使用微电极阵列记录和调控啮齿类动物脑片中的癫痫样活动

该方法有助于解答癫痫治疗神经调节领域中的一些关键问题，例如最适合的脑区和刺激方案是什么。该技术的主要优势在于，啮齿类动物脑片代表了简化的、接近真实的脑回路模型，而微电极阵列则能够在已知电极间距的条件下实现多个观测点的同时记录。准备MEA时，将弹性密封剂均匀涂抹在记录室的底面，并确保无气泡产生。

接下来，使用镊子将记录室安装到MEA上，并施加轻柔的压力。在记录室的外缘涂抹一层密封剂。然后，将MEA/记录室组件置于密闭的湿润环境中，并在室温下静置过夜使其固化。

准备记录工作台时，将温浴设置为32摄氏度。接着，将保存用人工脑脊液（ACSF）倒入保存室和预热室中。用95%氧气和5%二氧化碳的混合气体对溶液进行鼓泡，并使用倒置的巴斯德移液管去除任何滞留的气泡。

将孵育室置于室温环境中，并将预热室放入温水浴中。按照标准操作流程制备水平海马-皮层脑片，并在室温下的孵育室中恢复至少60分钟。将4AP人工脑脊液倒入孵育 chamber 中。

然后，用95%氧气和5%二氧化碳的混合气体通入溶液，使用倒置的巴斯德移液管去除任何滞留的气泡。随后，盖上孵育 chamber，并将其转移至温浴中。确保预加温的ACSF溶液和4AP ACSF溶液的温度为30至32摄氏度。

使用倒置的玻璃巴斯德移液管将一片脑切片转移至预热室中，让组织静置 25 至 30 分钟。随后，将脑切片转移至含 4AP ACSF 的孵育室，静置 60 分钟。让 4AP ACSF 流经灌注管进入烧杯，直至管内无气泡存在。

然后，停止溶液流动。将干燥的MEA芯片放入MEA放大器中，并固定放大器头部。随后，使用塑料巴斯德吸管将4AP ACSF转移至记录室的入口和出口储液池中。

将加热套管固定在磁性支架上，并将其尖端放入记录室的进样口内。然后，将磁性支架固定在MEA放大器头部的磁条上。将灌流管路连接至套管，并将套管连接至恒温器。

随后，将吸液针放入出口储液槽中。通过将吸液针浸入ACSF并检查是否存在持续的低频吸液声音，确认是否产生负压。接下来，调节流量控制器，使流速达到每分钟1毫升，并开始灌流。

当4AP人工脑脊液流经套管后，打开恒温器。将加热套管温度设为37摄氏度，MEA底座温度设为32摄氏度，以使记录室内的温度达到32至34摄氏度。然后，将外部参考电极置于记录室入口处的储液槽中。

当4AP人工脑脊液（ACSF）液面和记录温度稳定至所需水平后，将灌流和吸液旋塞转至关闭位置，以暂时停止灌流和吸液。使用倒置的玻璃巴斯德移液管，迅速将一片脑组织转移至MEA记录室中。根据需要，使用火焰抛光的弯头巴斯德移液管或柔软、紧凑的小刷子调整脑片在MEA记录区域上的位置。

将固定锚放置在脑切片上。通过将旋塞重新转回开启位置，恢复灌注和吸引。使用安装在倒置显微镜载物台上的相机拍摄脑切片图像。

然后，在计算机软件中运行 mapMEA 脚本以启动用于映射电极的图形用户界面。单击“浏览”按钮以加载脑切片图像。确保参考电极出现在 MEA 左半侧上方一列的位置。

然后，点击“激活指针”按钮。在阵列最左侧一列中选择顶部和底部电极，以标记用于图像校正和电极定位的 XY 坐标。从切片类型下拉菜单中选择“水平”。

勾选“默认结构”复选框。使用脑切片图像下方的数字按钮，选择与感兴趣区域（ROI）对应的电极，然后在结构面板中点击相应的按钮进行分配。对每个感兴趣区域重复此步骤。

然后，按下保存按钮。软件将生成一个结果文件夹，其中包含报告所选电极和感兴趣区域（ROIs）的表格。对于电生理学研究，在开始刺激方案前至少10分钟打开刺激单元，以使其完成自校准和稳定。

然后，启动刺激控制软件，并通过刺激控制软件主面板上的绿色指示灯确认刺激器和MEA放大器已正确连接。将刺激设置为双极配置，并将刺激单元连接至接地端。

然后，在使用 mapMEA 脚本定位的电极对中，连接与 CA1 区/近端下托锥体细胞层接触的电极对。为获取数据，在记录软件主面板上点击播放按钮。至少记录四次痫性放电。

接下来，运行快速输入/输出测试以确定最佳刺激强度。为此，请使用主面板设计一个每相持续时间为 100 微秒的方波双相正负电流脉冲。在脉冲幅度选项卡中，输入每相 100 微安的初始脉冲幅度。

通过设置不短于五秒的脉冲间隔，将刺激脉冲频率设定为0.2赫兹或更低。在每次试验中以50至100微安培的步长逐步增加刺激强度，直至刺激能够稳定地在旁海马皮层诱发类似发作间期的事件。对于边缘系统癫痫发生的电调控，应编程刺激装置以实施感兴趣的刺激方案，并采用在输入/输出测试期间确定的刺激强度。

刺激停止后，通过记录至少四次痫样放电，验证网络是否恢复至刺激前状态。该图显示了在对照条件下、1 Hz 周期性 pacing 期间以及停止刺激后恢复期间，内嗅皮层和嗅周皮层中由 4AP 诱导的痫样活动的记录结果。该图展示了 1 Hz 周期性 pacing 效应的定量分析，表明在刺激期间总发作时间显著减少。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在三到四小时内完成。在进行此操作时，重要的是要记住迅速而准确地将脑片放置于MEA上。在此步骤完成后，还可采用其他方法，如药理学干预，以进一步探究神经递质或离子通道在癫痫样活动中的作用，以及神经调节的影响。

该技术问世后，为神经科学领域的研究人员探索培养神经元及脑片中健康与疾病状态下的神经网络相互作用开辟了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何记录并利用微电极阵列（MEA）对由4-氨基吡啶在啮齿类动物脑片中诱导的癫痫样活动进行电生理记录与调控。