Name: 鼠脑切片偶联微电极阵列癫痫活性的记录与调控 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习使用微电极阵列记录和调控鼠脑切片中的癫痫样放电活动。该方法通过4-氨基吡啶诱导癫痫样活动，结合定制图形界面实现实时电极映射与刺激优化，为癫痫神经调控治疗提供可靠的实验方案。

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G.P. 是欧洲联盟“地平线2020”框架计划下MSCA-IF-2014项目Re.B.Us（项目编号：660689）资助的玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里学者。GUI地图MEA可向作者ilaria.colombi@iit.it申请免费获取。

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作者无任何利益冲突需要披露。

多电极阵列（MEAs）是神经生理学研究中不可或缺的工具，得益于数十年的探索与发展，近年来已趋于成熟。与传统的场电位记录相比，MEA具有显著优势，即可提供更多的观测点以及明确的电极间距，这对于精确定位神经元网络间的相互作用至关重要。
MEA 记录技术还可与其他电生理学方法结合使用，例如膜片钳记录15，以研究单个神经元活动与神经网络活动之间的关系。此外，同时可视化场电位和多单元活动的可能性，可为小规模神经元群体活动与集体神经网络活动之间的相关性提供宝贵的见解。与电压敏感性染料、钙成像和光遗传学29相结合，能够通过多角度方法推断神经生理学现象。除了药理学研究外，同一系统既可记录又可刺激的特性使 MEA 记录技术具有极强的功能性和广泛的应用性：例如，利用本文介绍的神经调节方案，可研究记忆形成核心的突触可塑性现象30，这些方案与用于治疗癫痫及多种脑部疾病的深部脑刺激（DBS）密切相关。最近的研究已证实，MEA 记录技术可成功应用于人类癫痫脑组织16，这表明该技术在癫痫研究中具有不可估量的价值，不仅有助于理解这种毁灭性疾病的基本机制，还可优化 DBS 算法以改善治疗效果。
然而，由于MEA需要使用浸没式记录室，并要求脑片直接放置在集成了微电极的固体基底上，这使得脑片电生理实验不得不在“受限”条件下进行。因此，脑组织可能无法获得充足的氧气供应，进而影响记录质量。
本文所述方案可利用急性离体4AP模型，结合微电极阵列（MEA）可靠地记录和研究啮齿类动物边缘系统网络中的癫痫发生过程，并实现长时间的电刺激，从而为评估深部脑刺激（DBS）策略提供重要信息。
基于传统场电位记录研究癫痫边缘网络电神经调节的既往研究中，使用小鼠或大鼠脑片所得结果相似24,25；但大鼠脑组织的使用更具挑战性，这可能与其相比小鼠脑组织连接性较弱有关7。就微电极阵列（MEA）技术而言，由于小鼠脑片尺寸较小，更适用于该技术。此外，由于小鼠脑组织中类发作样放电的发生率高于大鼠，因此在一次实验日内可检测更多脑片，从而加快数据采集速度、提高效率，并减少实验动物的使用数量。
相对于现有方法的意义：
使用本文所述定制记录室记录到的痫样放电在持续时间和发生频率上似乎与使用传统MEA环形记录室及相同类型MEA（平面微电极，参见 17）所观察到的结果相似。然而，必须强调的是，当使用传统的圆形记录室并配合低灌流速率（1 mL/min）时，脑片厚度必须显著减小，这可能因连接性较差而妨碍神经调控实验的顺利进行。
在此方案中，一种受膜片钳记录 chamber 设计启发的低体积定制记录 chamber 提供了稳定且可靠的层流，这对于成功进行 MEA 记录至关重要；同时，该设计允许将脑片厚度增加至 400 µm，从而在组织存活率与内在连接性之间实现合理平衡。事实上，人们普遍认为，记录 chamber 内记录液的层流在脑片电生理实验中极为理想，因其不受在环形流动式圆形记录 chamber 中常见的温度、氧气和 pH 梯度的影响。

