Name: 剪接开关反义寡核苷酸诱导的 SMA 患者成纤维细胞外显子夹杂的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 了解脂质体转染法将反义寡核苷酸导入SMA患者成纤维细胞，评估SMN2基因外显子7包含效率。该方法快速、简便且灵敏，适用于多种反义寡核苷酸化学修饰的筛选与功能验证。

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作者感谢Nicole McRorie在实验方面提供的帮助。本研究得到了阿尔伯塔大学医学与牙科学院、Slipchuk SMA研究基金会研究资助、加拿大卫生研究院（CIHR）、Garrett Cumming研究基金之友、HM Toupin神经科学基金、加拿大肌肉萎缩症协会、加拿大创新基金会、阿尔伯塔省企业与高等教育厅以及妇女与儿童健康研究所（WCHRI）的支持。

1. 细胞培养
<ol>
	<li>在37 °C、CO2 培养箱中，使用生长培养基（DMEM/F12 1:1 混合培养基，含10%胎牛血清（FBS）和0.5%青霉素/链霉素）培养脊髓性肌萎缩症（SMA）患者成纤维细胞。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪测定细胞浓度，将细胞用生长培养基稀释至1 × 105 个细胞/mL，然后接种至合适的培养板中。进行RT-PCR或qPCR时，使用12孔板（每孔1&#160;mL）。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、CO2 培养箱中孵育24小时。</li>
</ol>
2. LNA/DNA 混合物转染
<ol>
	<li>确保细胞汇合度在65&#160;–80%之间，以获得最佳转染效率。</li>
	<li>将10 μM LNA/DNA混合物置于冰上缓慢解冻。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中，将混合物加入无血清培养基中，配制20倍浓度的混合物溶液，终体积为50 μL。</li>
	<li>将混合物溶液与含有3%转染试剂的50 μL无血清培养基（1:1比例）混合。</li>
	<li>室温孵育10分钟。</li>
	<li>向每管中加入900 μL含5% FBS的无血清培养基。</li>
	<li>吸除培养板中的旧培养基，每孔加入1 mL含有转染试剂的LNA/DNA混合物溶液。</li>
	<li>将细胞在37 °C、CO2培养箱中孵育24–48小时。</li>
</ol>
3. RNA 提取
<ol>
	<li>吸去培养基，向细胞中加入 1 mL 异硫氰酸胍-苯酚-氯仿试剂。用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿反复冲洗孔底数次，并将液体收集至 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>高速涡旋振荡 30 秒，于 -80 °C 保存 1 小时或过夜。</li>
	<li>在室温下解冻样品，并充分涡旋振荡。</li>
	<li>加入 200 µL 氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温孵育 3 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下以 12,000 x&#160;g 离心 15 分钟。</li>
	<li>将上层透明的水相转移至新离心管中。注意避免吸取上下两相之间的白色中间层。</li>
	<li>加入 500 µL 异丙醇和 1 µL 8 µg/µL 甘油原（RNA 级）。涡旋振荡 10 秒，室温孵育 10 分钟或 -20 °C 过夜。</li>
	<li>在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 10 分钟，弃去全部上清液。管底将形成白色沉淀。</li>
	<li>加入 1 mL 冷的 75% 乙醇，在 4 °C 下以 7,500 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>彻底去除乙醇，在室温下干燥沉淀，直至管内无残留乙醇。</li>
	<li>将沉淀溶解于 30 µL 无 DNase/RNase 的水中，60 °C 孵育 10 分钟。</li>
	<li>使用分光光度计（260 nm 处）测定 RNA 浓度，并将 RNA 浓度调整至 50 ng/µL。</li>
</ol>
4. 一步法 RT-PCR 检测 SMN2 外显子包含率
<ol>
	<li>将12.5 µL的2x RT-PCR反应缓冲液、1.0 µL一步法RT-PCR酶混合物、每种引物各0.5 µL（SMN2上游引物：5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3'，SMN2下游引物：5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3'，GAPDH上游引物：5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3'，GAPDH下游引物：5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3'）、2 µL总RNA（50 ng/µL）以及8.5 µL无RNase/DNase的去离子水混合。</li>
	<li>在50 °C下反转录15分钟以合成cDNA后，开始PCR反应。对SMN2外显子6-8进行30个PCR循环扩增（94 °C变性15秒，60 °C退火30秒，68 °C延伸25秒）。对GAPDH进行20个PCR循环扩增（94 °C变性15秒，60 °C退火30秒，68 °C延伸20秒）。</li>
