行，除非振动切片机可灭菌并在生物安全柜内使用。因此，必须谨慎操作以避免污染。操作过程中应始终穿戴适当的防护装备（清洁口罩、外科手套和实验服），任何身体部位（即使已遮盖，如头发、面部和手部）均不得越过培养板（无论是否含有培养基）。建议频繁使用 70% 乙醇喷洒用于收集脑片的手套和刮铲。</li>
		<li>将培养板置于通风良好的无菌培养箱中，37 °C、60% 湿度、5% CO2 条件下培养 48 或 72 小时。 
		注意：上述培养时间分别针对 MGE 来源的中间神经元（INs）的延时成像和固定切片的共聚焦成像进行了优化。不同实验设计应预先测试最佳培养时间。此外，若培养时间不超过 72 小时，则无需更换培养基；若培养时间更长，应每隔 2 - 3 天更换一次培养基。</li>
		<li>在达到所需培养时间后，将目标切片转移至 8 孔载玻片中，每孔加入 3 - 5 µL 培养基。将载玻片置于环境控制舱（37 °C、60% 湿度、5% CO2）中，并连接至配备计算机辅助采集软件的倒置转盘共聚焦显微镜，以设置延时成像实验。 
		注意：也可选择将切片用 4% 多聚甲醛固定（4 °C 过夜或室温 2 小时），随后使用不同抗体进行免疫染色，以便在共聚焦显微镜下观察电穿孔的中间神经元的形态特征。尽管 eGFP 和 mCherry 无需复染即可通过共聚焦显微镜观察，但我们建议针对 GFP 和 mCherry 进行免疫组织化学染色以增强信号，因为固定过程可能减弱荧光，影响对胚胎神经元细微结构（如前导或尾随突起中的细小分支）的检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。本文所表达的观点不一定代表加拿大卫生部长或加拿大政府的观点。

本文中，我们提供了一种可靠的执行方法 子宫外 在e13.5时期对小鼠MGE进行电穿孔并制备胚胎脑切片的器官型培养。尽管 体外 方法，如Boyden小室实验，操作相对简便，可用于评估不同基因和蛋白质的特定作用，且不受其他因素干扰，但无法用于研究IN迁移的动力学特征，包括迁移方向性和迁移路径。25MGE外植体为研究IN迁移过程中发生的动态细胞骨架变化提供了一种有效手段（如本研究所示），但其缺乏大多数内源性信号，通常需要添加导向信号以促进神经元迁移（尽管当MGE外植体培养在皮层饲养层上时，此情况可显著改善）。25,54然而，基于MGE外植体的检测方法可能无法发现参与较细微机制（如指导中间神经元特定方向性或迁移路径）的分子信号的作用29。这一问题最终通过以下方法得以解决： 在子宫内 电穿孔25，可在其原生环境中对源自MGE的迁移性中间...

