Name: 小鼠用树脂叶毒素和疼痛测试进行脑血管内治疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: 学习小鼠脑室内注射树脂叶毒素的方法，通过选择性脱敏TRPV1通道研究脊髓上区域疼痛调节机制。该技术为神经药理学研究提供了可靠的实验方案，有助于深入理解疼痛信号传导及潜在治疗靶点。

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本研究所采用的所有实验方案均经武藏野大学动物护理与使用委员会批准。雄性ddY小鼠（SLC，日本静冈）在实验前于12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养至少7天，自由饮水并随意进食。实验使用5周龄或6周龄的小鼠。
1. 药物的制备
<ol>
	<li>RTX 
	注意：含酒精的 RTX 溶液可能导致严重的皮肤灼伤和眼部损伤。操作时务必佩戴橡胶手套和护目镜进行防护。该储备溶液可使用 6 个月。
	<ol>
		<li>向 1 mg RTX 中加入 500 µL 乙醇。</li>
		<li>向上述溶液中加入 500 µL 聚氧乙烯（20）山梨醇单油酸酯，并充分涡旋混匀。</li>
		<li>向混合液中加入 4 mL 生理盐水，并充分涡旋混匀。</li>
		<li>将溶液分装为每管 40 µL 至 1.5 mL 螺口管中，于 -40 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对乙酰氨基酚
	<ol>
		<li>用 20% w/v 丙二醇溶液配制浓度为 30 mg/mL 的对乙酰氨基酚溶液，并使用超声仪溶解。由于对乙酰氨基酚在溶解后数小时于室温下可能析出，因此应现用现配，或在使用前保持溶液温热。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RTX的皮下或脑室内注射
<ol>
	<li>将上述步骤1.1中制备的储备液解冻，并用生理盐水或人工脑脊液（ACSF）稀释至20 µg/mL，ACSF的成分为（单位：mM）：119 NaCl、2.5 KCl、1 NaH2PO4、26 NaHCO3、11 葡萄糖、1.3 MgSO4、2.5 CaCl2，并用95% O2和5% CO2平衡（pH 7.2）。</li>
	<li>使用戊巴比妥钠（60 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠，并检查翻正反射是否消失。</li>
	<li>对于皮下（s.c.）给药，将RTX（20 µg/mL）以0.1 mL/10 g体重的体积注射至小鼠颈背部。对照组以相同方式注射溶剂（10%乙醇、10%聚氧乙烯（20）单油酸山梨醇酯和80%生理盐水）。</li>
	<li>对于脑室内（i.c.v.）给药，向右侧脑室注射5 µL RTX（20 µg/mL）。对照组以相同方式注射溶剂（10%乙醇、10%聚氧乙烯（20）单油酸山梨醇酯和80% ACSF）。
	<ol>
		<li>将一次性27号针头穿过金属套管（内径0.8 mm），使针头露出3.0–3.5 mm的尖端（图1A）。</li>
		<li>用70%酒精对小鼠头部进行消毒，并用手指牢固夹住小鼠的鳞状骨（图1B）。 
		注：注意鳞状骨突起的位置，因为这些突起将作为注射的定位标志。</li>
		<li>在头皮上横向移动针头，当针尖钩住矢状缝时即可定位该缝线。</li>
		<li>将针尖向右移动约1 mm，再向前移动针尖，参照步骤2.4.3的方法定位冠状缝（图1B）。</li>
		<li>缓慢垂直插入针头，约10秒内注入RTX溶液，随后留针约10秒。</li>
		<li>缓慢拔出针头，将小鼠放回其饲养笼。通常出血极少或无出血。若发生明显出血，应考虑更换另一只小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将预处理后的小鼠分配为RTX测试或尾部加压测试的实验对象（分别对应步骤3和4）。</li>
</ol>
3. RTX 检测
注意：测试在上午10:00至下午5:00之间进行。测试房间的光照强度保持在200勒克斯，温度保持在24-26 °C。
<ol>
	<li>在使用RTX进行预处理后一周（步骤2.），将小鼠转移至测试室，至少在测试开始前60分钟放入。</li>
	<li>在测试开始前至少30分钟，称重后将每只小鼠单独放置于一个有机玻璃笼子（29.5 × 17.5 × 13.5 cm3 高度）中，以适应环境。 
	注意：不同预处理组之间的测试顺序应进行交叉平衡。</li>
	<li>在测试前20分钟，通过腹腔注射给予小鼠对乙酰氨基酚（300 mg/kg）。</li>
	<li>将小鼠轻轻固定于小布袋中，将30号针头插入右后足的足跟部位，皮下推进针头至行走垫附近，注射20 µL RTX溶液（0.05 µg/mL）。</li>
	<li>记录每5分钟时间段内，受累足部无毛区域舔舐或啃咬行为的持续时间。</li>
</ol>
4. 尾部压力测试
注意：使用Randall-Selitto型压力计评估急性机械性伤害感受的阈值。测试在上午10:00至下午5:00之间进行。测试房间的光照强度保持在200勒克斯，温度维持在24-26 °C。
<ol>
	<li>在RTX预处理一周后（步骤2），将小鼠转移至测试室，称重后将每只小鼠单独放入一个聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）笼中。</li>
	<li>在距尾根部1.5 cm和2.5 cm处做标记。</li>
	<li>将小鼠松松地包裹在小布袋中，用钝头探针在标记处施加压力。 
	注意：设定250 g为压力上限，以避免组织损伤。</li>
	<li>确定引发逃避行为（如甩尾、扭转和吱叫）所需的压力，并通过取两处测量压力的平均值计算伤害性感受阈值。</li>
	<li>每15分钟重复一次步骤4.3至4.4。</li>
	<li>获得基线数据后，向小鼠腹腔注射对乙酰氨基酚（300 mg/kg）。给药后，每15分钟重复一次步骤4.3和4.4。</li>
</ol>

<ol><li>Cavanaugh, D. J., Chesler, A. T., Braz, J. M., Shah, N. M., Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+transient+receptor+potential+vanilloid-1+to+the+peptidergic+subset+of+primary+afferent+neurons+follows+its+developmental+downregulation+in+nonpeptidergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Restriction of transient receptor potential vanilloid-1 to the peptidergic subset of primary afferent neurons follows its developmental downregulation in nonpeptidergic neurons.</a> J Neurosci. 31 (28), 10119-10127 (2011).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).</li>
<li>Caterina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+nociception+and+pain+sensation+in+mice+lacking+the+capsaicin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor.</a> Science. 288 (5464), New York, N.Y. 306-313 (2000).</li>
<li>Starowicz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+endovanilloid+facilitation+of+glutamate+release+in+brainstem+descending+antinociceptive+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tonic endovanilloid facilitation of glutamate release in brainstem descending antinociceptive pathways.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (50), 13739-13749 (2007).</li>