	<li>向PCR产物中加入5 μL 6x上样缓冲液，取5 µL混合物上样至2%琼脂糖凝胶中，在100 V电压下电泳40分钟。</li>
	<li>使用ImageJ软件对凝胶成像并进行分析。</li>
	<li>测量全长条带与Δ7条带的强度，通过（全长）/(全长 + Δ7 SMN2)的强度值计算外显子7的包含率。</li>
</ol>
5. 定量 PCR（qPCR）检测SMN2外显子包含率
<ol>
	<li>进行cDNA合成时，混合1 µL Oligo dT、1 µL 10 mM dNTPs和11 µL总RNA（50 ng/µL），在65 °C孵育5分钟。</li>
	<li>将样品置于冰上，向每个样品中加入4 µL 5x缓冲液、1 µL 0.1 M DTT、1 µL RNase抑制剂和1 µL逆转录酶。</li>
	<li>在50 °C孵育60分钟，然后升温至80 °C持续10分钟以终止反应。cDNA可保存在-20 °C。</li>
	<li>用无RNase的水稀释cDNA（1:5稀释）。混合10 µL 2x SYBR Green qPCR酶混合液、每种引物各0.8 µL（10 µM）（全长SMN2上游引物：5′-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3′，全长SMN2下游引物：5′-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3′，Δ7 SMN2上游引物：5′-TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′，Δ7 SMN2下游引物：5′-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3′，GAPDH&#160;上游引物：5′-GCAAATTCCATGGCACCGT-3′，GAPDH&#160;下游引物：5′-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3′）、3 µL稀释后的cDNA以及5.4 µL无RNase的水。</li>
	<li>启动qPCR反应。反应条件为：95 °C预变性30秒，随后进行40个循环，每个循环为95 °C变性5秒，60 °C退火延伸20秒。</li>
	<li>计算全长SMN2相对于GAPDH或Δ7 SMN2的相对表达量，并使用ΔΔCt法对未处理细胞进行归一化处理。</li>
</ol>
6. 蛋白质印迹法
<ol>
	<li>从细胞中移除转染培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。</li>
	<li>加入含有蛋白酶抑制剂的100 µL裂解缓冲液。</li>
	<li>使用无菌细胞刮刀将细胞从每个孔底部刮下，并收集至1.5 mL离心管中。将样品置于冰上孵育30分钟。</li>
	<li>用21号针头反复吹打细胞裂解液10次，以破碎细胞。</li>
	<li>在4 °C条件下以20,800 × g离心15分钟，收集上清液至新的1.5 mL离心管中。样品可储存于-80 °C超低温冰箱中。</li>
	<li>使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，并将浓度调整至1.0 µg/µL。</li>
	<li>取5 µL样品与5 µL 2×十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液（10% SDS；14% 0.5 M Tris-HCl溶液，pH 6.7；1% 0.5 M EDTA-2Na储备液，pH 8.0；20%甘油；0.004%溴酚蓝染料，5% β-巯基乙醇）混合，在70 °C加热10分钟。</li>
	<li>将样品上样至4–12% Bis-Tris蛋白凝胶中，在150 V电压下电泳运行1小时。</li>
	<li>将厚滤纸分别浸入以下缓冲液中：（浓缩阳极缓冲液：0.3 M Tris-HCl，20%甲醇；阳极缓冲液：0.03 M Tris-HCl，20%甲醇；阴极缓冲液：25 mM Tris，20%甲醇，40 mM 6-氨基己酸，0.01% SDS）。</li>
	<li>将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜浸入甲醇中20秒，随后转移至阳极缓冲液中。</li>
	<li>SDS-PAGE结束后，将凝胶在阴极缓冲液中振荡平衡5–10分钟。</li>
	<li>按以下顺序将滤纸、PVDF膜和凝胶放置于半干转印仪中：浓缩阳极缓冲液滤纸/阳极缓冲液滤纸/PVDF膜/蛋白凝胶/阴极缓冲液滤纸（图2）。</li>
	<li>覆盖夹心结构，以20 V电压开始转印，持续30分钟。</li>
	<li>转印完成后，用PBST（含0.05% Tween 20的PBS）洗涤PVDF膜一次。</li>
	<li>用含5%脱脂奶粉的PBST在室温下封闭膜30分钟，或在4 °C封闭过夜。</li>
	<li>将纯化的鼠抗SMN抗体和兔抗Cofilin抗体用含5%脱脂奶粉的PBST按1:10,000稀释，室温孵育1小时或4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用PBST洗涤3次，每次10分钟。</li>
	<li>将二抗（HRP标记的山羊抗鼠IgG（H+L）和抗兔IgG（H+L））用含5%脱脂奶粉的PBST按1:10,000稀释，在室温避光孵育1小时。</li>
	<li>用PBST洗涤膜3次，每次10分钟。</li>
	<li>使用化学发光Western blot检测试剂盒检测蛋白条带信号。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