关键词：MEA 记录，脑片，电生理学，层流，记录 chamber，膜片钳，组织存活率，内在连接性19,20,31 （如商业化的多电极阵列所配备的那些）。此类梯度会引入实验偏差，并对脑片产生不利影响。使用体积相对较小的记录室（约1.5 mL）并结合高灌流速率（5 -&#160;6 mL/min)16,31 确保灌注液充分交换（≥3次/分钟）。该定制腔室可从商业渠道以合理价格轻松购得，或使用3D打印技术在实验室内部制备。其他研究已报道从400 µm厚的人脑切片获得MEA记录16 使用传统的MEA环形室，保持ACSF体积为1 mL，并借助低噪音蠕动泵实现高灌注速率（5–6 mL/min）。然而，作者采用了一种不同的癫痫发生模型， 即，低浓度 Mg2+，这一体系受涉及显著升高细胞外K+的电紧张机制影响的可能性较4AP模型更小+ 浓度11,22我们发现，在4AP模型中，高灌注速率并不可取，可能是由于积累的细胞外K⁺被快速冲走所致。+，这可能需要在记录用人工脑脊液（ACSF）中显著增加16事实上，当ASCF灌注速度增加至2-3 mL/min且脑片被较厚的ACSF层浸没时，痫样放电事件表现出更明显的“分段”特征；而当恢复至较低的灌注速率（1 mL/min）并使ACSF液面接近组织表面形成较薄液层时，可重现具有显著强直-阵挛成分的完整放电活动（数据未显示）。本方案中所述的定制记录舱可在1 mL/min流速下实现每分钟3-5次的灌注液更换。因此，即使在相对较低的灌注速率下，脑片的整体供氧状况也得到显著改善，同时仍能保证稳定的记录温度和高信噪比。最重要的是，能够维持细胞外K⁺+ 浓度至生理值。
4AP致痫模型不需要对ACSF的离子成分进行显著修改，例如降低Mg2+或提高K+浓度，其独特优势在于能够保持兴奋性和抑制性突触传递的完整性12，这一点在癫痫研究中尤为重要，因为谷氨酸能和GABA能神经网络在癫痫样同步化过程中发挥着关键作用（参见 7）。本方案所用的4AP-ACSF含有生理浓度的K+（3.25 mM），以及较灌流ACSF略低的Mg2+浓度（1 mM vs 1.3 mM）。该Mg2+浓度仍在大鼠脑脊液中报道的生理范围内，且已被多个实验室采用（例如参见17,18）。就本方案所述目的而言，我们发现这种轻微降低更有利于增强4AP的作用效果。
在先前的研究中，4AP 是在脑片已放置于记录室后才施加的17,18。除非实验人员需要观察 4AP 施加与癫痫样放电模式出现之间的时间潜伏期，否则我们发现这种方法相当耗时，不适合本方案中所述的长时间记录和刺激实验。在 32 °C 条件下用 4AP 预孵育脑片可节省大量实验时间，因为在进行实验的同时，可对其他组织切片进行系列预处理。
脑片的长期存活性有助于长期分析神经网络特性。此外，若实验者希望比较多种刺激方案，脑片对重复电刺激的增强耐受性具有显著优势，因为这些刺激方案必须在同一脑片上进行，以确保统计学的稳健性。在我们的实验中，当测试3种刺激方案时，每种方案均包括一个对照阶段和一个恢复阶段，整个实验可能持续3至5小时。在此背景下，活体MEA定位至关重要，以确保激活正确的神经通路，并通过电刺激抑制而非促进痫性发作。我们开发的用户友好型图形界面（GUI）是一种快速、简便且灵活的工具，可用于定位不同脑区结构的电极。与商业软件不同，即使仅具备基础编程技能，也可添加自定义的MEA布局。图像可在明场下采集，因此任何分辨率良好且适配显微镜的通用相机均可使用。倒置显微镜对于观察微电极相对于脑片的位置至关重要，因为在正置显微镜下，微电极将被组织遮挡于下方。然而，如果实验者需要进行刀切以中断特定神经通路，则建议在倒置显微镜之外另配备体视显微镜。
最后，该方法的另一个优势在于大多数所需工具的组装成本低廉且相对简便，例如定制的记录室和孵育室、温浴装置以及切片固定锚，同时无需使用昂贵的低噪声蠕动泵。
该技术的局限性：
MEA记录无法可视化非常缓慢的脑波， 即，信号中的直流偏移。此类基线偏移有助于癫痫发作放电持续时间的渐近测量，更重要的是，它们对于研究皮层扩布性抑制（一种与癫痫猝死相关的现象）具有重要意义32 在癫痫和偏头痛之间存在共性33).
