Name: 一种研究外周和中枢神经系统 Neuroregeneration 的果蝇体内损伤模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学习利用双光子激光轴突/树突切断术和活体成像技术，在果蝇幼虫感觉神经元中建立神经再生筛选平台。该方法可快速、经济地筛选神经再生促进因子和抑制因子，适用于研究神经退行性疾病和神经元-胶质细胞相互作用。

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感谢 Jessica Goldshteyn 提供的技术支持。宋实验室的工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R00NS088211 和智力与发育障碍研究中心（IDDRC）新项目开发奖资助。

1. 培养平板和培养瓶的制备
<ol>
	<li>葡萄汁琼脂平板的制备
	<ol>
		<li>将10 g琼脂粉、200 mL葡萄汁和192 mL ddH2O加入烧杯中，微波加热约4-5分钟，期间间歇搅拌，直至琼脂完全溶解。</li>
		<li>在通风橱中将溶液冷却至约60 °C，加入4.2 mL 95%乙醇和4.0 mL冰醋酸，用ddH2O定容至400 mL，充分混匀。</li>
		<li>每35 mm平板加入约2-3 mL上述溶液。400 mL葡萄汁琼脂溶液可制备约120-150个平板。</li>
		<li>静置10分钟，待平板冷却并使琼脂凝固。将葡萄汁琼脂平板装入自封式密封袋中，于4°C保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drosophila培养瓶的制备
	<ol>
		<li>用刀片在Drosophila培养瓶的瓶壁上切出一个边长1.5 cm的三角形孔洞，并用直径2-2.5 cm的棉球填充孔洞以实现通气。</li>
		<li>用一块葡萄汁琼脂平板封住瓶口，并在平板上添加约0.5 cm3酵母糊。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样本采集 果蝇 幼虫
<ol>
	<li>设置成虫果蝇的杂交
	<ol>
		<li>将10只处女雌蝇和5只雄性成虫果蝇放入一个装有葡萄汁琼脂平板的培养瓶中。</li>
		<li>将培养瓶倒置，置于25°C环境中，使果蝇在葡萄汁琼脂平板上产卵。每天至少更换一次平板上的酵母糊。若需进行2小时的卵收集期（以获得发育阶段均一的幼虫），在步骤2.1.1中应使用超过20只处女雌蝇和10只雄蝇。</li>
		<li>将平板置于含湿润滤纸（例如，浸泡于0.5%丙酸溶液中）的60 mm培养皿内，在25°C下培养。摆放滤纸时应确保不阻碍氧气流通。 
		注意：丙酸溶液用于维持培养皿内的湿度，并防止霉菌生长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集特定年龄的幼虫
	<ol>
		<li>使用镊子将目标发育阶段的幼虫（例如，产卵后48–72小时的2nd至3rd龄幼虫）转移至不含酵母糊的新葡萄汁琼脂平板上。</li>
		<li>让幼虫在新平板上爬行，以去除其体表附着的酵母，防止酵母对激光轴突切断实验及成像造成潜在干扰。或者，也可将幼虫在PBS培养皿中充分清洗，并用滤纸短暂吸干。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 双光子损伤与共聚焦成像
<ol>
	<li>显微镜设置 
	注意：本实验使用配备双光子激光器的共聚焦激光扫描显微镜，但其他具有类似配置的系统也可满足要求。双光子激光（930 nm）用于造成损伤，氩离子激光（488 nm）用于GFP的共聚焦成像。
	<ol>
		<li>每次实验开始时，打开双光子激光器和/或共聚焦激光器以及显微镜，启动成像软件。</li>
		<li>对于双光子损伤，设置以下参数，使用930 nm（1,950 mW）双光子激光对GFP进行成像：
		<ol>
			<li>选择线扫描模式，将针孔完全打开，将激光强度提高至约20%（390 mW）。</li>
			<li>选择512 × 512作为帧扫描尺寸，使用最大扫描速度（通常像素驻留时间为0.77 µs），确保平均次数为1，位深为8位。</li>
			<li>将增益设为约750，偏移设为0。</li>
			<li>将此预设实验方案保存为2P GFP 930 Ablation，以便在后续实验中重复使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于共聚焦成像，设置以下参数，使用488 nm氩离子激光对GFP进行成像：
		<ol>
			<li>选择Acquisition选项卡，然后选择Z-stack。</li>
			<li>在&#34;Laser&#34;下，开启488 nm氩离子激光的电源。</li>