皮层GABA能中间神经元（INs）在生化特性、生理特性和连接方式上具有高度多样性，其在成熟神经网络中介导不同的功能1,2,3,4,5。不同亚型皮层INs的特化过程受到遗传级联机制的严格调控，该机制已被广泛研究1,2。大多数（70%）皮层GABA能INs起源于位于腹侧的胚胎结构——内侧神经节隆起（MGE）中的前体细胞，必须经过较长距离迁移才能到达皮层板1,2,6。与沿着放射状胶质支架从脑室区（VZ）向皮层板进行径向迁移的皮层锥体细胞不同，中间神经元的切向迁移并不依赖此类支架，因此需要多种内在和外在信号引导其朝向皮层板迁移，同时使其远离非皮层结构2,7,8。当中间神经元退出细胞周期后，MGE脑室区表达的化学排斥信号使其受到排斥，从而启动向皮层板方向的切向迁移9,10。迁移中的中间神经元在多种排斥信号的帮助下避开纹状体11，在到达皮层板后，由切向迁移转换为径向迁移模式，并最终到达其所在的皮层层级位置，这一过程部分响应于锥体细胞12及其他细胞群体提供的信号13。与其他神经元群体类似，中间神经元的迁移涉及多种动态形态学变化，以实现神经元的实际移动。这种所谓的神经元运动特征为重复性的三个连续步骤循环： Leading process的延伸、细胞核的主动前向运动（核移），以及尾随突起的回缩14。中间神经元的迁移受到众多内在和外在信号的调控，这些信号驱动Leading process的分支及主动重塑，从而引导中间神经元向正确方向迁移，并决定其迁移的方向和速度14,15,16。
近年来，调控皮层中间神经元迁移的因素已被广泛研究1,2,7,17,18,19,20，而这些分子作用因子中的某些成分若发生紊乱，被认为可能导致神经发育障碍，例如小儿难治性癫痫或自闭症谱系障碍1,2,21,22,23,24因此，各种 体外 和 体内 已采用多种方法显著提升我们研究这一动态过程的能力，如先前综述所述25. 体外 方法，包括Boyden小室实验和条带选择实验，可在排除其他因素干扰的情况下，快速且最可重复地评估特定基因或蛋白质在神经元迁移过程中的必要性及其细胞自主性影响25这些检测方法若与活体成像结合使用，尤其具有实用价值8,26,27利用这些技术，可轻松从e13.5 MGE中获取中间神经元，并通过酶解和机械解离进行分离，随后可研究不同的信号通路和导向线索，如前所述。8,28然而，这些检测是在缺乏三维组织结构的人工细胞外基质中进行的，这可能会改变神经元的行为和细胞特性，进而影响细胞迁移和/或存活25. 为克服这些局限性， 离体 MGE外植体已被开发为一种替代工具，用于量化迁移过程中发生的动态形态变化，以及迁移速度和方向等参数14,29生成MGE外植体相对简单，且已在其他文献中被广泛描述。30将MGE的小量提取物接种于混合皮层细胞的单层培养物上，或在存在趋化吸引或趋化排斥信号的情况下，接种于Matrigel与胶原的混合物中。25，尽管后者为可选项31MGE外植体可实现对稀疏标记细胞的高分辨率成像，从而简化对细胞内过程的研究，例如如前所述的前导突起分支过程中的细胞骨架重塑32,33,34 在本研究中，MGE外植体已成功用于评估在二维环境中IN迁移期间的动态细胞骨架变化，例如在特定的药理学或趋化性干预后（参见例如Tielens） 等 201633然而，采用这种方法时，中间神经元会在人工基质中迁移，这可能改变中间神经元的行为，并影响实验结果的可重复性与科学意义。
相比之下，in utero 电穿孔技术能够在内侧神经元（INs）的天然环境中对其进行遗传操作，是一种广泛使用的方法，可快速高效地评估基因功能获得与缺失的影响，同时避免了成本高昂且耗时的基因敲除和基因敲入策略的局限性25,35。通过使用细胞类型特异性启动子，并将电极定位至包括MGE在内的腹内侧结构，可使in utero 电穿孔偏向于IN前体细胞36。此外，与使用病毒载体所需的7–10天相比，in utero 电穿孔可在1–2天内实现实验载体的及时表达25。然而，对IN前体细胞进行in utero 电穿孔的产率通常较低。事实上，尽管位于背侧脑室区的锥体细胞前体可通过in utero 电穿孔实现高效转染，但靶向位置更靠腹侧的结构（如MGE）在技术上更具挑战性，尤其是在体积较小的e13.5胚胎中，且较高的胚胎死亡率进一步降低了实验产出25。
为了克服与某些技术限制相关的问题 体外 MGE 外植体实验及 体内宫内 电穿孔 离体 器官型脑片培养技术已得到开发8,37,38,39脑类器官切片培养具有模拟 体内 条件，同时比构建动物模型更经济且耗时更少25事实上，这些制备方法能够便捷地进入内侧神经节隆起（MGE），并实现对中间神经元（INs）的特异性可视化，还可与局灶性电穿孔技术结合，用于研究在更接近生理环境中的迁移中间神经元内特定的分子通路。8,39,40,41因此，我们优化了一种用于器官型培养的方法38，我们将其与 子宫外 电穿孔与延时共聚焦成像，以进一步评估MGE-INs在切向迁移过程中发生的形态学及动态变化。本实验方案是在已有研究基础上进行改进和优化的，这些研究曾采用 子宫外 或 在子宫内 大脑电穿孔与脑片组织培养技术用于研究锥体细胞的迁移42,43 皮层中间神经元36,39,44具体而言，小鼠胚胎被断头后，对内侧神经节隆起（MGE）进行电穿孔 离体 在实验性质粒脑室内注射后，可比传统方法更高效、更精确地靶向MGE前体细胞 在子宫内 电穿孔。随后取出大脑并切制为完整的冠状脑片，这些脑片可培养数天，从而实现对转染的中间神经元（INs）进行持续追踪和成像。该方法通常每脑片可标记5–20个沿切向迁移的INs，既减少了达到统计显著性所需的实验重复次数，又保证了神经元标记的稀疏性，便于对单个神经元进行分离、重建及精细形态学评估。此外，与MGE外植体相比，器官型培养能确保迁移中的INs暴露于更接近生理的环境，包括局部分泌的趋化因子以及丘脑传入纤维的输入。因此，该方法非常适合定量分析转染INs的迁移方向性和迁移路径，同时提供足够的解剖学细节，以表征更精细的动态过程，如 Leading process 分支、核移动（nucleokinesis）和尾随突起回缩。

