用光片荧光显微镜观察运动轴突导航和小鼠胚轴突树枝状的定量化
May 11th, 2018
在这里, 我们描述了一个协议, 以可视化的运动神经元投射和轴突树枝状在转基因 Hb9::GFP 小鼠胚胎. 在对运动神经元进行染色后, 我们用光片荧光显微镜对图像胚胎进行了定量分析。本协议适用于中枢神经系统的其它神经元导航过程。
该协议的总体目标是允许使用光片显微镜和图像分析软件对小鼠胚胎进行运动神经元轴突树枝化模式的定性和定量评估。这种方法可以帮助理解运动神经元与复杂运动的协调发育。这项技术的主要优点是您可以从不同角度观察和成像运动神经元的轴突树枝化模式，并定量分析每条神经。
演示该程序的是我实验室的两名研究生 Ya-Ping Yen 和 Ee Shan Liau。要开始此过程，将胚胎单独固定在 24 孔板中，每孔加入 1 毫升新鲜制备的 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，在 4 摄氏度下在摇床上过夜。第二天，用 1 毫升 1X PBS 洗涤固定的胚胎至少 3 次，每次 5 到 10 分钟，并在 4 摄氏度下孵育过夜。
接下来，在摇床上将每个胚胎在 1 毫升 0.5% PBST 中透化过夜，并在 4 摄氏度下过夜。用 1 毫升 10% FBS 封闭每个样品，该 FBS 溶于 1X PBS 中，在 4 摄氏度下在摇床上过夜。随后，将每个胚胎与 1 毫升抗 GFP 一抗在 4 摄氏度下孵育 72 小时，同时不断摇晃。
一抗孵育后，在 4 摄氏度下用 1 毫升 0.5% PBST 在 1 到 2 天内洗涤每个胚胎。然后，涂抹 1 毫升二抗，并在 4 摄氏度的黑暗中持续摇晃孵育过夜。第二天，用 1 毫升 0.5% PBST 在 4 摄氏度下在摇床上洗涤每个胚胎至少 3 次，持续 2 到 3 天。
然后，将每个胚胎在折射率为 1.49 nd 的商业透明试剂中，在 1.5 毫升试管中避光孵育过夜。设置 5X/0.1 照明光学元件和 5X/0.16 检测光学元件。组装样品架和样品毛细管。
通过用透明溶液填充样品室来准备样品室。要安装胚胎，请准备 P200 移液器吸头，切掉上部，使其适合毛细管的直径，并去除用于样品附件的尖头部分。然后，使用小火焰熔化移液器吸头的钝端。
熄灭火焰，并迅速将胚胎垂直连接到熔化的一端。将移液器吸头的上部与样品毛细管安装，然后将准备好的样品室放入显微镜中。使用成像软件，选择 定位 选项卡下的定位毛细管，然后调整 X、Y 和 Z 轴。
接下来，选择 Locate Sample 并缩放到 0.6X 以专注于胚胎。让腔室缓冲液与胚胎平衡一段时间，以清除任何碎屑或气泡。对于图像采集，在 Acquisition 选项卡下，定义光路参数，例如 Detective Objectives、Laser Blocking Filter、Beam Splitter、Cameras 和 Lasers。
选中 Pivot Scan 复选框以减少阴影。然后，定义采集设置，将 Bit Bepth 设置为 16 位，缩放到 0.36 到 0.7 倍之间的范围，单点照明或双点照明。单击 Continuous 并设置 Laser Intensity、Exposure Time、Laser Power 和 Light Sheet Position。
随后，按 Stop 停止 结束图像采集。重要的是要确保透明样品位于最短的光程内，以便详细采集单个运动神经上精细树枝状结构的图像。对于多维采集，通过移动第一个和最后一个图像的 z 位置来定义 Z 堆栈。
单击 Optimal 以设置切片编号。然后，单击 Start Experiment 以获取选定的 Z 堆栈。完成后，以 czi 格式保存图像。
要量化轴突树枝化，请在想象分析软件中打开图像文件。使用 Display Adjustment （显示调整） 窗口调整图像颜色、亮度和对比度，以根据局部强度对比度检测细丝。接下来，单击 Add New Filaments 图标，然后在下拉菜单中选择 Autopath Algorithm。
选择感兴趣的区域，然后通过分配最大和最薄的直径测量值来定义起点和种子点，这些测量值可以使用 Slice 模式进行测量。在感兴趣区域的边缘分配一个起点。要实现手动添加或删除起点，请首先更改指针模式，导航选择，然后按住 Shift 键并右键单击目标点。
接下来，为种子点选择手动阈值，以确保标记所有可见的树枝化。然后，手动添加或删除种子点。选中 Remove Disconnected Segments 复选框并移除起点周围的种子点。
随后，调整 背景减法的阈值 并完成该过程。有必要去除背景伪影并确认检测器路径反映真实的轴突树枝化，以便准确定量。最后，选择所需的样式和颜色。
在 Statistics 选项卡下，选择 Detailed 并使用 filament number， dendrite terminal points 来量化运动神经末梢作为运动轴突树枝形成的指标。然后，将重建轴突的图像导出为 tiff 文件。LSFM 提供小鼠胚胎中运动轴突树枝化的详细 3D 可视化。
运动神经元受上述方案的约束，并用转基因表达的 GFP 标记。为了更详细地对轴突树枝化进行成像并进行量化，可以调整放大倍率，以便揭示每个细小的树枝状结构。最后，可以使用图像分析软件重建单个前肢神经的轴突树枝化模式。
软件中的自动路径算法追踪细丝并量化轴突末端的总数。观看此视频后，您应该对如何使用光片荧光显微镜制备小鼠胚胎的样品和对运动神经元轴突进行成像有很好的了解。此外，您将知道如何通过 MRS 定量评估每个运动神经的树枝化模式。
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概览
本研究提出了一种在转基因Hb9::GFP小鼠胚胎中可视化运动神经元投射和轴突分支的协议。使用光片荧光显微镜，该方法能够定性和定量评估轴突模式，推进了对运动神经元发育的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经发育
- 成像技术
背景
- 该协议关注运动神经元，对于协调复杂的运动至关重要。
- 运动神经元轴突分支对于功能性神经电路至关重要。
- 理解这些模式可以揭示神经发育过程中的洞察。
研究目的
- 可视化和定量分析运动神经元轴突分支。
- 建立一种可适用于其他神经元导航过程的方法。
- 增强我们对小鼠胚胎中运动神经元发育的理解。
使用的方法
- 主要平台是光片荧光显微镜。
- 在Hb9启动子下表达GFP的小鼠胚胎作为生物模型。
- 通过免疫染色和透明化技术在成像前对胚胎进行处理。
- 关键步骤包括样本的固定、通透化和抗体孵育。
主要结果
- 研究结果证实能够以3D形式可视化轴突分支的细节。
- 定量分析有助于评估个别运动神经的分支模式。
- 该方法允许调整放大倍数以揭示复杂的结构。
结论
- 该研究展示了一个分析运动神经元发育的稳健协议。
- 该方法增强了对神经元行为的洞察，并可能在其他研究中应用。