关于电刺激神经调节，本文所述方案允许进行多次刺激，而不会影响脑片的存活率。我们已成功进行了多达3次、每次20至45分钟的刺激，这与先前研究中报道的结果相似25。尽管脑片可能能够耐受更多次数的刺激或更长时间的刺激方案，但我们在本研究中并未对此进行测试。我们建议将刺激方案的次数限制在3次以内，并避免长时间（≥60分钟）的刺激，因为这可能会对在这些极限条件下维持的脑组织造成显著应激，甚至在撤除刺激后仍无法恢复。
方案中的关键步骤：
影响在与多电极阵列联用的脑片中成功记录和调控癫痫样活动的关键因素有多个。除所使用的啮齿类动物种类和脑片质量外，记录期间的灌流速率以及人工脑脊液（ACSF）流动的动力学特性即在记录室中观察到的活动模式（如层流式与环形）表明，脑片的恢复条件、长期维持状态以及4AP的应用方式是最为关键的步骤。
使用浸没式孵育室时，必须将脑片保存在室温下，以维持脑组织网络活性，并促进通过应用4AP诱导类似痫样放电。据我们观察，在32 °C条件下恢复和维持脑片，会在切片后3 - 4小时内导致脑组织质量下降。
然而，在室温下将脑片孵育于含4AP的ACSF中，再于32 °C进行记录是不可取的。我们发现在此条件下难以观察到稳定的反复性痫样放电。事实上，已有文献报道，在20–24 °C的低温条件下，无论是在体外in vitro34还是在体内in vivo35，均可减弱甚至抑制4AP诱导的痫样活动发生。因此，4AP孵育与记录的温度均应维持在30–34 °C范围内，且两者温度应保持一致。为了避免因4AP诱导神经元过度兴奋，同时脑片又从室温突然暴露于温暖（32 °C）的含4AP-ACSF溶液中，从而对脑组织造成过大应激，至关重要的是需进行一个中间预热步骤，即先将脑片在32 °C的保存型ACSF中孵育20–30分钟，使其适应温度变化。若省略此步骤，可能会影响4AP诱导痫样活动的形成。
另一个需要提及的方面是切片后人工脑脊液（ACSF）中D-葡萄糖浓度的重要性。25 mM的浓度比许多实验室使用的10 mM浓度更能有效维持脑片的活性，同时可使痫性放电的发生率提高一倍（因此，每天在多个脑片上进行一系列长时间的实验方案将更加容易实现）。
最后，需要提及切片过程中的几个重要细节。首先，切勿让完整脑组织和脑切片在低温切割用人工脑脊液（ACSF）中结冰。由于小鼠脑体积较小，将其冷却少于&#60;2 分钟即已足够。切片完成后应立即将组织切片从缓冲托盘转移至室温下的冲洗烧杯中。冲洗掉切割用ACSF非常重要，否则高浓度蔗糖会导致脑切片粘附在孵育室的尼龙网上。为有效冲洗组织，关键在于尽量减少转移移液管中残留的切割用ACSF，以避免过度污染孵育用ACSF。采用两步冲洗法有助于最大限度减少污染。切片程序完成后，应立即将组织切片从冲洗烧杯转移至孵育室中，孵育室内的软质尼龙网半悬浮于孵育用ACSF中，可使切片两侧均得到充分氧合。此原则应在切片后的所有步骤中贯彻执行：脑切片绝不能沉在烧杯底部，不应接触孵育室的侧壁，彼此之间也不应接触或重叠。
修改与故障排除：
人工脑脊液（ACSF）的成分可根据实验者的需要进行调整。例如，可添加药物以分析特定神经递质或离子通道对电神经调节效果的贡献。此外，丙酮酸和抗坏血酸（参见 表2）可以省略，但我们发现它们具有显著的神经保护作用。我们在表3中列出了本方案中可能遇到的最常见问题及其解决方法。
结论：
MEA记录无疑是一种研究健康与疾病状态下神经网络相互作用的宝贵技术。除了药理学研究外，该技术还可用于评估与应用于癫痫及其他神经系统疾病的深部脑刺激（DBS）相关的电神经调节方案。在本实验方案中，我们证明了可以重现典型的周期性刺激实验，其结果与传统的细胞外场电位记录结合外部刺激电极所获得的结果相似。随着商用、操作便捷的设备及先进软件工具的日益普及，MEA记录技术也适用于闭环刺激实验，以提供 特设的 对脑组织进行刺激，并研究反馈机制对神经网络反应的贡献。

癫痫是一种危及生命的进行性神经系统疾病，可导致大脑活动失控1；其疾病负担位居前列，并伴随显著的社会歧视2,3。颞叶癫痫（TLE）是最常见的癫痫综合征（占40%），也是对抗癫痫药物耐药性最高的一种类型（约30%）4。尽管手术切除致痫组织可能改善患者病情，但该方法并非适用于所有患者，且无法保证完全无发作的生活5。当药物治疗或神经外科手术不适用时，通过电刺激深部脑结构（DBS）调节癫痫相关的边缘网络环路是一种有前景的治疗策略。
啮齿类动物脑切片是研究健康与疾病状态下神经网络功能的重要工具6 通过……方法 体外 电生理学技术，因为它们至少在一定程度上保留了感兴趣脑区（ROI）原有的结构架构和神经连接。特别是，联合海马-内嗅皮层（hippocampus-EC）水平切片包含了参与颞叶癫痫（TLE）的关键神经元网络，因此常被用于此类研究。 体外 TLE 研究7.