<table><tbody><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21103049</td><td>市售的神经元特异性培养基。完整配方请见此网站：https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td></tr><tr><td>B-27 无血清添加剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504044</td><td>50倍无血清神经元专用添加剂</td></tr><tr><td>15 mL 无菌离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz (1X) L-15 培养基（含 L-谷氨酰胺）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11415064</td><td>市售的神经细胞培养基，添加了氨基酸、维生素和无机盐。完整配方见于经销商网站&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>马血清，热灭活</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H1138-500ML</td><td></td></tr><tr><td>神经细胞培养补充剂 N-2 100X</td><td>Wisent</td><td>305-016</td><td>博特斯坦N-2培养基配方</td></tr><tr><td>VWR 方形 PETG 培养基瓶 125 mL</td><td>VWR</td><td>89132-062</td><td></td></tr><tr><td>II类A型生物安全柜</td><td>Nuaire</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>BioShop</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>BioShop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>D+葡萄糖</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸二氢钠</td><td>BioShop</td><td>SPM400.500</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>七水硫酸镁</td><td>BiosShop</td><td>MAG522</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>BioShop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 无菌离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>内径0.4 mm × 75 mm毛细管</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-800/12</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>E193</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; 公司</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>矿物油（重质）</td><td>Rougier Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WPI 瑞士镊子 #5</td><td>世界精密仪器公司</td><td>504511</td><td>11 厘米，直型，0.06×0.07 毫米尖端，抗磁性。您需要 2 把此类工具。</td></tr><tr><td>WPI 瑞士镊子 #7</td><td>World Precision Instruments</td><td>504504</td><td>11.5 厘米，0.18×0.2 毫米，弯曲尖端</td></tr><tr><td>HTC 镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>504617</td><td>11 厘米，直形，扁平</td></tr><tr><td>手术剪操作</td><td>World Precision Instruments</td><td>501225</td><td>16 cm，双刃锋利，直型。此类器械需准备3把。</td></tr><tr><td>持针器</td><td>World Precision Instruments</td><td>501217</td><td>12.5 cm，直型，带锯齿</td></tr><tr><td>虹膜镊</td><td>世界精密仪器公司</td><td>504478</td><td>10.2 厘米，全弧形，锯齿状</td></tr><tr><td>德贝基组织镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>501996</td><td>15 厘米，45&amp;deg; 角度，精细下颌钳，1.5 mm 宽</td></tr><tr><td>Fisherbrand 微型刮刀，两端呈圆形</td><td>FisherScientific</td><td>21-401-5</td><td>你需要准备两个。</td></tr><tr><td>Nanoject II 自动纳升注射仪</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>TC培养皿 60，标准型</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td>60-mm 培养皿</td></tr><tr><td>组织培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.1800</td><td>35 mm 培养皿</td></tr><tr><td>黑色石蜡</td><td>FisherScientific</td><td>S17432</td><td></td></tr><tr><td>移液管&amp;nbsp;</td><td>Ultident</td><td>170-CTB700-212</td><td>3 mL，小号球泡</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica M80</td><td>替代我们已停产的体视显微镜（FisherScientific 公司的 StereoMaster）</td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>镊子电极，铂镀层，3毫米</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0487</td><td></td></tr><tr><td>25G 1 1/2</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; 公司</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1000S 振动切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>GEM，单边剃须刀片</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>71952-10</td><td>在将组织插入振动切片机的指定刀片位置之前，先切除钝端</td></tr><tr><td>&amp;micro;-滑动8孔板</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>15个装</td></tr><tr><td>Millipore细胞培养小室</td><td>Millipore-Sigma</td><td>PICM0RG50</td><td>30 毫米，亲水性聚四氟乙烯，0.4 微米 &amp;micro;m孔，50个装&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica DMi6000 显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>旋转盘共聚焦显微镜头 Ultraview Vox</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.0 采集软件</td><td>Improvision/Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LiveCell 显微镜载物台顶部培养系统</td><td>病理学设备</td><td>LC30030</td><td>提供温度、CO2和湿度控制。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SP8 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mCherry-Lifeact-7</td><td>Addgene</td><td>54491</td><td>Michael Davidson 惠赠</td></tr><tr><td>快绿 FCF</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>25G 瓶，经生物染色剂委员会认证</td></tr></tbody></table>

