Name: 诱导多潜能干细胞源性肝细胞的家族性高胆固醇血症人肝嵌合小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 了解利用人诱导多能干细胞来源肝细胞构建家族性高胆固醇血症人肝嵌合小鼠模型的方法。该技术可在活体中进行药物测试，为治疗高胆固醇血症及其他遗传性肝病提供研究平台。

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本工作得到了深圳市科技计划基础研究项目（JCYJ20150331142757383）、中国科学院战略性先导科技专项（XDA16030502）、香港研究资助局主题研究计划（T12-705/11）、香港特别行政区研究资助局与国家自然科学基金委员会合作项目（N-HKU730/12 和 81261160506）、广东省自然科学基金研究团队项目（2014A030312001）、广州市科技计划项目（201607010086）以及广东省科学技术计划项目（2016B030229007 和 2017B050506007）的支持。

本研究中涉及动物使用的所有方法均已获得香港大学教学与研究使用活体动物委员会（CULATR）的批准。
1. 小鼠准备与表型检测
<ol>
	<li>免疫缺陷型Ldlr基因敲除（KO）小鼠的制备。
	<ol>
		<li>使用Ldlr-/-、Rag2-/-和Il2rg-/-小鼠品系（见材料表）。</li>
		<li>将Rag2-/-小鼠与Il2rg-/-小鼠杂交以获得Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠，再将Ldlr-/-小鼠与Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠杂交，以生成Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-（LRG）小鼠15。在3至4周龄时，从小鼠耳部采集基因组DNA，并通过PCR和测序确定基因型。</li>
		<li>在8至12周龄时，使用雄性LRG小鼠作为iHeps移植的受体，以构建人源化肝脏嵌合小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在iHeps移植前7天，给予小鼠高脂高胆固醇（HFHC）饮食，以诱导高胆固醇血症。</li>
	<li>为诱导肝脏损伤，促进移植的iHeps在肝脏中的增殖，在移植前24小时将小鼠放入无菌容器中，使用γ射线辐照仪以3 Gy剂量进行γ射线照射。随后将小鼠放回饲养笼中。&#160;可通过监测小鼠体重来评估其健康状况。&#160;体重减轻20%或以上的小鼠将被实施安乐死。</li>
</ol>
2. iHep 细胞分化与解离
LDLR 杂合型敲除（+/-）或纯合型敲除（-/-）的人源iPSCs，或携带LDLR基因杂合突变的家族性高胆固醇血症患者来源的iPSCs（FH iPSCs），可用于生成iHeps。关于LDLR +/- 或 -/- iPSCs 以及FH iPSCs的建立方法详见我们此前的报道15。
<ol>
	<li>诱导多能干细胞向诱导型肝细胞的定向分化 
	注意：将人iPSCs分化为iHeps的方法参照先前的报道进行修改16.
	<ol>
		<li>分化前3天（第-3天），将iPSC接种于包被有细胞外基质的6孔板中（参见 材料表) 以每孔300,000个细胞的密度接种于1.5 mL（下同）人iPSC维持培养基中（参见 材料表) 并添加5 µM ROCK抑制剂（Y27632）。将细胞在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。2 湿润培养箱。通常，一个6孔板中的iHeps足以移植到5只小鼠体内。</li>
		<li>24 小时后（第 -2 天）和 48 小时后（第 -1 天），更换为不含 ROCK 抑制剂的新鲜人iPSC维持培养基。 
		注意：诱导性多能干细胞在分化前应高表达OCT4和NANOG，可通过定量RT-PCR、免疫荧光或流式细胞术检测。</li>
		<li>在分化第0天，用RPMI 1640培养基洗涤细胞一次，然后加入添加了100 ng/mL Activin A和25 ng/mL WNT3a的RPMI 1640培养基。</li>
		<li>在分化第1天和第2天，更换为添加了100 ng/mL Activin A的RPMI 1640培养基。 
		注意：如果此阶段（第0–3天）细胞死亡过多，可在培养基中添加最多0.5%的胎牛血清（FBS）以提高细胞存活率。然而，我们建议针对每种特定的iPSC系测试所需添加FBS的最低浓度，因为过量FBS也可能影响细胞分化。</li>