的 体外 此处描述的评估方法快速、简便，且具有足够的灵敏度，可用于多种反义寡核苷酸（AON）的检测。该方案广泛适用于其他基因的外显子跳跃与包含，以及多种细胞类型。此外，大多数AON化学修饰类型（PMO除外）均可通过此方法进行转染。AON可调控内源性或人工导入基因的pre-mRNA剪接，并可与携带靶基因的质粒载体共转染。
该方法的关键步骤是，在将AONs转染入成纤维细胞时，细胞融合度应约为65%–80%。此条件可能因其他细胞类型而异。AONs转染的最佳浓度也可能不同（0.5–100 nM），具体取决于靶向序列和细胞类型。
该方法并非没有潜在的缺陷。例如，混合修饰寡核苷酸（mixmer）的效率取决于其序列以及LNA/DNA的组成。对于ISS-N1靶点，由LNA构成且在每三个核苷酸位置上以DNA替代LNA的mixmer，其效果优于在每隔一个核苷酸位置进行DNA替代的相同序列mixmer，或全LNA寡核苷酸13。然而，对于其他靶序列，结果可能不同。因此，在进一步研究之前...

脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种以常染色体隐性方式遗传的致命性神经肌肉疾病，其特征是运动神经元退化以及躯干和四肢肌肉进行性瘫痪1,2。大多数SMA病例是由于运动神经元存活基因1（SMN1）发生纯合突变所致3。运动神经元存活基因2（SMN2）是SMN1的一个反向重复拷贝，其序列几乎完全相同，仅存在五个碱基的差异4,5。位于外显子7内的SMN2基因发生C-to-T转换，导致该基因功能几乎丧失，因为该突变使得在近90%的SMN2转录本中关键的外显子7被跳过（图1a）。缺失外显子7的SMN2 mRNA无法弥补SMN1的功能缺陷，因其编码的蛋白质产物不稳定且迅速被降解。
反义寡核苷酸疗法最近已成为治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的一种非常有前景的策略6美国食品药品监督管理局（FDA）最近批准了诺西那生钠（nusinersen），使其成为首个可用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的药物7Nusinersen 是一种18聚体反义寡核苷酸（AON），具有2′-O-甲氧乙基修饰（MOE）和硫代磷酸酯骨架。该药物靶向位于SMN2基因第7内含子内的内含子剪接沉默子N1（ISS-N1）。 SMN2 基因。诺西那生与ISS-N1结合可促进内源性全长功能性SMN蛋白表达的恢复 SMN2 通过诱导外显子7包含来调控基因（图1a)8,9,10目前，许多涉及脊髓性肌萎缩症（SMA）反义寡核苷酸（AON）治疗的研究，正致力于探索可能比诺西那生（nusinersen）更有效且毒性更低的新型AON化学修饰。已有研究表明，采用其他化学修饰的AON同样能高效诱导外显子包含 SMN2 外显子7两者 体外 和 体内11,12,13.
锁核酸（Locked nucleic acids, LNAs）是一类化学修饰的RNA类似物，其结构中含有连接2′-氧和4′-碳的亚甲基桥碳 with the 2′-氧气 在呋喃糖结构内（图1b)14,15与DNA或RNA相比，LNA与互补RNA序列结合的亲和力更高，并且具有高度抵抗内源性核酸酶降解的额外优势。LNA化学已被应用于荧光探针的开发与使用 原位 荧光原位杂交（FISH）和qPCR16,17。此外，它也被用于调控基因表达，包括转录和转录后水平 体外 和 体内GapmeR 反义寡核苷酸（AONs）是由单链DNA分子构成，其5′和3′端侧翼连接多个锁核酸（LNA）。它们通过与靶向mRNA互补结合，激活RNase H，导致mRNA降解，从而实现基因表达的敲低。18LNA/DNA混合寡核苷酸是由DNA核苷酸插入锁核酸（LNA）之间组成的反义寡核苷酸。以这种排列方式，它们可结合miRNA并抑制其功能（LNA-antimiR）。19一些LNA-antimiR已进入临床开发阶段。例如，miravirsen（AntimiR-122）是一种抑制miR-122的LNA-antimiR，用于治疗丙型肝炎病毒感染，目前正在进行多项II期临床试验19,20最近有研究表明，LNA/DNA混合物也能调控RNA剪接21。它可结合特定序列的mRNA，诱导抗肌萎缩蛋白mRNA的外显子跳跃以及外显子包含 SMN2 mRNA 体外13,22.
本文概述了一种利用反义寡核苷酸（AONs）诱导外显子包含，并在RNA和蛋白质水平上评估其效果的方法。为示范该方法，我们采用了靶向SMN2基因第7内含子中ISS-N1位点的LNA/DNA混合体。通过脂质转染将AONs导入脊髓性肌萎缩症（SMA）患者细胞后，可诱导SMN2终末转录本中外显子7的包含，并上调SMN蛋白的表达。使用LNA/DNA混合体诱导外显子包含的优势之一在于，其有效转染浓度显著低于其他化学修饰的寡核苷酸13。该方法适用于多种其他AONs，但不适用于磷酸二酰胺吗啉代寡聚体（PMOs），由于PMOs呈电中性，必须依赖Endo-Porter共转染试剂诱导的内吞作用进入细胞。