ex utero 电穿孔及胚胎小鼠脑组织切片培养用于迁移性gaba能中间神经元的活体成像

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABA能中间神经元（INs）是驱动认知与行为的神经网络中的关键组分。这些最终定位于大脑皮层的中间神经元，会从端脑腹侧区域（包括内侧和尾侧神经节隆起（MGE、CGE））起源处沿切线方向迁移至背侧皮层板，此过程受到多种内在与外在信号的调控。多年来，研究人员已开发出多种方法，用于在基因水平上操控特定通路，并探究其如何调控中间神经元正常迁移所必需的动态细胞骨架变化。在体电穿孔技术已被广泛用于研究基因抑制或过表达对特定中间神经元亚型的影响，同时评估其对细胞形态及最终定位的作用。然而，尽管该方法常用于改造径向迁移的锥体细胞，但在靶向中间神经元时技术难度更高。在体电穿孔的效率较低，尤其在胚胎发育14.5天前（e14.5）进行操作时，幼鼠存活率下降，而研究MGE来源的中间神经元通常需要在此时间点之前进行电穿孔。另一种替代方法是使用MGE组织块培养，该方法便于获取MGE组织，并利于对基因修饰的中间神经元进行成像观察。然而，在此类组织块中，中间神经元迁移进入的是人工基质，缺乏内源性引导信号和丘脑输入。因此，我们致力于优化一种方法，使中间神经元能够在更接近自然的环境中迁移，同时规避在体操作的技术难题。本文中，我们描述了一种结合体外电穿孔与器官型脑片培养的技术流程，可便捷地追踪、成像并重建沿天然路径迁移的基因修饰中间神经元，这些迁移过程响应于内源性信号。该方法不仅可通过共聚焦延时成像对中间神经元迁移的动态特征进行定量分析，还可通过对固定后免疫标记组织的神经元形态重建，详细分析多种形态学参数。

本部分展示了在 e13.5 小鼠胚胎的 MGE 中进行 ex utero 电穿孔转染对照质粒或靶向目的基因的实验质粒后，通过器官型脑片培养在 37 °C 下孵育 48 小时（用于延时成像）或 72 小时（用于固定和免疫组织化学标记）所获得的代表性结果（实验流程示意图见图1B）。同时展示了来自 MGE 外植体的中间神经元迁移的代表性示例（实验流程示意图见图1C），以与本文所述方法进行对比。在 MGE 前体细胞中进行质粒电穿孔似乎会延迟中间神经元从 MGE 的迁移，因此需相应调整培养时间。
在成功的实验中，活体组织切片在共聚焦显微镜下呈现健康状态，即在明场模式下皮质层清晰可辨，切片表面无可见污染（通过强烈的自发荧光及表层荧光细丝的存在，在落射荧光下可识别）。在健康的慢性活体组织切片中，约20%的细胞在培养72小时后发生凋...

本文提供了一种低成本且可靠的方法，可从小鼠胚胎制备适用于共聚焦显微镜和活体成像技术的电穿孔脑组织切片培养物。

Ex Utero 电穿孔及胚胎小鼠脑组织切片培养用于迁移性GABA能中间神经元的活体成像

GABA能中间神经元（INs）是驱动认知与行为的神经网络中的关键组分。 destined to populate the cortex migrate ...