		<li>第3天，用DMEM洗涤细胞一次，然后更换为2nd 阶段培养基（DMEM培养基中含20%血清替代物、1×非必需氨基酸、2 M L-谷氨酰胺、0.1 M β-巯基乙醇和1%二甲基亚砜）。每隔一天更换一次培养基，直至第10天。 
		注意：第7天时，细胞应已达到汇合状态，并显示出清晰的边界。此阶段可能会出现少量未分化区域；若这些区域所占比例较小，可忽略不计。若比例较高，则应降低第0天诱导性多能干细胞（iPSCs）的汇合度，并减少分化第一阶段所用胎牛血清（FBS）的用量。</li>
		<li>第10天，用肝细胞基础培养基洗涤细胞一次，然后更换为添加了20 ng/mL人肝细胞生长因子和20 ng/mL抑癌素M的肝细胞培养基，以促进诱导型肝细胞（iHep）的成熟。每隔一天更换一次培养基。 
		注意：在此阶段， &#62;90%的细胞应通过免疫荧光染色或流式细胞术检测呈HNF4A阳性。</li>
		<li>在第15–17天，细胞已准备好进行移植。可选地，可收集细胞培养的上清液并保存于-80 °C，用于定量分析诱导型肝细胞（iHeps）分泌的白蛋白（ALB）。 
		注意：在此阶段， &#62;80%的iHeps应通过免疫荧光染色显示HNF4A、ALB和α1-抗胰蛋白酶（AAT）阳性。约60–70%的第17天iHeps应通过流式细胞术检测显示ASGPR阳性。在我们的实验条件下，此阶段的iHeps具有最佳的小鼠肝脏重殖能力；尽管iHeps在体外可能分泌更高水平的ALB，但若移植延迟，也可能进入衰老状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>iHeps的解离及装入胰岛素注射器
	<ol>
		<li>准备所需的试剂和材料：
		<ol>
			<li>移植前24 h，在冷室中将所需体积（V = 40 µL × 小鼠数量）的细胞外基质置于冰盒中解冻，并将胰岛素注射器和一盒200 µL吸头放入4 °C冰箱中。</li>
			<li>移植前1小时，将添加了50 µg/mL DNase I的细胞解离酶置于室温回温，并将含有20%血清替代物的RPMI 1640培养基置于冰上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>以相差显微镜拍摄iHeps的图像（100倍和200倍），记录其状态，包括细胞形态、生长情况和细胞密度。</li>
		<li>用 2 mL/孔的室温 Ca 洗涤 iHeps2+ 和 Mg2+用无钙镁 PBS 洗涤两次，然后每孔加入 1 mL 细胞解离酶溶液，并补充 50 µg/mL DNase I。将细胞放回培养箱中孵育 8–10 分钟。 
		注意：为了提高细胞解离酶对细胞的解离效果，先用不含 Ca2+ 和 Mg2+无血清 PBS。为了最大限度地提高细胞存活率，建议每次消化不超过 6 个孔。此外，建议将细胞解离酶处理时间控制在 10 分钟以内。</li>
		<li>在显微镜下观察细胞形态。当大部分细胞变圆时，向每孔加入等体积含20%血清替代物的冷RPMI 1640培养基，轻轻吹打使细胞脱离培养板，将细胞悬液转移至新的15 mL离心管中。 
		注意：此步骤对收获细胞的活力至关重要。如果细胞难以从培养板上脱离，残留少量细胞并无影响。若细胞以大片单层细胞团块的形式脱落，则在离心后需轻轻吹打，以获得单细胞悬液。</li>
		<li>重复步骤 2.2.4，对每个孔进行操作，直至收集到几乎所有贴壁细胞。在 200 x g 4 °C下，3分钟。</li>
		<li>移除上清液，加入2 mL预冷的PBS，重悬细胞于15 mL离心管中。轻轻吹打细胞，获得单细胞悬液，然后加入预冷的PBS至终体积为1 mL × 消化孔数。最后，将细胞悬液通过40 µm细胞滤网，以去除细胞团块。 
		注意：通常为 1-2 × 106 过滤后可收集每孔细胞。</li>
		<li>取20 µL细胞悬液，加入20 µL 0.4%台盼蓝溶液，混匀后使用自动细胞计数仪计数细胞，并记录细胞悬液的浓度 &#34;C&#34;. 计算所需体积（V1 = [106 * (n+1)]/C，其中 n 为需移植的小鼠数量，C 为每只小鼠注射 100 万细胞的细胞悬液体积，用于脾内注射。</li>
		<li>将所需体积的细胞悬液分装至15 mL离心管中，在200 x g条件下离心 g 4 °C 下离心 3 分钟。</li>
		<li>移除上清液，用适量的冷PBS重悬细胞，使细胞悬液体积为(n+1) * 55/2 µL（n = 小鼠数量），然后加入等体积的细胞外基质，使细胞悬液终体积为(n+1) * 55 µL。</li>
		<li>将预冷的胰岛素注射器置于冰上，拔出活塞，吸取55 µL细胞悬液注入注射器内，然后重新插入活塞。小心排出气泡，并将注射器放回冰上。</li>