<table><tbody><tr><td>脊髓性肌萎缩症成纤维细胞</td><td>Coriell NIGMS 人类遗传细胞储存库</td><td>GM03813</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>无血清培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>转染试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>硫氰酸胍-苯酚-氯仿（TRIzol）</td><td>Thermo Fisher</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR 引物</td><td></td><td></td><td>序列 5' 至 3'</td></tr><tr><td>SMN2 正向引物：&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>CTGCCTCCATTTCCTTCTG</td></tr><tr><td>SMN2 反向引物：&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC</td></tr><tr><td>GAPDH 正向引物：&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>TCCCTGAGCTGAACGGGAAG</td></tr><tr><td>GAPDH 反向引物：&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>GGAGGAGTTTGGTCGCTGT</td></tr><tr><td>qPCR 引物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>全长 SMN2 正向引物：</td><td></td><td></td><td>GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT</td></tr><tr><td>全长 SMN2 反向引物：&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT</td></tr><tr><td>GAPDH 正向引物：&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>GCAAATTCCATGGCACCGT</td></tr><tr><td>GAPDH 反向引物：</td><td></td><td></td><td>AGGGATCTCGCTCCTGGAA</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>糖原，RNA 级</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶混合抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>阴极缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.025 M Tris 碱 + 40&amp;nbsp;mM 6-氨基己酸 + 20% 甲醇</td></tr><tr><td>阳极缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.03 M Tris 碱 + 20% 甲醇</td></tr><tr><td>浓缩阳极缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.3 M Tris 碱 + 20% 甲醇</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜&amp;nbsp;</td><td>GE</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Western 印迹上样/样品缓冲液</td><td>NuPage Invitrogen</td><td>NP007</td><td></td></tr><tr><td>一步法 RT-PCR 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Clontech</td><td>3040</td><td></td></tr></tbody></table>