本实验的总体目标是在尽可能接近自然的环境中，观察基因修饰的皮层 GABA 能中间神经元在切向迁移过程中的行为。该方法可通过筛选特定基因或蛋白质功能缺失对脑发育的影响，帮助回答发育神经科学领域的一些关键问题。该技术的主要优势在于，与其他类似方法（如胎内电穿孔）相比，成本较低且操作相对简便。因此，该技术最终可通过阐明在自闭症和癫痫等遗传性神经发育障碍患者中发现的特定突变的致病性，以及新致病基因在脑发育过程中的作用，从而改善患者的诊断。首先，在生物安全柜中准备好解剖和培养所需的所有器械。用70%乙醇充分喷洒生物安全柜内的所有器械，并用紫外线照射15至20分钟，对器械和生物安全柜内部进行灭菌。准备收集胚胎时，用70%乙醇大量喷洒已处死的母鼠腹部。用一把无菌镊子提起腹部皮肤，另一只手使用无菌手术剪从腹部剪开皮肤。用第二把无菌镊子和手术剪提起腹膜筋膜并剪开，注意小心操作以避免损伤子宫。使用第三对已灭菌的镊子和剪刀，夹住子宫角并将其从盆腔中剪下。将分离出的子宫角置于一个无菌的60毫米培养皿中，培养皿内盛有添加了氨基酸、维生素和无机盐的神经基础Leibovitz培养基。在无菌生物安全柜中，使用两对精细镊子将胚胎从胎盘中分离，并通过断头法分离出胚胎头部。将一支无菌的3毫升塑料移液管管尖斜向剪切，用其吸取头部，并转移至另一个无菌的60毫米培养皿中，该培养皿内盛有相同的补充神经基础培养基，以洗去血液。再次将头部转移至第三个培养皿中，该培养皿底部铺有凝固的黑色石蜡，并加入神经基础补充培养基。将盛有去头样本并置于神经基础补充培养基中的16毫米培养皿（底部铺有黑色石蜡）放置于生物安全柜内的解剖显微镜下。用左手持精细镊子固定头部，使头部的吻端朝向右侧。然后用右手持纳米注射器，将一到两微升含有染料的质粒溶液注入右侧侧脑室。通过将头部置于电极之间进行电穿孔，负极置于头部背侧并与头部平行，正极置于头部腹侧，以靶向内侧神经节隆起（MGE）。电极精确定位后，在生物安全柜的无菌环境中，开始将脑组织从颅骨中解剖出来。首先，将针头插入双眼以固定头部，注意避免损伤脑组织，同时施加四个方波脉冲，每个脉冲40伏，持续50毫秒，脉冲间间隔500毫秒。然后用一对精细镊子夹住颈部左侧，用另一对精细镊子从后向前撕开颅骨处的皮肤。用一只手的镊子从侧面固定头部的同时，用另一只手的镊子在脑干水平小心地剪开颅骨，并向上提起颅骨。每把镊子均沿矢状面朝前方剪开颅骨，然后向侧方切开，以分离颅骨碎片。然后抬起脑干，小心剪开脑膜和颅神经，直至脑组织完全脱离颅骨。将保持在42摄氏度液态的熔融琼脂糖溶液注入一个35毫米的培养皿中。随后，使用预先剪切过的转移移液管，迅速将电穿孔后的脑组织转移至盛有琼脂糖的培养皿中。使用金属棒搅拌琼脂糖，使脑组织保持在孔的中央，防止其下沉，并将脑组织置于与培养皿平行的头尾平面上。当琼脂糖开始凝固时停止搅拌，以避免对脑组织造成损伤。在等待琼脂糖包埋完全凝固的同时，根据待处理脑组织的数量，向6孔培养板的每孔中加入750 µL添加了N2补充剂的培养基。在每个加满培养基的孔中放入一个30毫米的膜插件。使用剃刀片切割围绕脑组织的琼脂糖，形成一个矩形块，脑组织周围保留1至2毫米的边缘。确保脑的前端与块的前缘垂直，以利于后续切片步骤的定位。将琼脂糖块粘附在振动切片机平台，使吻端朝下，腹侧面向操作者。在4摄氏度条件下，将脑组织切成冠状切片，厚度为250微米。使用灭菌的刮铲收集包含MGE的两到三片切片，并将一只动物的所有脑切片置于同一个30毫米的膜插件上。在小心避免各区域之间重叠的同时，将培养板置于通风良好的无菌培养箱中，在37摄氏度、60%湿度及5% CO2条件下培养48或72小时。达到所需的培养时间后，将感兴趣的区域转移至含有3至5微升培养基的八孔盖玻片中。将盖玻片放入环境培养室，连接至配备计算机辅助采集软件的倒置转盘共聚焦显微镜，以设置延时成像实验。在E13.5时通过电穿孔将表达TD番茄蛋白盒及靶向目的基因的shRNA实验质粒导入神经元，在培养48小时后，可在来自DLX5/6Cre RCE:EGFP小鼠胚胎的脑片组织切片中观察到这些神经元正在进行切向迁移。通过延时活细胞成像对神经元进行连续8小时的可视化观察。在此示例中，可见同一个电穿孔的中间神经元正处于核移动过程中。该神经元在皮层中平行于脑片表面进行切向迁移，最初表现出细长的细胞体，正处于核移动过程。除了尾部突起和分支状的前端突起外，经过三小时的活体成像，核移动已完成。尾部突起已回缩，前端突起则延伸出两个长分支。经过五小时三十分钟后，其中一个主导进程分支已回缩，神经元胞体前移了约10微米。最终，在成像八小时后，迁移暂时停止，神经元再次延伸出主导进程，并出现了一个尾随进程，但细胞核尚未向前移动。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三小时内完成。在实施该过程时，务必始终维持无菌环境。在完成本方案后，还可进一步采用其他方法，例如肌萎缩蛋白电穿孔结合外植体实验，以探究神经元迁移过程中超微结构水平上细胞骨架动态变化的相关机制。