		<li>重复步骤 2.3.10，直至所有注射器均装入细胞。此时注射器已准备好用于注射。 
		注意：为了最大限度地提高细胞存活率，建议在细胞解离后将其置于冰上。对于上述步骤 2.2.4–2.2.11，确保所有试剂在使用前均保存在 2–8 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. iHeps 的脾内注射
<ol>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。在小鼠眼睛上涂抹兽用眼膏以防止麻醉过程中眼睛干燥，并监测其肌肉反射以观察麻醉效果并评估疼痛情况。</li>
	<li>当小鼠对刺激失去肌肉反射时，将其置于右侧卧位。在左侧 flank 区域切口处涂抹一层厚厚的脱毛膏，持续 5–8 分钟。随后用浸湿的纱布擦拭该区域，清除脱毛膏和毛发。</li>
	<li>用聚维酮碘对左侧 flank 进行擦洗，或 alternatively 使用 70% 乙醇擦洗 3 次，最后用聚维酮碘浸泡以达到消毒目的。</li>
	<li>在二级生物安全柜中，定位脾脏位置，脾脏可在左侧 flank 透明可见。切开皮肤和腹壁约 0.5–1 cm。用尖头镊子轻轻牵拉脾脏附近的脂肪组织，将脾脏拉出体外。用棉签轻轻固定脾脏。</li>
	<li>将胰岛素注射器针头插入脾脏实质 3–4 mm，缓慢注入约 50 µL 细胞悬液。拔出针头后，在注射部位放置棉签压迫 1 分钟，以防止出血和液体外溢。</li>
	<li>将脾脏放回腹腔，用 5–0 尼龙缝线缝合伤口。然后将小鼠置于温暖的培养箱或保温箱中 3–16 小时，使其恢复至正常体温并苏醒。术后小鼠在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。</li>
	<li>在饮水中添加美洛昔康（26 μg/mL），并肌肉注射布托啡诺（50 μg/kg），分别作为抗炎药和镇痛药。&#160;每日监测手术伤口，防止发生炎症。 
	注意：确保步骤 4–7 中使用的所有器械和材料均为无菌状态。</li>
</ol>
4. 血浆LDL-C水平检测
<ol>
	<li>在移植后第0、7、14、21和28天，采用双手固定法牢固地固定LRG小鼠，以最大限度减少其头部左右移动，然后使用采血针穿刺面静脉。拔出采血针后血液将开始流出。将约50 µL血液收集至含有1 µL EDTA的1.5 mL离心管中。 
	注意：若固定力度过大，可能导致采血量减少，并可能因呼吸困难导致小鼠死亡。</li>
	<li>轻轻颠倒混匀血液数次，随后以950 × g 离心15分钟。收集上清液并立即于-80 °C保存。</li>
	<li>待所有样本收集完毕后，将血浆在室温下解冻，并根据试剂盒说明书使用LDL-C检测试剂盒测定LDL-C水平。</li>
</ol>
5. 体内 嵌合小鼠移植后药物检测 LDLR ± 和 FH iHeps
<ol>
	<li>为诱导高胆固醇血症，在移植前7天开始给予小鼠高脂高胆固醇（HFHC）饮食。</li>
	<li>移植后第7天，分别给予各组小鼠以下处理：对照溶剂（PBS，皮下注射）、10 mg/kg/周PCSK9抗体（临床级PCSK9单克隆抗体制剂，同样皮下注射）、10 mg/kg/天辛伐他汀（40 mg/L mg/mL溶于饮用水中）或PCSK9抗体联合辛伐他汀治疗。</li>
	<li>在移植当天（第0天）以及移植后第14、21和28天采集小鼠血浆，并立即将样本储存于-80 °C。</li>
	<li>待所有样本收集完毕后，按照试剂盒说明书使用LDL-C检测试剂盒检测血浆LDL水平。</li>
</ol>
6. 内皮功能检测
在家族性高胆固醇血症（FH）早期，内皮功能即受到影响，可在我们的小鼠模型中通过该功能评估疾病的严重程度，或评价不同治疗方案的改善效果。本实验需要体视显微镜、解剖镊子、剪刀、血管环张力测定仪、数据采集硬件（见材料表）以及计算机。
<ol>
	<li>通过腹腔注射处死小鼠&#160;注射100 mg/kg苯巴比妥。去除内脏器官，使与脊柱平行的降主动脉暴露，便于用剪刀连同周围组织及心脏一并剪下。使用精细剪刀分离主动脉，并将其置于冰冷的含氧 Krebs 溶液中（mM：119 NaCl，4.7 KCl，2.5 CaCl₂）2，1 MgCl2，25 NaHCO₃3，1.2 KH2PO4，以及11 D-葡萄糖。</li>
	<li>将主动脉转移至盛有Krebs溶液的硅胶包被培养皿中。用针固定结缔组织，以固定主动脉位置，避免拉伸。在体视显微镜下，使用精细镊子配合剪刀，小心分离周围脂肪及外膜组织，避免损伤血管壁，随后将主动脉切成1.5至2 mm长的节段。</li>
	<li>剪取一段长约2 cm、直径40 μm的不锈钢丝，轻轻穿过主动脉管腔。用手持钢丝将血管段转移至盛有充氧Krebs溶液的血管肌动图装置腔室中。</li>