脊髓性肌萎缩症患者成纤维细胞中剪接转换反义寡核苷酸诱导外显子包含的评估

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种由于运动神经元存活基因1（SMN1）缺失或突变导致SMN蛋白缺乏而引起的致命性神经系统疾病 SMN1，为反义寡核苷酸（AON）介导治疗领域提供了一个独特的案例。尽管 SMN1 突变是导致该疾病的原因，靶向内含子剪接沉默子（ISS）位点的AONs SMN2，包括美国食品药品监督管理局（FDA）批准的诺西那生钠（nusinersen），已被证明可恢复SMN表达并改善症状。目前，许多针对脊髓性肌萎缩症（SMA）的反义寡核苷酸（AON）疗法研究集中在探索靶向新型AON化学结构 SMN2 可能比诺西那生更有效且毒性更低。本文中，我们描述了一种实验方案 体外 使用反义寡核苷酸脂质转染结合逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、定量聚合酶链式反应（qPCR）和蛋白质印迹法评估外显子包含情况。该方法适用于多种类型的反义寡核苷酸化学修饰。通过该方法，我们证明由交替的锁核酸（LNA）与DNA核苷酸（LNA/DNA混聚体）组成的反义寡核苷酸可有效促进外显子包含 SMN2 外显子包含及SMN蛋白在极低浓度下的恢复，因此，基于LNA/DNA混合体的反义寡核苷酸可能是治疗由遗传性疾病引起的剪接缺陷的一种有前景的治疗策略。 体外 此处描述的评估方法快速、简便，且具有足够的灵敏度，可用于测试多种新型反义寡核苷酸（AONs）。

利用脊髓性肌萎缩症（SMA）患者的成纤维细胞，我们针对SMN2基因第7内含子中的ISS-N1沉默区域，转染了八种不同序列的反义LNA/DNA混合体（mixmer），浓度为5 nM（图3）。每种混合体均含有经修饰的硫代磷酸骨架，使其能够抵抗核酸酶降解。为评估这些混合体的效果，采用特异性针对SMN2的引物，通过RT-PCR和qPCR定量分析SMN2外显子7的包含率。在患者细胞中转染混合体#1至#5后，外显子7的包含效率介于78%至98%之间（图4a, b）；而使用相同剂量的混合体#6至#8进行转染时，与对照组相比未观察到显著差异。qPCR分析结果还显示，与对照组相比，混合体#1至#3及#5处理显著增加了全长SMN2 mRNA转录本的含量（图4c）。
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多种反义寡核苷酸（AONs）已被证明可诱导外显子包含（剪接调控），并恢复脊髓性肌萎缩症（SMA）中SMN蛋白的表达。本文描述了一种通过AON脂质转染诱导SMN2基因外显子包含的实验方案，以及用于评估SMA患者成纤维细胞中该干预效果的检测方法。

脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种由SMN1基因缺失引起的致死性神经系统疾病，在反义寡核苷酸治疗领域中具有独特地位……