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前子宫内胚胎小鼠脑电穿孔和脊髓切片培养迁移 GABAergic 中间神经元的活体成像

我们介绍一种制备中期妊娠小鼠胚胎的器官型切片的方法，用于外周神经突起的培养和延时成像。...

表达GFP的小鼠胚胎器官型切片培养用于外周神经突起实时成像

介绍了一种从E12.5小鼠胚胎中脑制备器官型脑片的方法。这些器官型脑片培养物可用于观察多巴胺能神经元或其他腹侧中脑神经元的行为。...

胚胎腹侧中脑组织切片培养：一种体外研究多巴胺能神经元发育的体系 in vitro

为了快速评估基因在大脑皮层发育过程中的功能，我们描述了涉及以下内容的方法 离体...

神经元形态发生研究方法 离体 胚胎小鼠大脑皮层中的RNAi电穿孔技术

来源： Wiegreffe, C., 等  利用胚胎小鼠脑组织切片培养进行迁移神经元的延时共聚焦成像 子宫内 电穿孔 J. Vis. Exp. (2017)...

转导小鼠胚胎脑切片中皮层神经元径向迁移的延时成像

来源：Denaxa, M., et al.，化学遗传学改造的皮层中间神经元前体移植至出生后早期小鼠大脑。J. Vis. Exp.

琼脂糖包埋电穿孔辅助的基因转移技术在小鼠皮层中间神经元前体细胞中的应用

神经母细胞迁移是出生后神经发生过程中的基本事件。我们描述了一种通过高效标记神经母细胞的方案 体内...

体内 新生期电穿孔与小鼠急性脑切片中神经母细胞迁移的实时成像

本文介绍了一种用于研究海马发育过程中特定基因调控机制的实验方案。通过采用 子宫外...

Ex Utero 电穿孔与小鼠海马组织的器官型切片培养

本文提供了使用以下方案 在子宫内...

子宫内 研究神经元亚群兴奋性及单细胞连接性的电穿孔技术

本方案提供了直接观察径向迁移皮层神经元的操作指南。In utero...

In Utero 电穿孔法结合脑片培养对小鼠胚胎脑中迁移神经元进行延时共聚焦成像

本方案展示了一种简单且可靠的用于研究的方法 原位 轴突生长与生长锥动态。该方法描述了如何制备 离体...

在体 可视化急性离体胚胎脑切片培养中轴突生长与生长锥动态

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

了解小鼠胚胎脑电穿孔与脊髓切片培养技术，用于活体成像观察GABAergic中间神经元的切向迁移过程。该方法成本低、操作简便，有助于研究基因突变对神经发育的影响，为自闭症和癫痫等神经发育疾病的诊断提供新思路。

Ex Utero 电穿孔及胚胎小鼠脑组织切片培养用于迁移性GABA能中间神经元的活体成像

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