	<li>在研究收缩性时，为测量主动脉节段的长度，应将每个节段垂直置于夹具之间，并记录读数（D1) 读数。取下该段，合拢千分尺的测量面，记录读数（D0）。该线段的长度为 L = D1- D0.</li>
	<li>按照用户指南，将导线夹住并用螺丝刀固定，同时将线段置于钳口之间，但保持其未拉伸状态。</li>
	<li>实验前进行归一化处理时，先将肌动描记仪在未拉伸状态下调零。随后缓慢分开夹头，观察主动脉张力变化，直至达到3 mN。15分钟后，排空肌动描记仪腔内的溶液，更换为新鲜的Krebs溶液，静置15分钟，再次将张力调整至3 mN。</li>
	<li>更换为含60 mM KCl的Krebs溶液以诱导收缩，持续至少15分钟。用新鲜Krebs溶液冲洗3次。</li>
	<li>加入浓度递增的去甲肾上腺素（Phe； 例如，浓度范围为10 nM至100 μM）。用标准Krebs溶液洗脱，然后加入单一浓度的去氧肾上腺素（Phe），使其引起的收缩幅度约为前次最大收缩的70%。待收缩稳定后，依次加入浓度递增的乙酰胆碱（ACh； 例如，从1或3 nM到10或30 µM）以诱导血管舒张。ACh每隔约2分钟添加一次。 
	注意：对于去氧肾上腺素（Phe）诱导收缩较小的某些主动脉节段（例如，小于KCl诱导收缩的30%），可使用浓度为1 nM至30 nM的U46619（另一种血管收缩剂）诱导产生稳定收缩，其幅度应大于KCl诱导收缩的70%。</li>
	<li>根据制造商手册清洁肌动图仪。</li>
	<li>使用数据分析软件（参见 材料表），每次添加药物后记录力值（F）。将标记物调至基础张力（F基础的）用于相对测量，将箭头移至苯丙氨酸（Phe）之后的最高点作为F苯丙氨酸，然后每次加入ACh后均移动至最低点作为FACh. 通过以下公式计算乙酰胆碱诱导的内皮依赖性血管舒张（EDV）：%舒张 = （FACh- F基础的)/(F苯丙氨酸- F基底的在Y轴上绘制相应的数值。使用统计学软件，以浓度的M单位的log10值作为X轴，绘制浓度-反应曲线。</li>
	<li>为分析统计学差异，使用单只小鼠每个片段的曲线下面积，并采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较各组间曲线下面积的差异。如有需要，也可对单个数据点进行分析。</li>
</ol>
7. 小鼠肝脏中诱导型肝细胞（iHep）重群体的证据
<ol>
	<li>实验终点时，通过腹腔注射&#160;100 mg/kg 戊巴比妥钠处死小鼠。</li>
	<li>通过心脏穿刺采集血浆。使用眼科剪分离肝脏各叶，将肝脏放入10 cm的培养皿中，用生理盐水洗涤两次。用吸水纸吸去肝脏表面的生理盐水，然后将肝叶切成约0.6 cm长的小块。用10%福尔马林固定肝叶。</li>
	<li>根据制造商说明书，分别使用组织处理系统和滑动式切片机将固定的肝脏包埋于石蜡中并进行切片。</li>
	<li>将载玻片在60 °C下加热1小时以溶解石蜡。然后将载玻片浸入二甲苯中两次，每次5分钟，并依次用100%、90%和70%乙醇对组织进行水化。</li>
	<li>将载玻片浸入含有约50 mL抗原修复液的染色缸中，随后将染色缸放入压力锅中，在120 °C下处理1.5分钟。用自来水轻轻冲洗载玻片5分钟。</li>
	<li>使用针对人白蛋白（hALB）和人核抗原（hNA）的一抗（约100 µL/切片）对切片进行染色，然后使用荧光标记或辣根过氧化物酶偶联的二抗进行染色（后者可与DAB检测试剂盒反应）。</li>
	<li>为计算hALB+区域和hNA+细胞的百分比，使用自动载玻片扫描系统对经抗hALB和抗hNA抗体染色并使用DAB显色的切片进行扫描，获得全切片图像。 
	注意：全切片扫描图像有助于基于免疫组化染色肝脏中的hALB+区域或hNA+细胞，无偏倚地计算再增殖效率。作为监测iHep再增殖效率的替代方法，可使用人特异性ALB ELISA试剂盒检测血浆中人白蛋白水平。</li>
	<li>使用配套的数字切片浏览软件在5倍物镜下拍摄覆盖整个载玻片的快照图像。为定量hALB+区域的百分比，对每张快照图像，使用显微镜成像软件测定图像中的阳性区域（P）和总面积（T），并使用Image J软件测定空白区域（B）。hALB+区域的百分比表示为P/(T-B) × 100%。每组至少选择3只小鼠，每只小鼠至少选择来自肝脏不同位置的4个切片。</li>
	<li>为定量hNA+细胞的百分比，对每张快照图像，使用图像处理软件随机选取1/16的区域，然后手动计数总细胞核数（T）和hNA+细胞核数（N）。hNA+细胞的百分比表示为N/T × 100%。每组至少选择3只小鼠，每只小鼠至少选择来自肝脏不同位置的4个切片。</li>
</ol>