			<li>进入Channels，选择488 nm激光，将激光功率提高至5–10%。针孔设置为1–2艾里单位（AU），增益调整为650。</li>
			<li>在Acquisition Mode中，选择1024 × 1024作为帧扫描尺寸，使用最大扫描速度，平均次数为2，位深为8位。</li>
			<li>将此预设实验方案保存为GFP Imaging。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用乙醚麻醉幼虫并进行固定
	<ol>
		<li>在通风橱中，将一个60 mm玻璃培养皿放入15 cm塑料培养皿内。在玻璃培养皿底部折叠并放置一张滤纸，然后将葡萄汁琼脂平板置于滤纸上。向玻璃培养皿中加入乙醚，直至滤纸完全浸透且皿内留有一层液态乙醚。操作过程中始终盖上盖子。</li>
		<li>准备一张载玻片，在中央滴加一滴卤碳油27。在载玻片四角各加四点真空脂，用于后续支撑盖玻片。</li>
		<li>使用镊子夹取一只清洁的幼虫，将其放置在60 mm玻璃培养皿中的琼脂平板上。盖上玻璃培养皿盖子，等待幼虫停止活动。对于外周神经系统（PNS）损伤/成像，当幼虫尾部停止抽动时立即取出；对于中枢神经系统（CNS），需等待整个幼虫完全静止，尤其是头部节段。 
		注意：乙醚暴露时间至关重要，详见讨论部分。</li>
		<li>小心夹起麻醉后的幼虫，将其头部朝上放入载玻片的卤碳油液滴中。在载玻片上加盖盖玻片，轻轻按压盖玻片，直至其接触幼虫（图1A）。</li>
		<li>通过轻推盖玻片向左或向右滚动幼虫，调整其位置，使目标神经元/轴突/树突位于上方并最接近显微镜物镜。</li>
		<li>对于PNS损伤，将幼虫背侧朝上固定，使两侧气管可见。然后将幼虫向左旋转约30度以损伤III类da神经元轴突（图1B 和1C），旋转90度以损伤IV类da神经元轴突（图1B 和1E），或旋转约30度以损伤IV类da神经元树突（图2A）。</li>
		<li>对于CNS损伤，将幼虫完全腹侧朝上放置（图3A），使目标区域在z轴平面上最接近显微镜物镜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双光子激光损伤
	<ol>
		<li>将载有幼虫的载玻片置于显微镜下，并用载物台上的夹具固定。使用10X（0.3 NA）物镜找到幼虫。</li>
		<li>在盖玻片上滴加一滴物镜油，切换至40X（1.3 NA）物镜并调整焦距。</li>
		<li>切换至扫描模式，并重新使用实验方案2P GFP 930 Ablation。确保针孔完全打开。 
		注意：具体配置需根据各系统进行优化。</li>
		<li>启动Live模式以定位目标区域（ROI），并微调设置，在适当放大倍数下获得良好的图像质量。 
		注意：此步骤的目的是定位待损伤的神经元/轴突/树突，而非获取最佳质量图像。因此，应使用足以观察目标区域的最低设置，以避免过度曝光或光漂白。</li>
		<li>停止Live扫描，使Crop按钮可用。以静止图像作为参考图，选择Crop功能，并调整扫描窗口以聚焦于待损伤的目标区域。</li>
		<li>将ROI缩小至预期损伤部位的大小。例如，仅覆盖轴突或树突的宽度，以确保损伤的精确性并减少对邻近组织的损伤。如有需要，可在裁剪前对ROI进行放大，以实现更精确的损伤。</li>
		<li>打开一个新的成像窗口，降低扫描速度并提高激光强度。激光强度的提升幅度应基于Live模式下扫描的组织荧光信号来确定。</li>
		<li>通常，PNS损伤时双光子激光强度从25%开始，VNC损伤时为50–100%。对于PNS轴突损伤，确保激光强度约为480 mW，像素驻留时间为8.19 μs；对于VNC轴突损伤，激光强度和像素驻留时间通常分别为965–1930 mW和8.19–32.77 μs。</li>
		<li>启动Continuous扫描，将光标悬停在Continuous按钮上。密切观察图像，一旦观察到荧光显著增强，立即停止扫描。 
		注意：荧光信号的突然升高是由于损伤部位的自发荧光所致。</li>
		<li>通过重新应用设置切换回Live模式，通过调整焦距找到刚刚靶向的区域。 
		注意：成功损伤的良好标志是在损伤部位出现微小的凹坑、环状结构或局部碎片。</li>
		<li>移动至下一个神经元，从步骤3.3.5开始重复操作，以在同一动物体内损伤多个神经元。或者，若初始损伤不足，可重复步骤3.3.5，同时逐步提高功率和/或降低扫描速度。 
		注意：若激光功率过高，损伤后实时扫描图像中将可见大面积损伤区域，过度损伤可能导致幼虫死亡。</li>
		<li>小心移除盖玻片，将受伤幼虫转移至含有酵母糊的新培养板上。使用镊子在琼脂平板上挖出若干小洞；或者，在培养板中制作一个琼脂岛而非使用整块平板，以减少幼虫爬出培养板的可能性。</li>
		<li>将培养板放入装有湿润滤纸（用0.5%丙酸溶液浸泡）的60 mm培养皿中，在室温或25°C条件下培养。 