本脂质体转染方案的总体目标是将反义寡核苷酸导入细胞，并评估这些药物对脊髓性肌萎缩症（SMA）细胞中外显子包含的效果。该方法有助于回答反义治疗领域中的关键问题，例如，新型反义寡核苷酸在为患者提供治疗方面的有效性。该技术的主要优势在于快速、简便，且灵敏度足以检测多种反义寡核苷酸化学修饰。尽管该方法可用于将反义寡核苷酸转染至成纤维细胞，也可应用于其他细胞类型，例如原代成肌细胞及各种其他细胞系。演示该实验操作的是我实验室的技术员 Aleks。首先，将 LNA/DNA 混合修饰寡核苷酸的 10 微摩尔溶液置于冰上解冻。在 1.5 毫升离心管中，用无血清培养基将该混合物稀释至所需浓度。接着，将转染试剂进行稀释，并按 1:1 的比例将稀释后的转染试剂加入到上述混合物中。进行转染时，细胞汇合度应保持在65%至80%左右。若汇合度过高（超过80%），转染效率将下降。随后，将转染试剂混合物于室温孵育10分钟。孵育10分钟后，向离心管中加入900微升含5%胎牛血清的无血清培养基。切勿在转染试剂与LNA/DNA混合物孵育前加入胎牛血清，因为血清也会影响转染效率。随后，吸除培养板中的旧培养基。现在，向培养板中加入一毫升含有LNA/DNA混合物的培养基。然后，将培养板置于37摄氏度的培养箱中孵育24至48小时。孵育结束后，吸除培养板中的培养基。然后，向细胞中加入1毫升GPC试剂。接着，用GPC试剂反复洗涤细胞数次。经过数次洗涤后，将细胞收集至1.5毫升离心管中，并将样品置于冰上保存。接下来，将离心管高速涡旋振荡30秒。然后，在-80°C条件下保存离心管1小时。随后，在室温下解冻样品，并迅速进行涡旋振荡。接下来，向样品中加入 200 µL 氯仿，剧烈振荡 15 秒。然后，在室温下孵育试管 3 分钟。3 分钟后，在 4 °C 条件下以 12,000 ×g 离心 15 分钟。离心结束后，从离心管上层收集水相，然后将水相转移至新管中。接着，向水相中加入 500 µL 异丙醇和 1 µL 浓度为 8 µg/µL 的 RNA 级糖原。将样品快速涡旋振荡10秒，室温孵育10分钟。孵育结束后，在4°C条件下以12,000 g离心10分钟。运行结束后倾去上清液。加入1 mL冷的75%乙醇，短暂涡旋以洗涤获得的沉淀。再次在4°C、7500 g条件下离心样品5分钟。然后，弃去所有乙醇，并在室温下干燥沉淀。离心沉淀干燥后，用30 µL无DNA酶/RNA酶的水溶解。然后将样品在60 °C下孵育10分钟。接着，在分光光度计中于260 nm处测定RNA浓度，并将其调整至15 ng/µL。配制RT-PCR预混液时，加入两倍浓度的RT-PCR反应缓冲液、一步法RT-PCR酶混合液、上下游引物以及无RNase/DNase的去离子水。将预混液分装至0.2毫米PCR管中，然后加入各相应样本的总RNA。随后启动PCR反应。 反转录PCR完成后，向扩增产物中加入5微升6×上样缓冲液。然后，取5微升该混合物上样至2%琼脂糖凝胶中。以100伏电压电泳40分钟。首先，研究不同混合修饰寡核苷酸（mixmer）的效率。为此，分析转染了混合修饰寡核苷酸的脊髓性肌萎缩症（SMA）成纤维细胞中SMN2外显子7的包含情况以及GAPDH的表达水平。凝胶图像显示了外显子7的包含情况，其中上条带和下条带分别代表包含和未包含外显子7的SMN2 RNA。当使用混合物一至五转染时，包封效率也被量化为78%至98%。另一方面，与对照组相比，使用混合物六至八转染患者脊髓性肌萎缩症成纤维细胞时，未获得显著结果。在该实验中，GAPDH被用作对照。接下来，通过定量 PCR 分析全长 SMN2 相对于 GAPDH 的相对表达水平。与对照组相比，在转染了混合反义寡核苷酸 1 至 3 号及 5 号后，SMN2 转录水平的数量显著增加。同时检测了 SMN 蛋白的表达水平，结果显示，在转染了混合反义寡核苷酸 1 至 5 号的患者成纤维细胞中，SMN 蛋白表达水平也有所升高。观察到SMN蛋白水平显著升高1.5至1.9倍。此处使用的对照为cofilin。相反，mixmer 6至8对SMN蛋白的表达水平无影响。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将反义寡核苷酸转染至成纤维细胞，并在体外评估其转染效果。

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剪接开关反义寡核苷酸诱导的 SMA 患者成纤维细胞外显子夹杂的评价

串联剪接事件发生在相距不到12个核苷酸的位点之间。利用绝对定量PCR方法可以实现对这类剪接变异体比例的定量分析。本文描述了如何对STAT3基因的剪接变异体进行定量，该基因存在两个剪接事件，导致丝氨酸-701的包含或缺失以及α/β型C末端的产生。...

融合绝对定量与相对定量PCR数据以定量STAT3剪接变异体转录本

本报告介绍了一种生物工程技术，用于设计和构建新型人工剪接因子（ASFs），以特异性调控哺乳动物细胞中靶基因的剪接过程。该方法可进一步拓展，用于构建多种人工因子，以操控RNA代谢的其他方面。...

在人类细胞中设计人工因子以特异性调控选择性剪接

利用RNA对小鼠脑切片中pre-mRNA选择性剪接进行定量分析 原位 杂交实验

本文介绍了在存在靶向RNA的小分子的情况下，通过引物延伸分析法（SHAPE）进行体外和细胞内选择性2'-羟基乙酰化的详细实验方案，以确定pre-mRNA目标序列的二级结构。...

利用体外和细胞内SHAPE技术研究小分子诱导的pre-mRNA结构变化

在此，我们通过Sanger测序、RT-PCR和蛋白质印迹法对临床试验中抗肌萎缩蛋白38的表达进行了分子表征。...

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脊髓性肌萎缩症患者成纤维细胞中剪接转换反义寡核苷酸诱导外显子包含的评估

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