一种用于研究人类T细胞记忆应答的负压水疱实验方案 体内

本视频的总体目标是演示吸疱皮肤回忆反应法，该方法可使我们采集到代表体内适应性免疫反应的抗原特异性T细胞和细胞因子。此方法可用于研究人类的细胞免疫反应和适应性免疫。该技术的主要优势在于，它能够通过一种相对无创且安全的方法，直接从免疫反应部位采集抗原特异性T细胞。

皮肤回忆反应的基本原理是将抗原注入皮肤的真皮层。对于已存在该抗原免疫记忆的个体，T细胞会迁移至反应部位，并在局部引发免疫反应，导致特异性T细胞在原位发生克隆扩增和分化。在该反应区域诱导产生负压水疱，可使我们收集到这些特异性T细胞以及体内产生的细胞因子。

在本视频演示中，我们使用PPD作为回忆抗原。PPD通常用于诊断结核分枝杆菌感染。但是，正如您在本视频中将看到的，它也会在既往接种过BCG疫苗的人群中引发皮肤反应。

进行结核菌素皮肤试验所需的材料包括酒精棉片、1毫升注射器配27至30号短针头，以及经批准用于人体的PPD溶液。应使用每毫升含20结核菌素单位的PPD溶液。用酒精棉片对药瓶进行消毒。

请注意，不同制造商的产品成分可能有所不同。然后在志愿者前臂的掌侧确定注射部位，并使用酒精棉片对该区域进行消毒。使用带有29号、12毫米固定针头的1毫升无菌注射器。

轻轻混匀并吸取0.1毫升PPD溶液，确保无可见气泡。绷紧皮肤，将针头以5至15度角刺入，针尖斜面朝上。

将针头尖端插入皮肤的真皮层，并确保针尖几乎可在表皮下可见。缓慢注射0.1毫升PPD溶液。若操作正确，立即会出现一个直径6至10毫米的丘疹。

丘疹大约十分钟后消失。可进行多次PPD接种，但可能需要额外的伦理审批。若进行两次注射，应尽量分开注射部位，同时与肘部和腕部保持足够距离。

临床皮肤反应通常在24小时内出现，并伴有瘙痒感。在注射后48至72小时测量皮肤反应的大小。评估反应时，重要的是测量硬结范围，而非红斑范围。

用手指触诊帽状肿胀，然后用圆珠笔标记浸润边缘。最后，使用软尺测量浸润直径，并以毫米为单位记录结果。

七天后，开始诱导产生吸疱。诱导皮肤吸疱时，使用带有吸疱室的真空泵，可选用市售装置或定制设备。

重要的是，泵的压力需要在负20至负40千帕范围内可调，并能提供稳定可靠的负压。吸力室的底部由一块带有小孔的板组成，该板与皮肤接触。根据皮肤反应的不同，可使用单孔或多孔的板，并采用不同尺寸的孔板以适应需要。

腔室顶部应允许对水疱进行视觉观察。诱导前，对皮肤和腔室板进行消毒。确保手臂舒适地放置。

使用可调节的绑带固定反应室。皮肤反应的中心应通过底板上的孔清晰可见。打开抽吸装置，并将负压调节至-20千帕。

30分钟后，将压力增加至负25千帕。60分钟后，进一步将压力增加至负30千帕。并保持此压力，直至形成一个完整的水疱。

水疱诱导阶段通常需要大约一到三个小时。实际的水疱形成在最后30分钟内逐渐发生，如这里高速展示的那样。如果出现水疱破裂或出血的迹象，建议缓慢释放压力并提前终止诱导。

水疱可能表现为单个或多个融合的水疱。该过程常伴有瘙痒感。水疱完全形成后，释放压力，并小心移除吸疱装置。

在正确诱导形成的水疱中，表皮层完全与皮肤的真皮层分离，形成一个充满液体的腔隙。通过在水疱周围皮肤区域覆盖柔软敷料，并在水疱上方放置一个硬质保护盖（此处使用一个15毫升塑料管的管盖）来保护水疱。先用防过敏胶带固定管盖，再用柔软、有弹性的绷带包扎固定。

指导志愿者将保护性敷料保留过夜。次日，小心移除敷料，并使用喷雾对水疱区域进行消毒。使用带有23号针头的2毫升无菌注射器抽取水疱内容物。

将针头插入水疱顶部的侧缘，缓慢抽吸液体。避免触碰水疱腔的基底，但需确保收集全部液体，因为水疱内的液体量可能较少，如此例所示。塌陷的水疱将无瘢痕愈合。

在水疱处覆盖保护性敷料。然后将水疱液转移至无菌管中。使用台式离心机在600 G条件下离心4分钟。

随后，收集上清液，并将细胞沉淀重悬于500微升细胞培养基中。新鲜细胞现可用于计数及进一步分析。吸疱细胞可用于体外分析，例如流式细胞术。

在本项针对接种过BCG疫苗的志愿者的实验中，每个水疱的细胞产量范围为15,000至超过200,000个细胞。在此，我们从单个负压吸引水疱中分离细胞，并在体外用PPD刺激这些细胞，随后进行染色和流式细胞术分析。作为对照，我们对同一位接种过PCG疫苗的志愿者的外周血单个核细胞（PBMC）进行了平行分析。

在图示中，您可以看到经细胞内染色检测TNF-α、干扰素-γ和IL-2产生的CD4阳性T细胞群体。在此志愿者中，从皮肤分离的CD4阳性T细胞中有超过30%具有抗原特异性，而在外周血单个核细胞（PBMCs）中，该比例低于1%。此外，水疱细胞的单个细胞因子谱具有中枢记忆T细胞和效应T细胞的特征，说明该方法使我们能够研究体内产生的长期记忆免疫应答。

图A表明，可对抽吸水疱获得的液体进行分析，以检测体内产生的细胞因子。在图B中，我们将抽吸水疱获得的细胞在结核分枝杆菌存在条件下培养四天，展示了抽吸水疱细胞在体外产生干扰素-γ和TNF-α的能力。观看本视频后，您应能够充分理解如何在皮肤抗原沉积后诱导并采集抽吸水疱中的细胞。

在本演示中，我们使用了一种在结核病研究领域具有特殊意义的抗原。然而，该方法的基本原理也可应用于适应性免疫领域的研究，或用于评估靶向T细胞制剂的试验中。同时，请务必牢记，在涉及人类志愿者的研究中，伦理与安全始终是首要考虑的因素。

还需记住，处理人类样本可能存在危险，因此在实验室中应始终遵守安全预防措施。