整合影像流式细胞仪和转录组分析, 评估改变的内吞 CD1d 贩运

这些方法集成了下一代测序和流式细胞学成像分析。它可以帮助回答有趣的问题，如一些表型的改变是否涉及，而不是转录组，特别是在污染物暴露环境中。对于我们来说，这种简单方法的主要优点是，我们可以用它来测量具有生物重要作用的蛋白质的结肠化，在功能层面上解释关键微分基因表达的结果。

该技术的含义延伸到病理和毒理学结果的诊断。作为一种正常的成像方法，前向具有将基因表达与蛋白质功能连接的能力。一般来说，由于成像和转录分析的技术要求很高，对这种方法的技术人员将难以为之奋斗。

要对人类单核细胞衍生树突细胞库进行测序，首先将测序和索引试剂分别加载到测序生物合成和索引试剂架上，将机架放在实验室级水浴中一小时，直到所有冰都融化，然后将试剂彻底混合。当试剂解冻时，打开音序器电源，在"不弹出"驱动器出现时将计算机连接到网络驱动器，然后启动音序器控制软件。接下来，在测序生物合成试剂架的每个瓶子中加入约 100 毫升的维护洗涤液，并将漏斗盖拧到每个瓶子上。

在索引试剂架中的每 15 毫升锥形管中加入大约 12 毫升的维护洗涤液，然后丢弃盖。然后将两个机架加载到音序器上。选择音序器控制软件中的维护清洗，然后按照清洁音序器流体系统的说明进行操作。

使用手电筒目视检查流水单元是否有气泡通过车道，以确保没有泄漏。洗涤序列完成后，打开"序列"选项卡，然后开始新的运行，将输出数据定向到网络驱动器。上传样品表进行脱皮处理，并输入相应的试剂信息。

使用用过的流细胞为系统提供测序试剂。群集生成完成后，删除流单元。轻轻喷水。

用透镜纸擦干流动电池，然后用 95% 乙醇进行轻喷。再次擦干流动电池后，检查流动细胞表面对光，以确保它是干净的，没有碎屑或盐残留物。完成主要步骤后，加载聚类流单元，然后开始排序。

序列分析查看器软件将自动启动。大约 26 小时后，通过高序列控制软件监控测序数据质量，并测序分析视图软件以评估数据质量，并进行任何故障排除。然后，当序列完成时，更改流量单元垫片，并在开始下一次运行之前执行维护清洗。

在污染物暴露的树突细胞流式细胞测量后，打开 ImageJ Fiji，根据处理组将非暴露和污染物暴露人类树突状细胞样本组的 100 个保存的细胞图像合并到单独的文件中。要分析两个群体中的 CD1d 和 Lamp1 合并，请打开污染物暴露的 100 个合并单元格图像，然后选择"图像、颜色"和"分割通道"，将图像拆分为两个单独的图像，每个通道具有一个荧光量。要创建全分像素的散点图，请选择"分析、同化和全分阈值"，然后按"打印屏幕"保存散点图。

要计算每个单蜂窝图像的曼德结肠化系数，请使用椭圆形选择工具选择具有分割通道的图像文件上的单细胞图像，然后再次选择"分析、结肠化和结肠化阈值"。然后从"感兴趣区域"对话框中选择"通道 1"，然后单击"确定"。计算所有 100 个单元格图像的系数后，将结果导入适当的电子表格，然后对控制非公开单元格样本重复分析。利用RNA测序和转录数据分析，在污染物暴露的DC中确定了几个主要改变的基因簇，包括脂质代谢和内分泌功能。

在单个细胞图像级别，HLADR阳性CD11c阳性树突状细胞可以根据其CD1d和Lamt1共表达进行封闭。控制非暴露的树突状细胞表现出最小的CD1d和Lamt1蛋白共钙化，表明CD1d内分泌贩运的基础水平，以及生理条件下的高水平表面表达。而CD1d则保留在污染物暴露的树突状细胞的晚期内分泌物中，确认了该实验细胞群体内膜基因轮廓的改变。

将单个蜂窝图像合并到单个图像文件中后，可以根据其荧光表达拆分单个图像，并且两个通道之间的像素强度的合并可以在散点图中可视化。然后，可以使用曼德系数对两个治疗组中的 CD1d 和 Lamp1 蛋白质之间的结肠化程度进行量化。如果蛋白质强度在同化区和非同化区域之间是异质的，则同化强度不会与同化区域平行，因此，根据像素强度进一步评估两种蛋白质的结肠化也很重要。

一旦掌握，图像分析可以在两个小时内完成，如果每项技术都执行得当，RNA测序设置可以在三小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住确保所有试剂正确加载到正确的位置，并且音序器中没有泄漏。按照这个程序，可以执行其他方法，如微RNA、外显体或乳腺细胞测序，分别回答有关全球微RNA表达、基因突变或DNA甲基化的其他问题。

因此，该技术在开发后，将有助于细胞成像分析和下一代测序领域的研究人员探索环境污染物对基因表达和蛋白质功能的影响。看完这段视频后，您应该对如何设置下一代测序以及蛋白质结肠化成像器分析有一个良好的理解。不要忘记，在人体血液样本中使用有毒污染物化学品可能极其危险。

执行这些程序时，应始终采取预防措施，如使用化学烟罩和个人防护设备。