可通过改变人工脑脊液（ACSF）的离子成分，在脑片中急性诱导类似癫痫发作的活动，例如降低镁离子浓度同时升高钾离子浓度8,9,10，或通过药理学手段干预，例如阻断抑制性GABA能活动（详见11的综述）。然而，这些模型基于兴奋与抑制之间的失衡调节，因此无法用于研究兴奋性和抑制性神经网络在癫痫发生过程中的相互作用及其协同贡献。对脑片持续灌注致痫药物4AP可同时增强兴奋性和抑制性神经传递，从而在保持突触活动整体完整的情况下研究急性癫痫发生过程12。
与传统的细胞外场电位记录相比，多电极阵列（MEA）能够从更多观测点记录神经元网络产生的电活动，传统方法因空间限制而难以在脑片表面容纳大量电极。此外，MEA芯片具有电极间距已知的优势，这对于追踪信号传播路径并评估记录信号的传导速度非常有用。尽管MEA最初设计用于培养神经元的记录13,14，但目前也已用于表征来自啮齿类动物15和人类16的急性脑片的电生理特征。因此，在癫痫研究领域，MEA是一种有价值的工具，可用于精确定位癫痫发作发生（ictogenesis）核心的神经网络相互作用16,17,18。
然而，MEA记录在长时间（数小时）的实验过程中， inherently 存在获取或维持稳定癫痫样放电模式的技术挑战。首先，由于记录室体积较大且为圆形的浸入式设计，组织供氧可能不足19,20 典型的商业可购得的多电极阵列（MEAs）存在信号噪声比差和温度不稳定的问题，当使用高灌流速率（6 - 10 mL/min）以改善脑片供氧时，可能会影响记录质量（参见关于加热与灌流设备的技术说明）21。其次，使用浸入式记录舱时，很难观察到具有高频成分的重复性放电，例如癫痫样放电19；当急性癫痫样放电模式由化学诱导并涉及电紧张耦合机制时，尤其如此，4AP 模型即属于这种情况22 （参见11 （以获得全面概述）。为克服这些局限性，研究人员已提出多种策略。例如，提高灌注速率19,20 同时减少脑切片厚度（≤300 µM）和面积17,18 是实现组织充分供氧的关键因素。此外，使用穿孔式多电极阵列（pMEAs）也可提高脑片的存活率，因为这种装置能够从两侧对脑组织进行灌流18.