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<li>Kajiwara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-dependent+variations+in+hepatic+differentiation+from+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).</li>
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<li>Ortmann, D., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Variability of human pluripotent stem cell lines.</a> Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).</li>
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</ol>

H.-F.T. 是由赛诺菲（Sanofi）和再生元制药公司（Regeneron Pharmaceuticals）赞助的 ODYSSEY OUTCOMES 研究的国家协调员和研究者。

先前在啮齿类动物中使用诱导性肝细胞（iHeps）的研究已证实，iHeps 是研究遗传性肝病的有效方法17为了进一步拓展该技术的应用，并鉴于目前的FH动物模型尚不理想，我们将FH iHeps移植到LRG小鼠体内，并证明了移植后的 LDLR +/− 或杂合子 LDLR-突变型FH iHeps可降低小鼠血浆LDL-C水平，并对降脂药物产生应答 体内.
使用iHeps生成人源FH肝嵌合小鼠的方案中有三个关键步骤： 
1）通过定向分化获得高质量的iHeps。鉴于不同iPSC细胞系之间存在克隆变异18，进行基因改造和移植前，应使用同基因型的iPSC细胞以确保适当的对照，并检测母细胞系的iHep分化效率。
2）正确将iHep装载入注射器中。与其他方案不同，我们使用50%细胞外基质（终浓度，v/v）重悬iHep，然后将其装载入胰岛素注射器中。我们认为细胞外基质能够保护细胞，并提供一种微...

低密度脂蛋白受体（LDLR）可捕获血液中的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），从而调节肝脏中的胆固醇合成。LDLR基因突变是家族性高胆固醇血症（FH）最常见的病因1。他汀类药物传统上是治疗FH及其他类型高胆固醇血症（遗传性或获得性）的首选药物。他汀类药物通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶来降低肝脏胆固醇的合成2。此外，他汀类药物还能增加肝细胞表面LDLR的表达水平，促进血浆中LDL-C的清除。然而，他汀类药物治疗的一个主要局限在于，它们会同时诱导前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）的表达，而PCSK9是一种能够结合LDLR并促进其降解的酶3。这一效应导致许多患者对他汀类药物的反应不足甚至无反应。对这一机制的研究意外地促成了治疗高胆固醇血症的替代方法的发现。美国食品药品监督管理局（FDA）近期批准的PCSK9抗体目前已用于临床试验，其疗效和耐受性均优于他汀类药物4。PCSK9抗体的成功也意味着，在高胆固醇血症患者中，可能还存在其他调控LDLR降解通路（除PCSK9外）的治疗策略。同样，人们也致力于开发除抗体以外的新型PCSK9抑制剂，例如小干扰RNA（siRNA）寡核苷酸5。
为了测试针对家族性高胆固醇血症（FH）以及一般其他类型高胆固醇血症的新疗法，需要适当的 体内 模型是必要的。当前的一个主要问题是 体内 模型，主要是小鼠6 和兔子7，与人类存在生理差异。其中尤为关键的是，它们具有不同的脂质代谢特征。人源化肝脏嵌合动物的构建8 可能有助于克服这一局限。人源化肝小鼠是一种类型 &#34;人源化&#34; 肝脏中移植了人源肝细胞的小鼠，例如原代人肝细胞（pHH）9pHH 的一个问题是无法对其进行扩增 离体，分离后会迅速失去功能，且来源有限。pHH 的一种替代方案是使用诱导性多能干细胞（iPSC）来源的肝细胞（iHeps）10值得注意的是，iPSC 具有患者特异性且可无限增殖，因此可根据需要生产 iHep，这一优势显著优于新鲜 pHH。此外，还可利用设计核酸酶对 iPSC 进行高效的基因工程改造，在等基因背景下校正或引入突变，从而实现更精确的比较研究11.
人源化肝小鼠模型中移植了人原代肝细胞（pHH），其肝脏代谢谱、药物反应及对肝炎病毒感染的易感性均与人类相似12这使得它们成为研究高脂血症的良好模型 体内最常用的鼠类模型基于 Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (FRG) 小鼠13 和 uPA 转基因小鼠8，其中最多可达95%的小鼠肝脏可被pHH所取代。有趣的是，最近有研究报告了一种人源FH肝脏嵌合小鼠（基于FRG小鼠），其pHH来源于一名携带纯合子突变的患者 LDLR 突变14在此模型中，重建的人肝细胞缺乏功能性LDLR，而残余的小鼠肝细胞则具有LDLR，从而降低了该模型在进行相关实验时的实用性 体内 依赖LDLR通路的药物测试。
本文基于我们近期已发表的研究，报告了一项详细的实验方案15 用于将FH iHeps移植到 Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) 小鼠肝脏。这种人源化肝嵌合小鼠可用于苯丙酮尿症（FH）的建模及药物测试 体内