- 研究结果为运动背后的神经机制的更广泛理解做出了贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing motor axon navigation and arborization in mouse embryos provides mechanistic insights into neurodevelopmental processes relevant to target validation in neurodegenerative disease models. Quantitative assessment of axon terminal patterns supports predictive confidence in evaluating genetic or pharmacological interventions affecting motor neuron connectivity. This approach enables early de-risking of therapeutic hypotheses by linking molecular perturbations to structural phenotypes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing motor axon trajectory defects in genetic mutants or disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative analysis of axon arborization as a phenotypic readout.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by correlating molecular changes with neurodevelopmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible 3D imaging data suitable for high-content screening of compound libraries.
- Quantitative Output: Provides filament number and terminal point measurements enabling dose-response analysis of axon growth inhibitors or enhancers.
- Scalability: Compatible with clearing and immunostaining workflows adaptable to multi-well embryo processing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to motor neuron disease models (e.g., ALS, SMA) using Hb9::GFP reporter lines to assess axonal pathology.
- Translational Continuity: Bridges discovery phenotypes to preclinical validation by quantifying arborization deficits predictive of functional impairment.
- Biomarker Alignment: Axon terminal counts serve as quantifiable histopathological endpoints correlating with motor circuit integrity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing structural phenotyping downstream of target engagement and upstream of functional behavioral assays in motor neuron disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of axon guidance molecules via qualitative and quantitative arborization profiling.
- Screening: Enables assay standardization through consistent clearing, staining, and imaging parameters across genetic backgrounds.
- Analytics: Generates morphometric data (filament count, terminal points) for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural phenotypes to functional outcomes in preclinical models of motor neuron degeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for neurodevelopmental and neurodegeneration programs across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in motor neuron development studies through direct visualization of axon patterning.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized fixation, clearing, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural validation of target modulation in neurodevelopmental pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on axon arborization profiles in disease-relevant embryonic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, immunostaining, and optical clearing techniques.
- Dependent on access to light sheet fluorescence microscopy and compatible image analysis software (e.g., Imaris).
- Necessitates standardization of antibody incubation and washing steps to minimize variability in GFP signal detection.
- Adaptation to alternative models may require optimization of clearing reagents and refractive index matching.
- Practical limitations include embryo size constraints and potential signal quenching during prolonged clearing or storage.