尽管上述方法已显著提高了从脑片进行MEA记录的可行性，但这些方法尚未经过长时间（数小时）记录和电刺激实验的验证，而后者对脑组织构成了显著的应激。长时间记录可能是必要的，以研究癫痫样放电模式特定特征随时间演变的过程，而这些特征无法通过短期测量揭示。在脑深部电刺激（DBS）研究背景下，可能需要采用长时间的实验方案，以在同一脑片上评估和比较不同刺激范式的效应。
当仅需记录自发性电活动时，通常需对电极相对于感兴趣区域（ROI）进行定位映射 事后, 即在数据分析过程中，诱发反应或电刺激神经调控范式的研究需要将刺激精确传递至特定的感兴趣区域（ROI），因此要求在实验过程中能够快速、简便地进行实时电极定位映射。
本文展示了一种简单的实验方案，可在成年啮齿类动物脑切片中诱导并维持稳定的4-氨基吡啶（4AP）诱导的癫痫样放电模式。所观察到的电活动忠实地再现了该模型使用传统细胞外电生理技术所表征的电生理特征。这种活动可持续数小时，并可在长时间重复的持续电刺激下持续存在。用于维持和孵育脑切片的装置可使用常规实验室器材轻松组装（图1A），而一种可实现最佳灌流速度和层流的定制记录腔室（图1B）可通过商业渠道获得，或以较低成本使用3D打印技术自行制作。通过一个名为 mapMEA 的定制、用户友好的图形界面，可快速对感兴趣区域（ROI）进行定位，实现实时监测并选择刺激电极，该软件可根据请求免费获取。
<img alt="微流控装置示意图，带有进出口；用于流体动力学分析的多焦点设置" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57548/57548fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：本实验方案所用的定制设备。 (A用于4AP中恢复、预温育和预孵育的保持装置由烧杯和培养皿组装而成。培养皿的直径应小于烧杯，并通过注射器活塞固定就位。将尼龙网（取自柔软的丝袜）用氰基丙烯酸酯胶水粘贴在培养皿边缘以替代其底部。通过插入培养皿与烧杯壁之间的弯脊髓针（22 G）供给氧气。气泡应从烧杯侧壁释放，且不得接触尼龙网，以避免脑片移位。培养皿的盖子可用于防止人工脑脊液（ACSF）蒸发并维持氧饱和度。B) 自定义记录室。in：入口储液槽，用于容纳加热套管和参比电极。out：出口储液槽，用于容纳吸引针。rec：记录室。 (C经火焰抛光弯曲的玻璃巴斯德吸管，用于操作组织并调节其在记录室中的位置。 (D) 定制切片压紧锚具。E记录室最终组装并安装到MEA芯片上。脑片置于底部，由锚定装置固定。红色箭头指示覆盖加热套管的聚四氟乙烯（PTFE）管，红色圆圈指示参考电极，即浸没于入口储液槽人工脑脊液（ACSF）中的饱和KCl小球。蓝色箭头指示出口储液槽中的吸引针。 <a href="/files/ftp_upload/57548/57548fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>聚-D-赖氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td>MEA 包被所需材料</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>化学</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>化学</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td>化学</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;*2 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>化学</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD016</td><td>化学</td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>化学</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;*6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>化学</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5921</td><td>化学</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD023</td><td>化学</td></tr><tr><td>丙酮酸，98%&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107360</td><td>化学</td></tr><tr><td>4-氨基吡啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>致惊厥药物</td></tr><tr><td>STG-2004</td><td>多通道系统</td><td>STG4004-1.6mA</td><td>4通道电压刺激发生器&amp;plusmn;8 