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞滤筛</td><td>BD</td><td>B4-VW-352340</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>140675</td><td>细胞外基质包被</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>乙酰胆碱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6625</td><td>溶于水</td></tr><tr><td>抗原修复液</td><td>IHC World</td><td>IW-1100-1L</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8106</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>细胞解离酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12604-013</td><td>TrypLE</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8270</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5879</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10829</td><td>敲除DMEM</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>罗氏</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15694</td><td>0.5 M，pH = 8.0</td></tr><tr><td>细胞外基质（用于细胞悬浮）</td><td>康宁</td><td>354234</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>细胞外基质（用于iHep分化）</td><td>康宁</td><td>354230</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>肝细胞基础培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3199</td><td></td></tr><tr><td>肝细胞培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>高脂高胆固醇饮食</td><td>研究饮食</td><td>D12079B</td><td></td></tr><tr><td>人激活素A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>人肝细胞生长因子</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>人iPSC维持培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td>mTeSR1</td></tr><tr><td>人抑瘤素M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮 10%</td><td>Alfasan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>LDL-C 检测试剂盒</td><td>WAKO</td><td>993-00404 和 993-00504</td><td></td></tr><tr><td>镁&amp;nbsp;氯化物</td><td>VWR</td><td>P25108</td><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>勃林格殷格翰</td><td>NADA 141-213</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>USB</td><td>S20227</td><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>通用电气</td><td>SH30256.02</td><td>无钙无镁</td></tr><tr><td>PCSK9 抗体</td><td>赛诺菲与再生元制药</td><td>SAR236553/REGN727</td><td>Alirocumab</td></tr><tr><td>苯巴比妥</td><td>Alfamedic 公司</td><td>013003</td><td></td></tr><tr><td>去甲肾上腺素</td><td>RBI</td><td>P-133</td><td>溶于水</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>KCl</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Mundipharma</td><td>聚维酮碘</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 Wnt3a</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>ROCK抑制剂Y27632</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>血清替代物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>硅胶涂层培养皿</td><td>道康宁</td><td>Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒</td><td></td></tr><tr><td>辛伐他汀</td><td>默克·夏普 &amp;安进与默沙东</td><td>ZOCOR</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6297</td><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>U-46619</td><td>Cayman</td><td>16450</td><td>溶于DMSO</td></tr><tr><td>2% 赛拉嗪</td><td>Alfasan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;&amp;beta;&lt;/strong&gt;-巯基乙醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAT</td><td>DAKO</td><td>A0012</td><td>1:400</td></tr><tr><td>ALB</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A80-129</td><td>1:200</td></tr><tr><td>ASGPR</td><td>圣克鲁斯</td><td>Sc-28977</td><td>1:100</td></tr><tr><td>HNF4A</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-6557</td><td>1:35</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>Stemgent</td><td>09-0020</td><td>1:200</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Stemgent</td><td>09-0023</td><td>1:200</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;小鼠&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Il2rg&lt;sup&gt;-/- &lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;</td><td>杰克逊实验室</td><td>003174</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ldlr&lt;sup&gt;-/- &lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;</td><td>杰克逊实验室</td><td>002077</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Rag2&lt;sup&gt;-/- &lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;</td><td>杰克逊实验室</td><td>008449</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>库尔斯</td><td></td></tr><tr><td>γ射线辐照仪</td><td>MDS Nordion</td><td>Gammacell 3000 Elan II</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>324911</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab</td><td>ADInstruments</td><td>模型 8/30</td><td></td></tr><tr><td>载玻片扫描系统</td><td>Leica biosystems</td><td>Aperio ScanScope 系统</td><td></td></tr><tr><td>滑动式切片机</td><td>Leica biosystems</td><td>RM2125RT</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>尼康</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>组织处理系统</td><td>Leica biosystems</td><td>ASP200S</td><td></td></tr><tr><td>血管环张力测定仪</td><td>DMT</td><td>610M</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>数字切片浏览软件</td><td>Leica</td><td>Aperio ImageScope 版本 12.3.2</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>版本 1.51e</td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CC 版本 2015</td><td></td></tr><tr><td>显微镜成像软件</td><td>卡尔·蔡司</td><td>AxioVision LE 版本 4.7</td><td></td></tr></tbody></table>

