基于均相时间分辨Förster共振能量转移的胰岛素分泌检测方法

本实验的总体目标是诱导并准确测定胰岛素分泌细胞所分泌的胰岛素水平。该方法有助于解答糖尿病研究领域中的关键问题，例如胰腺β细胞中葡萄糖刺激胰岛素分泌的主要机制。该技术的主要优势在于能够准确、快速地量化葡萄糖刺激下的胰岛素分泌，并检测潜在药物对分泌功能的影响。

该技术的应用前景涉及2型糖尿病的治疗和药物发现，因为它将帮助我们更深入地理解药物诱导的代谢功能障碍的机制。尽管该方法可用于研究永生化β细胞系的胰岛素分泌，但也同样适用于其他系统，例如完整的胰岛组织。通常，初次接触该方法的研究人员会面临一定困难，原因在于涉及多个细胞操作步骤和药物配制过程。

我们最初想到这一方法，是希望开发一种快速检测技术，用于研究多巴胺能药物对胰岛素分泌的作用。该方法的可视化演示至关重要，因为细胞操作步骤较难掌握，这源于细胞本身的脆弱性，以及确保不同实验间检测结果一致所必需的精确操作。首先，按照文本方案中所述步骤培养INS-1E细胞。

当细胞达到预期汇合度时，吸除培养基。用5毫升磷酸盐缓冲液清洗细胞。随后，向细胞中加入0.5毫升0.25%胰蛋白酶，然后将细胞置于37摄氏度培养箱中孵育3至4分钟。

加入9毫升完全培养基以终止胰蛋白酶的消化作用。接着，将细胞转移至15毫升离心管中。然后离心细胞以形成沉淀。

离心后，将沉淀物溶解于5毫升新鲜培养基中。从离心管中吸取10微升重悬的细胞，与10微升台盼蓝活体染料混合，以评估细胞活力。接着，使用血细胞计数板对活细胞和死细胞进行计数，确保90%的细胞处于存活状态。

计数后，将每毫升新鲜 RPMI 1640 培养基中加入一百万个细胞，然后在每孔加入含有 50 万个 INS-1E 细胞的 0.5 毫升细胞悬液，接种于预先用多聚-L-赖氨酸包被的 24 孔板中。将培养板放入培养箱中培养一整天。次日，吸去培养液，并向每孔中加入 500 微升新鲜 RPMI 1640 培养基。

将培养板继续孵育24小时，使细胞在孔板表面充分铺展。进行检测前，首先配制KRB缓冲液，然后吸去各孔中的培养基，用预热的磷酸盐缓冲液洗涤两次。接着，每孔加入450 µL KRB缓冲液，其中添加牛血清白蛋白，但不含葡萄糖。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育1小时。用KRB缓冲液配制药物的系列稀释液，并加入葡萄糖使其终浓度为200毫摩尔/升（10倍浓度）。葡萄糖饥饿步骤结束后，用移液器向各对应孔中加入50微升系列稀释的药物溶液。

进行葡萄糖刺激时，在含有20毫摩尔葡萄糖的条件下加入相应系列稀释的药物。然后将细胞在37摄氏度孵育90分钟。刺激结束后，收集上清液并转移至标记好的1.5毫升离心管中。

将每份收集的上清液各取10微升转移至96孔板中。向每个孔中加入90微升KRB，以获得1:10的稀释比例。混匀稀释液，确保均匀一致。

然后，为HTRF胰岛素检测法绘制胰岛素标准曲线。接着，将各10微升的标准胰岛素样品和稀释后的检测上清液分别加入96孔板中。在检测缓冲液中按1:2的供体与受体比例配制抗体混合液。

抗体混合物配制完成后，取30微升加入96孔板的每个孔中。密封反应板并在室温下孵育。孵育两小时后，使用酶标仪读取反应板中抗体混合物的信号。

使用适当的HTRF光学模块在665和620纳米波长下进行读数，每孔使用200次闪光。首先绘制胰岛素标准曲线，以从检测样品中推算出胰岛素的实际值。标准曲线显示，所获得的比率荧光读数随预设的标准人胰岛素浓度的增加而显著升高。

接下来，在存在或不存在 20 毫摩尔葡萄糖的条件下，研究 INS-1E 细胞的基础胰岛素分泌水平。从图中可以看出，存在葡萄糖时，细胞分泌的胰岛素量约为 100 纳克/毫升。有趣的是，在无葡萄糖条件下，胰岛素水平几乎减半，约为 15 纳克/毫升。

接下来，将细胞在含有不同浓度多巴胺和 20 毫摩尔葡萄糖的环境中孵育。所分泌的胰岛素量以每个孔中最大胰岛素分泌百分比的平均值进行标准化。结果表明，多巴胺可抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS），从而提示多巴胺能受体在 GSIS 中具有重要的功能作用。

该图显示，溴隐亭（一种2型糖尿病药物）在诱导葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）方面比多巴胺更具效力。该图还显示，随着D2受体激动剂喹吡罗浓度的增加，尽管其效率低于溴隐亭，但在刺激GSIS方面与多巴胺具有相似的效力。一旦掌握该技术，若操作得当，可在四到五小时内完成。

在进行该操作时，重要的是要注意移液时务必小心且保持一致。完成该操作后，可进一步开展其他功能检测，例如环磷酸腺苷HDRF检测，以回答更多问题，如多巴胺能药物对下游信号通路的影响。该技术建立后，为代谢领域研究人员探索永生化细胞系和胰岛组织中的其他内分泌分泌通路奠定了基础。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用 HDRF 准确测量细胞的胰岛素分泌。