		注意：与25°C相比，幼虫在室温（22°C）下将额外多保持约一天的幼虫阶段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>损伤后共聚焦成像
	<ol>
		<li>在所需时间点对受伤幼虫进行成像，使用与步骤3.2相同的麻醉和固定程序准备幼虫，然后使用共聚焦激光进行成像。 
		注意：在损伤后24小时（AI）成像以确认轴突损伤，并在损伤后48小时AI（IV类da神经元）或72小时AI（III类da神经元）成像以评估再生情况。</li>
		<li>使用10X物镜定位幼虫，然后切换至25X（0.8 NA）物镜，重新使用实验方案GFP Imaging。</li>
		<li>点击Live按钮，找到先前损伤的同一神经元。</li>
		<li>在实时扫描窗口中设置第一和最后一个Z轴位置，点击停止并点击Start experiment以获取Z轴堆栈图像。 
		注意：确保在采集图像时包含一个归一化参考点（如轴突汇聚点），以便进行再生程度的量化分析（图1D、1F）——此内容将在数据分析部分进一步讨论。</li>
		<li>切换至Image Processing，选择刚刚获取的图像，并生成最大强度投影。同时保存Z轴堆栈图像和最大强度投影图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>使用成像软件或 ImageJ 处理和量化图像。</li>
	<li>外周神经系统（PNS）中的轴突再生量化
	<ol>
		<li>计算再生百分比，指在所有受损轴突中发生再生的轴突所占的百分比。只要轴突在损伤部位之外重新生长，即可记为再生。</li>
		<li>测量再生长度，即轴突长度的增加量。若使用 ImageJ 进行量化，请使用分段线（Segmented Line）工具追踪再生的轴突，并在分析（Analyze）下拉菜单中使用测量（Measure）功能，获取代表再生轴突长度的线段长度。</li>
		<li>计算再生指数，即归一化轴突长度的增加量。 
		注：轴突长度通过胞体与轴突汇聚点之间的距离（DCAC）进行归一化处理——轴突长度/DCAC（图 1D 和 1F）。该数值有助于消除因幼虫体型增长所导致的轴突生长影响。正值表示再生，0 表示无再生，负值表示回缩。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>树突再生的量化
	<ol>
		<li>计算再生百分比，即在所有被切断的 da 神经元中，表现出明显树突再生的神经元所占的百分比。 
		注：若新的树突从回缩的树突主干重新长出并延伸至损伤部位之外，则记为树突再生阳性。损伤部位可通过解剖标志确定，在某些情况下，因损伤诱导的自发荧光残留而清晰可见。</li>
		<li>计算分支点增加数，即损伤后新增的树突分支点数量。</li>
		<li>计算总树突长度增加量，即损伤后所有新生树突长度的总和。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中枢神经系统（CNS）中的轴突再生量化 
	注：如果在首次成像时间点观察到损伤部位出现退化现象（图 3B），该样本仍应纳入再生长度和再生速率的分析。
	<ol>
		<li>测量再生长度，即重新生长的轴突的长度。 
		注：单个损伤部位的再生轴突被识别为其从损伤前原始轴突路径上重新延伸而出的部分。</li>
		<li>计算归一化再生长度，即将再生长度相对于联合支段长度进行归一化处理——即联合支之间的纵向距离（图 3A 和 3B 中的&#34;Y&#34;）。 
		注：该数值有助于校正幼虫个体大小差异带来的影响。</li>
		<li>计算再生速率，即在所有被损伤的节段中，发生再生的节段所占的百分比，用于反映特定基因型的再生能力。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在设置果蝇杂交时，所使用的雌雄果蝇数量可根据基因型及特定实验所需的幼虫数量而变化。对于野生型果蝇，通常的杂交组合使用10只雌蝇和5只雄蝇。收集时间窗口可根据所需幼虫年龄的精确程度进行调整。例如，2小时的收集周期将获得年龄更均一的幼虫群体。在此情况下，使用20只或更多的处女雌蝇进行杂交有助于获得足够的卵。杂交后第一天的产卵量通常较少，因此建议在设置杂交装置两天或更长时间后收集带有卵的培养皿。在进一步培养带有卵的培养皿时，建议将组织浸泡在60 mm培养皿中的0.5%丙酸溶液中，而非水中，这不仅有助于维持培养皿内的湿度，还可避免霉菌生长。
在准备幼虫麻醉和固定装置时，务必使用玻璃培养皿，因为乙醚会溶解塑料。为防止泄漏，将玻璃培养皿置于一个15 cm的塑料培养皿中。滤纸有助于在培养皿中保留乙醚，使幼虫能够被乙醚蒸气有效麻醉。建议使用棕色滴瓶储存乙醚分装液，并用玻璃滴管以液滴形式添加乙醚。需定期补充乙醚，并始终保持培养皿底部有一层液态乙醚，以达到最佳效果。
乙醚暴露的时机至关重要：麻醉不足会导致幼虫在成像过程中恢复活动，造成图像抖动；而...