利用诱导多能干细胞衍生肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

家族性高胆固醇血症（FH）大多由低密度脂蛋白受体（LDLR）基因突变引起，导致血液中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）显著升高，从而增加早发性心血管疾病的风险。他汀类药物是治疗FH及其他类型高胆固醇血症的首选降脂药物，但新的治疗方法正在不断涌现，尤其是PCSK9抗体，目前正处于临床试验阶段。为了探索FH的新型治疗方法（包括新药或新剂型），我们需要合适的体内模型。然而，现有FH动物模型在脂质代谢谱方面与人类存在差异，这是当前面临的关键问题。. 为解决这一问题，我们利用FH患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）分化为肝细胞（iHeps），构建了一种人源化肝脏嵌合小鼠模型。我们采用Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-（LRG）小鼠，以避免移植的人源细胞发生免疫排斥，并可在LDLR完全缺失的背景下评估LDLR缺陷型iHeps的功能。根据人血清白蛋白染色结果，移植的FH iHeps可在LRG小鼠肝脏中重建5%-10%的肝组织。此外，移植的iHeps对降脂药物产生响应，并重现了临床观察结果：与他汀类药物相比，PCSK9抗体具有更高的疗效。因此，我们建立的人源化肝脏嵌合模型可能适用于FH新疗法的临床前评估。采用相同实验方案，也可构建针对其他FH遗传变异或对应其他遗传性肝病基因突变的人源化肝脏嵌合小鼠模型。

人类iPSCs向iHeps的定向分化 
当人iPSCs达到70%融合度时，采用三步法将其分化为iHeps16 (图1 上图）。经过3天的内胚层分化后，iPSC集落变得松散并扩展至完全汇合（图1 下图）。然后，用 2nd 培养基中，肝母细胞出现并增殖。此阶段这些细胞较为密集，但边界清晰（第7天， 图1 下图）。经过17天的分化，出现具有典型六边形形态的极化诱导肝细胞（iHeps）。图1 下图）。这些iHeps表达pHH标志物，包括AAT和ALB（图2A）。此外，通过流式细胞术检测，ASGPR+ iHeps 的比例应相对较高（图2B...

本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞来源的肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型的实验方案。该模型是测试高胆固醇血症新疗法的重要工具。

家族性高胆固醇血症（FH）主要由低密度脂蛋白受体（LDLR）基因突变引起，导致早发性心血管疾病风险显著升高……

该方法已回答了该领域的一些关键问题，例如如何构建人源化肝脏嵌合小鼠模型以研究家族性高胆固醇血症。该技术的主要优势在于能够进行体内药物测试。该技术对家族性高胆固醇血症的治疗具有重要的应用前景。作为一种针对该疾病的新型疗法，可利用此类嵌合动物模型进行测试。尽管该方法可用于研究家族性高胆固醇血症，也可应用于其他遗传性肝病。在移植前24小时，将每只小鼠所需的40 µL细胞外基质置于冰盒中，并在冷室中解冻。为每只待注射的小鼠准备一支胰岛素注射器，并将200微升枪头盒放入4摄氏度冰箱中预冷。移植前一小时，将添加了50微克/毫升DNA酶1的细胞解离酶恢复至室温，同时将含有20%血清替代物的RPMI 1640培养基置于冰上。使用相差显微镜拍摄iHeps的图像，记录其状态，包括细胞形态、生长情况和细胞密度。随后，用 2 毫升室温的无钙、无镁离子 PBS 将 iHeps 的每孔洗涤两次，每次 2 毫升，然后向每孔加入 1 毫升预热的细胞解离酶。将细胞放回培养箱中孵育 8 至 10 分钟。在显微镜下观察细胞形态变化。当大部分细胞变圆时，每孔加入等体积的冷培养基，轻轻吹打使细胞从培养板上脱落，并将细胞悬液转移至新的15毫升离心管中。此步骤对肝细胞的可靠性至关重要。若细胞难以从培养板上脱落，可允许少量细胞留在培养板上。如果细胞脱落，则在离心后轻轻吹打，以获得单细胞悬液。对每个孔重复细胞脱落步骤，直到收集到几乎所有贴壁细胞。然后在4°C下以200 g离心3分钟。离心后，弃去上清液，并在15毫升离心管中用2毫升冷PBS重悬细胞。轻轻吹打细胞以获得单细胞悬液。然后，将细胞通过40微米细胞滤筛，以去除细胞团块。通常，灌注后可收获约一百万至二百万个细胞。接下来，向20 µL细胞悬液中加入0.4%台盼蓝溶液若干微升。计数细胞，并记录细胞悬液的浓度为C。计算每只小鼠注射一百万个细胞所需的细胞悬液体积。然后将所需体积的细胞悬液分配至15毫升离心管中，在4摄氏度下以200 ×g离心3分钟。去除上清液后，按每只小鼠27.5 µL的量将细胞重悬于冷的PBS中。随后加入等体积的细胞外基质，使每只小鼠的终体积为55 µL。现在，将一支冷藏的胰岛素注射器置于冰上。拔出活塞，将 55 µL 细胞悬液转移至注射器中，然后重新插入活塞。小心排出气泡，并将注射器放回冰上。在开始注射操作前，确保LRG小鼠已充分麻醉。在小鼠眼部涂抹兽医用眼膏，以防止麻醉过程中眼睛干涩。当小鼠对刺激失去肌肉反射时，将其置于右侧卧位。在左侧 flank 区域的切口部位涂抹一层厚厚的脱毛膏，保留五到八分钟。用浸湿的纱布擦拭该区域，去除脱毛膏和毛发。用 70% 乙醇对左侧 flank 擦拭三次。然后定位位于左侧 flank 的脾脏。接着用聚维酮碘进行最后一次浸泡以消毒。使用剪刀在皮肤和腹壁上做一个 0.5 至 1 厘米的切口后，用镊子轻轻牵拉周围