V）和电流输出（&amp;plusmn;1.6 mA</td></tr><tr><td>MEA1060</td><td>多通道系统</td><td>N/A</td><td>MEA 放大器</td></tr><tr><td>平面MEA</td><td>多通道系统</td><td>60MEA500/30iR-Ti 无环</td><td>必须无环状结构，以便使用定制记录室</td></tr><tr><td>麦克雷克</td><td>多通道系统</td><td></td><td>记录软件</td></tr><tr><td>McStimulus II</td><td>多通道系统</td><td></td><td>STG4004 控制软件</td></tr><tr><td>TC02</td><td>多通道系统</td><td>TC02</td><td>双通道恒温器</td></tr><tr><td>PH01</td><td>多通道系统</td><td>PH01</td><td>加热灌注导管</td></tr><tr><td>MPH&amp;nbsp;</td><td>多通道系统</td><td>MPH&amp;nbsp;</td><td>PH01 磁力架与吸液针</td></tr><tr><td>Elastostil E43</td><td>Wacker</td><td>E43</td><td>用于将定制记录室固定到微电极阵列上的弹性密封剂</td></tr><tr><td>MEA定制腔室</td><td>Crisel Instrument</td><td>SKE-chamber MEA</td><td>定制记录室</td></tr><tr><td>Ag/AgCl 电极，片状，1.0 mm&amp;nbsp;</td><td>Crisel Instrument</td><td>64-1309</td><td>定制记录室的参比电极</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287-1EA</td><td>酶清洁剂</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The Mathworks</td><td></td><td>电极标测的编程环境</td></tr><tr><td>VT1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td>振动切片机</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td>Ag-AgCl电极颗粒 1.0 mm（E205）。参比电极。</td></tr></tbody></table>

使用微电极阵列记录和调控啮齿类动物脑片中的癫痫样活动

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

颞叶癫痫（TLE）是最常见的部分性复杂癫痫综合征，也是对药物治疗反应最差的一种。当药物治疗无效或不建议进行神经外科手术时，深部脑刺激（DBS）是一种有前景的治疗策略。急性脑切片结合微电极阵列（MEAs）是研究神经元网络相互作用及其电刺激调控的有力工具。与传统的细胞外记录技术相比，该方法具有更多观测点以及明确的电极间距，从而可研究电生理信号的传播路径和速度。然而，在MEA记录过程中，组织供氧可能严重受损，需要较高的灌流速率，但这会降低信噪比，并导致实验温度出现更大的波动。电刺激进一步加剧了脑组织的应激状态，使得长时间的记录/刺激难以持续。此外，对脑切片活动的电调控需要精准靶向切片内的特定结构或通路，这就要求能够在实验过程中实时快速完成电极定位映射。本文介绍了如何利用平面微电极阵列（MEA）在啮齿类动物脑切片中记录并进行电调控由4-氨基吡啶（4AP）诱导的癫痫样活动。我们发现，来源于小鼠的脑组织优于大鼠脑组织，因此更适用于MEA实验。本方案能够稳定产生并维持一种可重复的癫痫样放电模式，该模式真实再现了传统场电位记录中观察到的电生理特征，可持续数小时，并能耐受长时间的持续电刺激。通过使用一种定制的小体积记录室，即使在低灌流速率（1 mL/min）下也能实现层流和快速溶液交换，从而保障整个实验过程中脑组织的活性。快速MEA电极映射以及刺激电极的实时监测与选择，则通过一个定制的图形用户界面（GUI）完成。

我们展示了如何利用微电极阵列在啮齿类动物脑片上记录并进行电调控由4-氨基吡啶诱导的癫痫样活动。定制的记录室可在长时间的实验过程中维持组织的活性。通过定制的图形用户界面实现电极的实时映射以及刺激电对的选择。

颞叶癫痫（TLE）是最常见的部分性复杂癫痫综合征，且对药物治疗的反应最差。脑深部电刺激（DBS）……

