脊髓性肌萎缩症患者成纤维细胞中剪接转换反义寡核苷酸诱导外显子包含的评估

本脂质体转染方案的总体目标是将反义寡核苷酸导入细胞，并评估这些药物对脊髓性肌萎缩症（SMA）细胞中外显子包含的效果。该方法有助于回答反义治疗领域中的关键问题，例如，新型反义寡核苷酸在为患者提供治疗方面的有效性。

该技术的主要优势在于快速、简便，且灵敏度足以检测多种反义寡核苷酸化学修饰。尽管该方法可用于将反义寡核苷酸转染至成纤维细胞，也可应用于其他细胞类型，例如原代成肌细胞及各种其他细胞系。演示该实验操作的是我实验室的技术员 Aleks。

首先，将 LNA/DNA 混合修饰寡核苷酸的 10 微摩尔溶液置于冰上解冻。在 1.5 毫升离心管中，用无血清培养基将该混合物稀释至所需浓度。接着，将转染试剂进行稀释，并按 1:1 的比例将稀释后的转染试剂加入到上述混合物中。

进行转染时，细胞汇合度应保持在65%至80%左右。若汇合度过高（超过80%），转染效率将下降。随后，将转染试剂混合物于室温孵育10分钟。

孵育10分钟后，向离心管中加入900微升含5%胎牛血清的无血清培养基。切勿在转染试剂与LNA/DNA混合物孵育前加入胎牛血清，因为血清也会影响转染效率。随后，吸除培养板中的旧培养基。

现在，向培养板中加入一毫升含有LNA/DNA混合物的培养基。然后，将培养板置于37摄氏度的培养箱中孵育24至48小时。孵育结束后，吸除培养板中的培养基。

然后，向细胞中加入1毫升GPC试剂。接着，用GPC试剂反复洗涤细胞数次。经过数次洗涤后，将细胞收集至1.5毫升离心管中，并将样品置于冰上保存。

接下来，将离心管高速涡旋振荡30秒。然后，在-80°C条件下保存离心管1小时。随后，在室温下解冻样品，并迅速进行涡旋振荡。

接下来，向样品中加入 200 µL 氯仿，剧烈振荡 15 秒。然后，在室温下孵育试管 3 分钟。3 分钟后，在 4 °C 条件下以 12,000 ×g 离心 15 分钟。

离心结束后，从离心管上层收集水相，然后将水相转移至新管中。接着，向水相中加入 500 µL 异丙醇和 1 µL 浓度为 8 µg/µL 的 RNA 级糖原。

将样品快速涡旋振荡10秒，室温孵育10分钟。孵育结束后，在4°C条件下以12,000 g离心10分钟。运行结束后倾去上清液。

加入1 mL冷的75%乙醇，短暂涡旋以洗涤获得的沉淀。再次在4°C、7500 g条件下离心样品5分钟。然后，弃去所有乙醇，并在室温下干燥沉淀。

离心沉淀干燥后，用30 µL无DNA酶/RNA酶的水溶解。然后将样品在60 °C下孵育10分钟。接着，在分光光度计中于260 nm处测定RNA浓度，并将其调整至15 ng/µL。

配制RT-PCR预混液时，加入两倍浓度的RT-PCR反应缓冲液、一步法RT-PCR酶混合液、上下游引物以及无RNase/DNase的去离子水。将预混液分装至0.2毫米PCR管中，然后加入各相应样本的总RNA。随后启动PCR反应。

反转录PCR完成后，向扩增产物中加入5微升6×上样缓冲液。然后，取5微升该混合物上样至2%琼脂糖凝胶中。以100伏电压电泳40分钟。

首先，研究不同混合修饰寡核苷酸（mixmer）的效率。为此，分析转染了混合修饰寡核苷酸的脊髓性肌萎缩症（SMA）成纤维细胞中SMN2外显子7的包含情况以及GAPDH的表达水平。凝胶图像显示了外显子7的包含情况，其中上条带和下条带分别代表包含和未包含外显子7的SMN2 RNA。

当使用混合物一至五转染时，包封效率也被量化为78%至98%。另一方面，与对照组相比，使用混合物六至八转染患者脊髓性肌萎缩症成纤维细胞时，未获得显著结果。在该实验中，GAPDH被用作对照。

接下来，通过定量 PCR 分析全长 SMN2 相对于 GAPDH 的相对表达水平。与对照组相比，在转染了混合反义寡核苷酸 1 至 3 号及 5 号后，SMN2 转录水平的数量显著增加。同时检测了 SMN 蛋白的表达水平，结果显示，在转染了混合反义寡核苷酸 1 至 5 号的患者成纤维细胞中，SMN 蛋白表达水平也有所升高。

观察到SMN蛋白水平显著升高1.5至1.9倍。此处使用的对照为cofilin。相反，mixmer 6至8对SMN蛋白的表达水平无影响。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何将反义寡核苷酸转染至成纤维细胞，并在体外评估其转染效果。