利用诱导多能干细胞衍生肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型

该方法已回答了该领域的一些关键问题，例如如何构建人源化肝脏嵌合小鼠模型以研究家族性高胆固醇血症。该技术的主要优势在于能够进行体内药物测试。该技术对家族性高胆固醇血症的治疗具有重要的应用前景。

作为一种针对该疾病的新型疗法，可利用此类嵌合动物模型进行测试。尽管该方法可用于研究家族性高胆固醇血症，也可应用于其他遗传性肝病。在移植前24小时，将每只小鼠所需的40 µL细胞外基质置于冰盒中，并在冷室中解冻。

为每只待注射的小鼠准备一支胰岛素注射器，并将200微升枪头盒放入4摄氏度冰箱中预冷。移植前一小时，将添加了50微克/毫升DNA酶1的细胞解离酶恢复至室温，同时将含有20%血清替代物的RPMI 1640培养基置于冰上。使用相差显微镜拍摄iHeps的图像，记录其状态，包括细胞形态、生长情况和细胞密度。

随后，用 2 毫升室温的无钙、无镁离子 PBS 将 iHeps 的每孔洗涤两次，每次 2 毫升，然后向每孔加入 1 毫升预热的细胞解离酶。将细胞放回培养箱中孵育 8 至 10 分钟。在显微镜下观察细胞形态变化。

当大部分细胞变圆时，每孔加入等体积的冷培养基，轻轻吹打使细胞从培养板上脱落，并将细胞悬液转移至新的15毫升离心管中。此步骤对肝细胞的可靠性至关重要。若细胞难以从培养板上脱落，可允许少量细胞留在培养板上。

如果细胞脱落，则在离心后轻轻吹打，以获得单细胞悬液。对每个孔重复细胞脱落步骤，直到收集到几乎所有贴壁细胞。然后在4°C下以200 g离心3分钟。

离心后，弃去上清液，并在15毫升离心管中用2毫升冷PBS重悬细胞。轻轻吹打细胞以获得单细胞悬液。然后，将细胞通过40微米细胞滤筛，以去除细胞团块。

通常，灌注后可收获约一百万至二百万个细胞。接下来，向20 µL细胞悬液中加入0.4%台盼蓝溶液若干微升。计数细胞，并记录细胞悬液的浓度为C。计算每只小鼠注射一百万个细胞所需的细胞悬液体积。

然后将所需体积的细胞悬液分配至15毫升离心管中，在4摄氏度下以200 ×g离心3分钟。去除上清液后，按每只小鼠27.5 µL的量将细胞重悬于冷的PBS中。随后加入等体积的细胞外基质，使每只小鼠的终体积为55 µL。

现在，将一支冷藏的胰岛素注射器置于冰上。拔出活塞，将 55 µL 细胞悬液转移至注射器中，然后重新插入活塞。小心排出气泡，并将注射器放回冰上。

在开始注射操作前，确保LRG小鼠已充分麻醉。在小鼠眼部涂抹兽医用眼膏，以防止麻醉过程中眼睛干涩。当小鼠对刺激失去肌肉反射时，将其置于右侧卧位。

在左侧 flank 区域的切口部位涂抹一层厚厚的脱毛膏，保留五到八分钟。用浸湿的纱布擦拭该区域，去除脱毛膏和毛发。用 70% 乙醇对左侧 flank 擦拭三次。

然后定位位于左侧 flank 的脾脏。接着用聚维酮碘进行最后一次浸泡以消毒。使用剪刀在皮肤和腹壁上做一个 0.5 至 1 厘米的切口后，用镊子轻轻牵拉周围的脂肪组织，将脾脏牵出体外。

使用棉签轻轻固定脾脏。将胰岛素注射器针头插入脾实质内3至4毫米，缓慢注入约50微升细胞悬液。拔出针头后，在注射部位覆盖棉签并按压1分钟，以防止出血和液体外溢。

将脾脏复位至腹膜腔，并用5-0尼龙缝线缝合切口。缝合后，将小鼠置于干净的笼子中，确保其能方便地获取食物和水。首先，移除刚处死的小鼠的内脏器官，暴露与脊柱平行的降主动脉。

然后剥离周围的组织，取出心脏。用精细剪刀分离主动脉，并将每根主动脉置于冰冷的、充氧的克雷布斯溶液中。收集完毕后，将盛有主动脉的克雷布斯溶液转移至硅胶包被的培养皿中。

用大头针固定结缔组织，以固定主动脉位置，且不使其拉伸。在无菌显微镜下，使用精细镊子和弹簧剪刀小心分离主动脉周围的脂肪和外膜组织，避免损伤血管壁。然后将每根主动脉切成1.5至2毫米长的节段。

接下来，剪取一段长两厘米、40微米厚的不锈钢丝，并轻轻插入主动脉管腔内。握住钢丝将血管段转移至充满含氧克雷布斯溶液的血管肌动描记仪腔室中。在研究血管收缩性时，为测量主动脉段的长度，需将每段血管垂直放置于夹具之间，并记录千分尺上的D1读数。

然后取下该线段，将夹具的钳口合拢。记录 D0 读数，并计算该线段的长度。接着，用螺丝刀夹紧并固定导线，同时将未拉伸的线段置于钳口之间。

实验前进行归一化时，将肌动仪在未拉伸位置调零。然后缓慢分开夹具，观察主动脉张力变化，直至达到3毫牛。15分钟后，排出肌动仪腔室中的溶液，并更换为新鲜的克雷布斯溶液。

再等待15分钟后，再次将张力调节至3毫牛。然后将标准克雷布斯液更换为添加了60毫摩尔氯化钾的克雷布斯液，以诱导收缩至少15分钟。用新鲜的克雷布斯液冲洗三次，随后加入浓度递增的去氧肾上腺素。

例如，10 纳摩尔至 100 微摩尔。然后，用标准 Krebs 溶液洗脱后，加入单一浓度的去氧肾上腺素，约为最大收缩的 70%。当收缩稳定时，每隔两分钟加入递增浓度的乙酰胆碱。

例如，一至三纳摩尔到十至三十微摩尔可诱导血管舒张。该图像显示了在低密度脂蛋白受体缺陷型iHeps细胞低密度移植的鼠肝中，人白蛋白染色的代表性全切片扫描图像。箭头指示移植到鼠肝中的人iHeps细胞簇。

此处可更详细地观察到移植的人源iHeps细胞簇。该散点图展示了来自不同供体iPSCs的小鼠肝脏中，含iHeps区域对应的人源白蛋白阳性细胞的再群体化百分比。这是一张代表性的小鼠肝脏免疫组织化学染色图像，显示了移植的家族性高胆固醇血症iHeps中的人源细胞核。

柱状图显示了不同供体iPSC来源的iHeps在LRG小鼠肝脏中人源细胞核阳性重群体的百分比。这些是用野生型iHeps重构成的小鼠肝脏连续切片中人白蛋白和人细胞核染色的代表性图像。最后，该图像显示了家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠主动脉在乙酰胆碱浓度递增刺激下发生的内皮依赖性血管舒张。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用人诱导多能干细胞衍生的肝细胞构建人源化肝脏嵌合小鼠。