a-familial-hypercholesterolemia-human-liver-chimeric-mouse-model

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

诱导多潜能干细胞源性肝细胞的家族性高胆固醇血症人肝嵌合小鼠模型

本文将重点介绍如何从人类胚胎干细胞群体中生成人类肝内胚层细胞。...

从人胚胎干细胞群体中稳健生成肝细胞样细胞

本视频展示了一种构建双人源化小鼠模型的方法，该模型同时具有人免疫系统和人肝细胞。该方法包括将人肝细胞和造血干细胞与祖细胞移植到转基因免疫缺陷小鼠体内。...

开发含有人肝细胞和免疫细胞的人源化小鼠模型

本文介绍了一种新型的人源化小鼠肝脏模型，该模型通过将未成熟且具有扩增能力的人类肝干细胞移植到白蛋白-毒素受体介导的细胞敲除（TRECK）/SCID小鼠体内而建立。...

利用人肝干细胞构建人源化小鼠肝脏

本文所述方案介绍了一个用于发现治疗肝病小分子的平台。逐步详细描述了如何在96孔板中将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为具有肝细胞特征的细胞，并利用这些细胞筛选具有潜在治疗活性的小分子。...

利用人诱导多能干细胞来源的肝细胞样细胞进行药物发现

本方案描述了一种在96孔板体系中由人多能干细胞生成肝细胞样细胞的半自动化方法。该过程快速且成本效益高，可用于生产质量可控的肝细胞样细胞批次，服务于基础和应用型人类研究。...

多能干细胞向类肝细胞的半自动化生产

本方案提供了一种可靠的方法，用于建立同时具有人类免疫系统和肝细胞的人源化小鼠模型。双重建免疫缺陷小鼠实现 通过 人肝细胞和CD34的脾内注射+...

建立双人源化TK-NOG小鼠模型用于研究HIV相关性肝病发病机制

本方案详细描述了一种单层、无血清的方法，可在18天内高效地将人多能干细胞（hPSCs）诱导生成肝细胞样细胞。该过程包括六个阶段，hPSCs...

高效分化人多能干细胞为肝细胞

本文描述了一种具有临床相关性的肝癌小鼠模型的建立，该模型可重现肝细胞癌（HCC）典型的免疫学特征。...

一种由致癌性肝细胞诱导的原位小鼠肝细胞癌模型，发生于肝脏炎症与纤维化背景下

本方案描述了小鼠肝外胆管三维类器官系统的构建方法。这些胆管类器官可在体外培养中维持生长，用于研究胆管上皮细胞的生物学特性。胆管类器官表达胆管前体细胞和成熟胆管细胞的标志物，并由具有极性的上皮细胞组成。...

从小鼠肝外胆管生成类器官

本文描述了一种将人类胚胎干细胞（hESCs）分化为功能性肝细胞样细胞（HLCs）的详细方案，该方法在hESCs向定型内胚层（DE）分化过程中持续添加Activin...

一种高效诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞的方法

本方案描述了从小鼠肝脏中分离原代肝细胞，并通过电穿孔将CRISPR-Cas9以核糖核蛋白复合物和mRNA形式导入细胞，以破坏与遗传性肝代谢疾病相关的治疗靶基因的技术。所述方法在电穿孔后可实现高细胞存活率和高效的基因修饰水平。...

电穿孔介导的Cas9核糖核蛋白和mRNA递送至新鲜分离的小鼠原代肝细胞

了解利用人诱导多能干细胞来源肝细胞构建家族性高胆固醇血症人肝嵌合小鼠模型的方法。该技术可在活体中进行药物测试，为治疗高胆固醇血症及其他遗传性肝病提供研究平台。

利用诱导多能干细胞衍生肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型

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