中枢神经系统（CNS）损伤后轴突无法再生，可能导致患者出现永久性残疾，并在神经退行性疾病中导致不可逆的神经功能缺损1,2,3,4,5。轴突在创伤后能否再生，取决于CNS的微环境以及神经元自身的生长能力。研究表明，少突胶质细胞、星形胶质细胞和成纤维细胞来源的细胞外因子会抑制神经元生长4,6,7,8，但消除这些分子仅能实现有限的轴突发芽5。内在的再生信号通路可影响再生的成功率5,9，并可能成为潜在的治疗靶点，但这些过程在分子水平上仍不明确。在某些情况下，增强神经营养因子信号或消除内源性抑制因子（如Pten磷酸酶）10，可促进轴突再生。迄今为止，尽管将多种单独有效的干预方法联合使用，总体恢复效果仍然有限11,12,13,14。因此，迫切需要鉴定新的治疗靶向通路。除了启动轴突再生之外，轴突是否以及如何重新连接到正确靶点、重建突触特异性并实现功能恢复，仍是尚未解决的重要问题。
总之，目前对调控轴突再生机制的理解仍然非常零散。部分原因在于实时研究哺乳动物轴突再生的技术难度较大，这种方法成本高、耗时长，且难以开展大规模的遗传筛选。 黑腹果蝇另一方面，果蝇已被证明是研究复杂生物学问题的极为强大的体系。果蝇在鉴定与人类高度保守的基因和信号通路方面发挥了关键作用，并凭借其丰富的分子遗传学工具用于调控基因功能，成功地成为研究神经退行性疾病等人类疾病状况的模型。15特别是，果蝇被认为是发现参与神经损伤与再生基因的理想工具。15,16已开发出多种果蝇神经损伤模型，包括成虫头部或幼虫腹神经索（VNC）针刺损伤、幼虫VNC或神经镊压损伤、幼虫神经元激光轴突切断、嗅觉感受神经元切除、脑组织外植损伤以及通过切断翅膀造成的外周神经损伤。15,17,18,19,20,21,22,23令人兴奋的是，近期利用 果蝇 损伤模型已&#160;推进了我们对神经系统响应神经损伤所利用的细胞和遗传通路的理解，其中一些通路已被证明在哺乳动物中具有保守性24,25再次强调了该模式生物在发现神经修复新机制方面的实用性。
此处描述的是一种基于双光子激光的 果蝇 幼虫感觉神经元损伤模型。首先使用双光子激光切断斑马鱼中的轴突 体内 2003年26同年，首次激光树突切除术得以实施 果蝇 使用脉冲氮激光器27随后不久，几个 秀丽隐杆线虫 实验室利用飞秒激光建立了轴突再生模型28. 2007年，Wu及其同事比较并报道了激光损伤之间的差异 秀丽隐杆线虫 由多种类型的激光诱导292010年，首次在激光轴突切断后观察到轴突再生现象 果蝇30在大量激光损伤研究的基础上，我们开发了一种利用双光子激光的果蝇神经损伤模型。该模型可精确地对靶向位点诱导损伤，同时最大限度减少对邻近组织的干扰，从而提供一个相对纯净的系统，以单细胞分辨率研究神经再生的内在与外在特性。具体而言，我们已建立了一套针对外周神经系统（PNS）和中枢神经系统（CNS）中树突状分支（da）感觉神经元的损伤方法。da神经元可根据其树突分支复杂程度分为四类：I类至IV类。31我们的已发表研究显示，da神经元的再生在表型和分子水平上类似于哺乳动物的损伤模型：da神经元表现出类别特异性的再生特性，其中只有IV类而非I类或III类da神经元在周围神经系统（PNS）中表现出再生能力；IV类da神经元的轴突在周围组织中能够 robustly 再生，但在中枢神经系统（CNS）中其再生潜力显著降低，这与哺乳动物背根神经节（DRG）神经元的表现相似；通过删除Pten或过表达Akt以增强mTOR活性，可促进果蝇中枢神经系统中的轴突再生19利用该损伤模型，我们开展了遗传筛选，鉴定出RNA加工酶Rtca是一种在进化上保守的轴突再生抑制因子，它将轴突损伤与细胞应激及RNA修饰联系起来20.
在本实验范式中，通过激光轴突切断术/树突切断术损伤幼虫IV类或III类da神经元，这些神经元通过标记得以识别 ppk-CD4-tdGFP 或 19-12-Gal4，UAS-CD4-tdGFP，repo-Gal80，分别。损伤在2nd 至 3rd 产卵后约48至72小时（h AEL）的龄期幼虫。对于外周神经系统（PNS）轴突切断，损伤部位定位于距胞体约20至50 µm的轴突段；对于中枢神经系统（CNS）轴突切断，损伤部位定位于腹神经索（VNC）联合部直径约20 µm的区域；对于树突切断，则定位于初级树突分支点。同一神经元在损伤后8至24小时（AI）进行成像，以确认完全切断，并在损伤后48至72小时（AI）进行成像，以评估再生情况。通过延时共聚焦成像，观察已受损的单个轴突/树突的退变与再生过程 体内 可以随时间进行监测。

