腺相关病毒介导的 CRISPR 在小鼠心脏基因编辑中的传递

该体内心脏基因编辑方案的总体目标是使用具有 CRISPR SaCas9 和向导 RNA 载体的重组腺相关病毒 rh. 74 恢复营养不良小鼠心脏中的抗肌萎缩蛋白表达。这种方法可以帮助回答肌营养不良领域的关键问题，例如基因编辑是否是治疗与杜氏肌营养不良症相关的心肌病根本原因的可靠治疗策略。

这些技术的主要优点是校正后的抗肌萎缩蛋白基因的表达处于其内源性调节控制之下，并且这种拯救效果是永久性的。该技术的含义延伸到其他遗传疾病的治疗，其中可以通过 CRISPR Cas9 基因编辑技术实现突变基因的纠正。这种方法不仅可以深入了解营养不良心脏中抗肌萎缩蛋白的恢复，还可以用于敲除目标基因以进行反向遗传研究。

演示该程序的是我们实验室的技术人员 Yandi Gao。向导 RNA 或 gRNA 的正确设计对于该方案的成功至关重要。为金黄色葡萄球菌 CRISPR 相关蛋白 9 选择两个靶向抗肌萎缩蛋白内含子 20 和内含子 23 的 gRNA。

每个 gRNA 的原始间隔区相邻基序序列用下划线和斜体表示。为了对 gRNA 寡核苷酸进行退火，在 1x 退火缓冲液中构建一个反应，每升含有 100 μmol 的 gRNA 寡核苷酸。使用以下 PCR 参数：95 摄氏度 10 分钟，95 至 59 摄氏度的 90 个循环，每个周期降低 0.4 摄氏度，持续 20 秒，59 至 32 摄氏度的 90 个循环，每个周期降低 0.3 摄氏度，持续 20 秒，以及 20 个 32 至 26 摄氏度的循环，每个周期降低 0.3 摄氏度，持续 20 秒。

接下来，准备在一个反应中将退火的 gRNA 寡核苷酸连接到 CRISP 载体中。将以下物质添加到试管中：每微升 CRISPR 载体 1 微升 50 纳克、1 微升退火寡核苷酸、1.5 微升 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、0.5 微升 T4 DNA 连接酶、1 微升 Bsal 和 10 微升双蒸水。在热循环仪中运行以下反应：5 次循环，37 摄氏度 5 分钟，16 摄氏度 10 分钟，37 摄氏度 20 分钟，80 摄氏度 5 分钟。

将 15 μL 连接产物转化到 30 μL 感受态细胞中，并将细胞接种在含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的琼脂平板上。在 37 摄氏度下培养 24 小时。第二天，从琼脂平板中挑选 5 到 10 个菌落，并在含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中培养，在 37 摄氏度和 250 rpm 转速下培养 3 到 4 小时。

为了通过 PCR 筛选菌落，制备反应物，每个反应物含有 10 μL PCR 预混液、8 μL 双蒸水、1 μL 大肠杆菌培养物、1 μL U6 正向引物和 1 μL i20 或 i23 gRNA 反向引物。使用以下 PCR 循环参数：95 摄氏度 5 分钟，然后是 35 个循环，分别是 95 摄氏度 30 秒、61 摄氏度 30 秒和 72 摄氏度 30 秒。鉴定出阳性克隆后，加入 4 毫升新鲜 LB 培养基（每毫升氨苄青霉素含量为 100 μg），并在 37 摄氏度和 250 rpm 下培养过夜，制备每个阳性克隆的 5 毫升培养物。

第二天，使用适当的质粒提取试剂盒纯化质粒 DNA。随后通过使用 U6 正向引物的 Sanger 测序来验证质粒。为了测试质粒的基因编辑功效，在补充有 10% FBS 和 1%Pen-Strep 的 DMEM 中培养 C2C12 细胞，直到细胞达到约 70% 汇合。

根据制造商的方案，将总共 5 微克 SaCas9/gRNA 质粒混合物以一比一的摩尔比电穿孔到 C2C12 细胞中。转染后 48 小时，收获 C2C12 细胞，并按照文本方案中的说明提取基因组 DNA。使用基因组 DNA 作为模板对小鼠抗肌萎缩蛋白位点进行 PCR。

构建包含正向引物、反向引物、绿色 PCR 预混液、双蒸水和 100 ng 基因组 DNA 的反应体系。使用与筛选阳性克隆相同的 PCR 条件。在开始此过程之前，请按照文本方案中的说明准备重组腺相关病毒或 rAAV。

通过腹膜内注射，用病毒颗粒全身施用第 3 天的 mdx 小鼠幼崽。让老鼠恢复，然后将它们放回家笼中。在 rAAV 给药后 10 周，从小鼠中收集组织。

快速冷冻组织以进行基因组 DNA 和 RNA 提取，并使用液氮中的冷却异戊烷冷冻组织，并使用最佳切割温度化合物进行冷冻切片。通过在室温下用 4% 多聚甲醛固定冷冻组织切片 5 分钟来开始免疫荧光染色方案。15 分钟后，用 PBS 洗涤组织切片两次。

与封闭溶液在室温下孵育 1 小时。接下来，与 anti-dystrophin 一抗在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天早上，用 PBS 洗涤玻片，然后在室温下与荧光二抗孵育 1 小时。

使用带有 DAPI 的安装介质安装载玻片，并使用倒置共聚焦显微镜成像。通过 PCR 评估 gRNA 诱导细胞培养物中靶基因组 DNA 区域缺失的功效。大约 500 个碱基对的 PCR 产物表明基因编辑导致的目标基因组 DNA 成功缺失，而对照细胞不应产生条带。

一旦 gRNA 的功效在细胞培养物中得到证实，gRNA 就会被包装到 rAAV 中。纯化 rAAV 病毒颗粒并通过 SDS-PAGE 分析纯度。仅存在对应于三个衣壳蛋白的三个条带表明纯度高。

这些用 AAV SaCas9 gRNA 处理的野生型、mdx 和 mdx 小鼠心脏切片的代表性免疫荧光图像系统地显示，AAV SaCas9 gRNA 可恢复营养不良小鼠的抗肌萎缩蛋白表达。看完这个视频，你应该对如何使用 rAAV rh 在出生后小鼠中实现体内心脏基因编辑有了很好的了解。SaCas9 和 gRNA 的 74 介导递送。