一种研究外周和中枢神经系统 Neuroregeneration 的果蝇体内损伤模型

这种果蝇幼虫感觉神经元损伤模型的总体目标是将体内实时成像、双光子激光轴切术/树突切开术和强大的果蝇遗传工具箱结合到一个平台中，用于筛选神经再生的潜在启动子和抑制剂。这种方法将有助于解决神经生成领域的关键问题，例如通过确定外周和中枢神经系统中神经生成的新的内在和外源调节因子。该技术的主要优点是可以以简单、快速和廉价的方式筛选神经再生的新型候选者。

虽然该系统可以提供对神经再生的见解，但它也可以应用于其他系统，例如神经退行性疾病和神经元-神经胶质细胞相互作用。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为使用利用不同类型神经元的不同实验设置来模拟轴突与树突再生。对于幼虫收集，请按如下方式准备培养瓶。

用刀片在果蝇培养瓶的一壁上打一个 1.5 厘米的孔，并用棉球填充孔以进行通风。然后在葡萄汁琼脂板上放少许酵母糊，用板塞住瓶子的主开口。在这样的瓶子中，设置 10 只处女雌性和 5 只雄性的杂交，并在 25 摄氏度下培养时每天更换板。

用浸泡在温和丙酸中的湿纸巾培养收集的板，以防止污染。从培养板中，使用镊子在所需阶段收获幼虫。轻轻地将采摘的幼虫转移到没有酵母糊的新葡萄汁琼脂平板上。

在它们通过爬行清理自己后，可以对它们进行成像。要开始每个成像会话，请打开成像激光器和显微镜。对于损伤，请使用双光子显微镜。

在成像软件中，将激光器设置为在 930 纳米处查看 GFP，最大功率为 1950 毫瓦。选择线扫描模式，然后完全打开针孔。然后将激光强度增加到全功率的 20% 左右以造成 PNS 损伤，或增加到全功率的 50% 至 100% 以造成 VNC 损伤。

接下来，选择 512 方形像素的框架进行扫描，并使用尽可能高的扫描速度。使用平均数 1 和位深度 8 位。然后将增益设置为大约 750，并将偏移设置为零。

现在将此预设实验方案保存为 2P GFP 930 消融，以便在进一步的实验中轻松重复使用。对于损伤后成像，请使用共聚焦显微镜。首先在 488 纳米处设置氩激光器。

选择 Acquisition 选项卡，然后选择 Z Stack。在 Laser（激光）下，打开 488 纳米氩激光器。接下来转到通道，选择 488 纳米激光器，并将激光功率增加到 5% 到 10%对于针孔，使用一到两个面积单位的选项。

然后将增益调整为 650。现在在采集模式下，选择 1024 个方形像素作为帧扫描。使用最大扫描速度。

使用平均数 2 和位深度 8 位。将此实验前方案保存为 GFP 成像。从麻醉幼虫开始。

在通风橱中，将 60 毫米的玻璃培养皿放入 15 厘米的塑料培养皿中。然后折叠一张薄纸，放入玻璃盘中。加入乙醚后，将葡萄琼脂平板放在纸巾上。

接下来，在载玻片上，在中心滴一滴卤烃 27 油，并在四个角上各放一点真空润滑脂。然后用镊子将一只幼虫转移到琼脂平板上，并盖上玻璃皿麻醉幼虫。一旦幼虫停止移动，小心地将其转移到卤烃油中，头部直立。

然后将盖玻片放在载玻片上并轻轻向下按压，直到它接触到幼虫。接下来，用轻柔的力量滑动盖玻片，将要烧蚀的细胞滚动到双光子激光最容易击中它们的位置。位置会有所不同，具体取决于所针对的神经元。

现在将组件固定在双光子显微镜载物台上，并使用 40 倍油浸物镜聚焦感兴趣的细胞。在软件中，切换到扫描模式并加载保存的协议。确保针孔完全打开。

然后在实时模式下，获得感兴趣区域的良好图像。接下来，停止实时扫描，以便 作物 按钮可用。使用 Crop 功能，调整扫描窗口，将目标区域仅聚焦在预期的受伤部位。

然后打开一个新的成像窗口。现在降低扫描速度并增加激光强度。然后切换 Continuous 按钮以开始和停止扫描。

仔细观察。一旦荧光急剧增加，就结束扫描。接下来切换回原始成像窗口并选择 实时模式，并通过调整焦点找到刚刚瞄准的区域。

受伤成功的一个很好的标志是在受伤部位出现小弹坑、环状结构或局部碎屑。如果激光功率过高，将看到大面积的损坏区域，这可能是致命的。现在小心地取下盖玻片，并将受伤的幼虫转移到装有酵母糊的新板上。

将板与丙酸浸泡过的纸巾一起放入 60 毫米的培养皿中。然后将板放回培养温度。对于幼虫的后续成像，利用保存的共聚焦设置，并使用 25 倍物镜收集 Z 堆栈图像。

确保包含归一化点，以便可以量化重新生成。使用所描述的方案，研究了 3 类和 4 类 DA 神经元的再生。通常，腹部 A7 至 A2 段右侧的 3 或 4 个神经元受伤。

具体来说，3 类 DDAF 和 4 类 V Prime ADA 神经元是目标。幼虫在受伤后 24 、 48 和 72 小时成像。在 24 小时时，远端轴突通常完成变性，轴突干很容易看到。

在 48 小时时，可以评估 4 类 DA 神经元的再生。这些神经元中约有 70% 在受伤部位之外再生。然而，即使在 72 小时后，很明显 3 类 DA 神经元未能再生。

这是根据对停滞生长球果的重复观察来评估的。观看此视频后，您应该对如何设置实验、执行双光子损伤和评估结果有很好的了解。一旦掌握，如果作得当，这项技术每只幼虫需要 15 分钟。

在尝试此过程时，重要的是要记住将实验生长与相应的对照并排进行比较。按照这个程序，可以进行免疫染色等方法来回答更多问题，例如轴突损伤是否会导致蛋白质易位，从而导致通路改变。自开发以来，这项技术为神经科学领域的研究人员探索果蝇幼虫感觉神经元的神经再生铺平了道路。

最后，不要忘记使用乙醚可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在通风橱中进行幼虫麻醉。