<table><tbody><tr><td>乙醚，ACS级试剂，无水</td><td>Acros Organics</td><td>AC615080010</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon 27 油</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-133</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），20倍浓缩液，pH 7.5，供应商编号 E703-1L</td><td>VWR</td><td>97062-948&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>琼脂粉，Alfa Aesar，500克</td><td>VWR</td><td>AAA10752-36</td><td></td></tr><tr><td>葡萄汁</td><td>Welch&amp;rsquo;s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>95%乙醇（试剂级乙醇95%）</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>丙酸</td><td>J.T.Baker</td><td>U33007</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片：矩形</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td>50 mm × 22 mm</td></tr><tr><td>蔡司 LSM 880 激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 软件</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra II</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究周围和中枢神经系统神经再生的 drosophila in vivo 损伤模型

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

受损神经元的再生能力决定了神经系统损伤后的神经再生和功能恢复。在过去的几十年中，人们已鉴定出多种参与限制轴突再生的内在和外在抑制性因素。然而，单纯去除这些抑制信号不足以实现成功的再生，表明还存在其他调控机制。 黑腹果蝇，果蝇，与包括人类在内的脊椎动物共享进化上保守的基因和信号通路。结合果蝇强大的遗传工具箱与双光子激光轴突/树突切割技术，本文描述了 果蝇 感觉神经元——树突分支（da）神经元损伤模型作为系统筛选新型再生调控因子的平台。简而言之，该范式包括：a）幼虫的制备；b）利用双光子激光对树突或轴突进行损伤；c）损伤后的活体共聚焦成像；d）数据分析。本模型可对周围神经系统和中枢神经系统中特定神经元亚型的单个标记神经元、轴突和树突实现高度可重复的损伤。

多巴胺能神经元在周围神经系统与中枢神经系统之间的再生能力存在差异，且具有类别特异性。这为筛选轴突再生所必需的新因子（利用IV类周围神经系统损伤）以及抑制再生的因子（通过IV类中枢神经系统损伤和III类周围神经系统损伤）提供了独特的机会。
周围神经系统中的轴突再生
以III类和IV类da神经元的再生表征为例进行说明。这些神经元在每个体节中呈双侧分布。可在同一条幼虫中损伤多个神经元，通常选择腹部第A7至A2节段右侧的3-4个神经元。III类和IV类da神经元可分别通过19-12-Gal4, UAS-CD4tdGFP, repo-Gal80和ppk-CD4tdGFP进行可视化观察。按照前述方法麻醉并固定48-72小时龄（AEL）的幼虫，并调整幼虫位置，使目标da神经元朝上（<strong class="xfi...