该方法有助于解答癫痫治疗神经调节领域中的一些关键问题，例如最适合的脑区和刺激方案是什么。该技术的主要优势在于，啮齿类动物脑片代表了简化的、接近真实的脑回路模型，而微电极阵列则能够在已知电极间距的条件下实现多个观测点的同时记录。准备MEA时，将弹性密封剂均匀涂抹在记录室的底面，并确保无气泡产生。接下来，使用镊子将记录室安装到MEA上，并施加轻柔的压力。在记录室的外缘涂抹一层密封剂。然后，将MEA/记录室组件置于密闭的湿润环境中，并在室温下静置过夜使其固化。准备记录工作台时，将温浴设置为32摄氏度。接着，将保存用人工脑脊液（ACSF）倒入保存室和预热室中。用95%氧气和5%二氧化碳的混合气体对溶液进行鼓泡，并使用倒置的巴斯德移液管去除任何滞留的气泡。将孵育室置于室温环境中，并将预热室放入温水浴中。按照标准操作流程制备水平海马-皮层脑片，并在室温下的孵育室中恢复至少60分钟。将4AP人工脑脊液倒入孵育 chamber 中。然后，用95%氧气和5%二氧化碳的混合气体通入溶液，使用倒置的巴斯德移液管去除任何滞留的气泡。随后，盖上孵育 chamber，并将其转移至温浴中。确保预加温的ACSF溶液和4AP ACSF溶液的温度为30至32摄氏度。使用倒置的玻璃巴斯德移液管将一片脑切片转移至预热室中，让组织静置 25 至 30 分钟。随后，将脑切片转移至含 4AP ACSF 的孵育室，静置 60 分钟。让 4AP ACSF 流经灌注管进入烧杯，直至管内无气泡存在。然后，停止溶液流动。将干燥的MEA芯片放入MEA放大器中，并固定放大器头部。随后，使用塑料巴斯德吸管将4AP ACSF转移至记录室的入口和出口储液池中。将加热套管固定在磁性支架上，并将其尖端放入记录室的进样口内。然后，将磁性支架固定在MEA放大器头部的磁条上。将灌流管路连接至套管，并将套管连接至恒温器。随后，将吸液针放入出口储液槽中。通过将吸液针浸入ACSF并检查是否存在持续的低频吸液声音，确认是否产生负压。接下来，调节流量控制器，使流速达到每分钟1毫升，并开始灌流。当4AP人工脑脊液流经套管后，打开恒温器。将加热套管温度设为37摄氏度，MEA底座温度设为32摄氏度，以使记录室内的温度达到32至34摄氏度。然后，将外部参考电极置于记录室入口处的储液槽中。当4AP人工脑脊液（ACSF）液面和记录温度稳定至所需水平后，将灌流和吸液旋塞转至关闭位置，以暂时停止灌流和吸液。使用倒置的玻璃巴斯德移液管，迅速将一片脑组织转移至MEA记录室中。根据需要，使用火焰抛光的弯头巴斯德移液管或柔软、紧凑的小刷子调整脑片在MEA记录区域上的位置。将固定锚放置在脑切片上。通过将旋塞重新转回开启位置，恢复灌注和吸引。使用安装在倒置显微镜载物台上的相机拍摄脑切片图像。然后，在计算机软件中运行 mapMEA 脚本以启动用于映射电极的图形用户界面。单击“浏览”按钮以加载脑切片图像。确保参考电极出现在 MEA 左半侧上方一列的位置。然后，点击“激活指针”按钮。在阵列最左侧一列中选择顶部和底部电极，以标记用于图像校正和电极定位的 XY 坐标。从切片类型下拉菜单中选择“水平”。勾选“默认结构”复选框。使用脑切片图像下方的数字按钮，选择与感兴趣区域（ROI）对应的电极，然后在结构面板中点击相应的按钮进行分配。对每个感兴趣区域重复此步骤。然后，按下保存按钮。软件将生成一个结果文件夹，其中包含报告所选电极和感兴趣区域（ROIs）的表格。对于电生理学研究，在开始刺激方案前至少10分钟打开刺激单元，以使其完成自校准和稳定。然后，启动刺激控制软件，并通过刺激控制软件主面板上的绿色指示灯确认刺激器和MEA放大器已正确连接。将刺激设置为双极配置，并将刺激单元连接至接地端。然后，在使用 mapMEA 脚本定位的电极对中，连接与 CA1 区/近端下托锥体细胞层接触的电极对。为获取数据，在记录软件主面板上点击播放按钮。至少记录四次痫性放电。接下来，运行快速输入/输出测试以确定最佳刺激强度。为此，请使用主面板设计一个每相持续时间为 100 微秒的方波双相正负电流脉冲。在脉冲幅度选项卡中，输入每相 100 微安的初始脉冲幅度。通过设置不短于五秒的脉冲间隔，将刺激脉冲频率设定为0.2赫兹或更低。在每次试验中以50至100微安培的步长逐步增加刺激强度，直至刺激能够稳定地在旁海马皮层诱发类似发作间期的事件。对于边缘系统癫痫发生的电调控，应编程刺激装置以实施感兴趣的刺激方案，并采用在输入/输出测试期间确定的刺激强度。刺激停止后，通过记录至少四次痫样放电，验证网络是否恢复至刺激前状态。该图显示了在对照条件下、1 Hz 周期性 pacing 期间以及停止刺激后恢复期间，内嗅皮层和嗅周皮层中由 4AP 诱导的痫样活动的记录结果。该图展示了 1 Hz 周期性 pacing 效应的定量分析，表明在刺激期间总发作时间显著减少。一旦掌握，该技术若操作得当，可在三到四小时内完成。在进行此操作时，重要的是要记住迅速而准确地将脑片放置于MEA上。在此步骤完成后，还可采用其他方法，如药理学干预，以进一步探究神经递质或离子通道在癫痫样活动中的作用，以及神经调节的影响。该技术问世后，为神经科学领域的研究人员探索培养神经元及脑片中健康与疾病状态下的神经网络相互作用开辟了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何记录并利用微电极阵列（MEA）对由4-氨基吡啶在啮齿类动物脑片中诱导的癫痫样活动进行电生理记录与调控。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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