在此，我们介绍一种使用 黑腹果蝇 感觉神经元 - 树突分支（da）神经元损伤模型，该模型结合了 体内 活体成像、双光子激光轴突/树突切割技术，以及强大的果蝇遗传工具箱, 作为筛选神经再生潜在促进剂和抑制剂的平台。

一种用于研究周围和中枢神经系统神经再生的 Drosophila In Vivo 损伤模型

受损神经元的再生能力决定了神经系统损伤后的神经再生和功能恢复。在过去的几十年中，各种……

该果蝇幼虫感觉神经元损伤模型的总体目标是将活体实时成像、双光子激光轴突/树突切割技术以及强大的果蝇遗传工具箱相结合，构建一个用于筛选神经再生潜在促进因子和抑制因子的平台。该方法将有助于解决神经再生领域中的关键科学问题，例如鉴定出调控神经再生的新型内在与外在因子，无论是在外周还是中枢神经系统中。该技术的主要优势在于，能够以简便、快速且低成本的方式对神经再生的候选分子进行筛选。尽管该系统可为神经再生研究提供见解，但也可应用于其他系统，例如神经退行性疾病和神经元-胶质细胞相互作用的研究。通常，初学者会遇到困难，因为用于模拟轴突与树突再生的实验设置不同，且采用了不同类型的神经元。对于幼虫收集，请按如下步骤准备培养瓶。使用刀片在果蝇培养瓶的瓶壁上打一个1.5厘米的孔，并用棉球填充该孔以实现通风。然后在葡萄汁琼脂平板上放置少量酵母糊，并用该平板封住培养瓶的主开口。在该培养瓶中，设置10只未交配雌蝇与5只雄蝇的杂交组合，在25摄氏度条件下培养，并每天更换平板。将收集的培养皿与浸有稀释丙酸的湿纸巾一同培养，以防止污染。从培养的培养皿中，用镊子采集所需发育阶段的幼虫。轻轻将挑取的幼虫转移至不含酵母膏的新葡萄汁琼脂平板上。当它们通过爬行完成自身清洁后，即可进行成像。每次成像开始时，打开成像激光器和显微镜。对于损伤实验，使用双光子显微镜。在成像软件中，将激光设置为以1950毫瓦的最大功率在930纳米处观察GFP。选择线扫描模式，并将针孔完全打开。然后将激光强度增加至满功率的约20%以造成外周神经系统（PNS）损伤，或增加至满功率的50%至100%以造成腹神经索（VNC）损伤。接下来，选择 512 像素 × 512 像素的方形帧进行扫描，并使用尽可能高的扫描速度。设置平均次数为 1，位深度为 8 位。然后将增益设为约 750，偏移设为 0。现在将此预设实验方案保存为 2P GFP 930 Ablation，以便在后续实验中轻松重复使用。对于损伤后成像，请使用共聚焦显微镜。首先将氩离子激光器设置为 488 纳米。选择采集选项卡，然后选择Z轴扫描。在激光部分，打开488纳米氩激光。接着进入通道，选择488纳米激光，并将激光功率增加至5%到10%。对于针孔，使用1到2个面积单位的选项。然后将增益调整至650。现在在采集模式中，选择1024×1024像素作为帧扫描，使用最大扫描速度。使用平均两个的数值和八位的位深度。将此预实验方案保存为GFP成像。首先麻醉幼虫。在通风橱中，将一个60毫米的玻璃培养皿放入15厘米的塑料培养皿中。然后将一张滤纸对折并放入玻璃培养皿内。在加入乙醚后，将葡萄琼脂平板放置在滤纸上。接下来，在玻璃载片中央滴加一滴Halocarbon 27油，并在四个角各放置一点真空脂。然后用镊子将一条幼虫转移到琼脂平板上，盖上玻璃培养皿以麻醉幼虫。一旦幼虫停止活动，立即将其小心转移至

a-drosophila-vivo-injury-model-for-studying-neuroregeneration

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使用高功率激光在指定神经元中诱导靶向性损伤 果蝇 幼虫

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学习利用双光子激光轴突/树突切断术和活体成像技术，在果蝇幼虫感觉神经元中建立神经再生筛选平台。该方法可快速、经济地筛选神经再生促进因子和抑制因子，适用于研究神经退行性疾病和神经元-胶质细胞相互作用。

一种用于研究周围和中枢神经系统神经再生的 Drosophila In Vivo 损伤模型

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