<li>Gavva, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vanilloid+receptor+TRPV1+is+tonically+activated+in+vivo+and+involved+in+body+temperature+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The vanilloid receptor TRPV1 is tonically activated in vivo and involved in body temperature regulation.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (13), 3366-3374 (2007).</li>
<li>Marsch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+anxiety%2C+conditioned+fear%2C+and+hippocampal+long-term+potentiation+in+transient+receptor+potential+vanilloid+type+1+receptor-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduced anxiety, conditioned fear, and hippocampal long-term potentiation in transient receptor potential vanilloid type 1 receptor-deficient mice.</a> Journal of Neuroscience. 27 (4), 832-839 (2007).</li>
<li>Tzavara, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+activate+transient+receptor+potential+vanilloid+1+receptors+to+reduce+hyperdopaminergia-related+hyperactivity%3A+Therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids activate transient receptor potential vanilloid 1 receptors to reduce hyperdopaminergia-related hyperactivity: Therapeutic implications.</a> Biological Psychiatry. 59 (6), 508-515 (2006).</li>
<li>Nazıroğlu, M., Övey, İS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+apoptosis+and+calcium+accumulation+through+TRPV1+channels+in+neurobiology+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Involvement of apoptosis and calcium accumulation through TRPV1 channels in neurobiology of epilepsy.</a> Neuroscience. 293, 55-66 (2015).</li>
<li>Mallet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+in+brain+is+involved+in+acetaminophen-induced+antinociception%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">TRPV1 in brain is involved in acetaminophen-induced antinociception.</a> PloS one. 5 (9), 1-11 (2010).</li>
<li>Barrière, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+amide+hydrolase-dependent+generation+of+antinociceptive+drug+metabolites+acting+on+TRPV1+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fatty acid amide hydrolase-dependent generation of antinociceptive drug metabolites acting on TRPV1 in the brain.</a> PloS one. 8 (8), e70690(2013).</li>
<li>Jancsó, G., Kiraly, E., Jancsó-Gábor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologically+induced+selective+degeneration+of+chemosensitive+primary+sensory+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones.</a> Nature. 270 (5639), 741-743 (1977).</li>
<li>Szallasi, A., Blumberg, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanilloid+receptor+loss+in+rat+sensory+ganglia+associated+with+long+term+desensitization+to+resiniferatoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Vanilloid receptor loss in rat sensory ganglia associated with long term desensitization to resiniferatoxin.</a> Neuroscience Letters. 140 (1), 51-54 (1992).</li>
<li>Cavanaugh, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+subsets+of+unmyelinated+primary+sensory+fibers+mediate+behavioral+responses+to+noxious+thermal+and+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct subsets of unmyelinated primary sensory fibers mediate behavioral responses to noxious thermal and mechanical stimuli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (22), 9075-9080 (2009).</li>
<li>Jeffry, J. A., Yu, S. Q., Sikand, P., Parihar, A., Evans, M. S., Premkumar, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+targeting+of+TRPV1+expressing+sensory+nerve+terminals+in+the+spinal+cord+for+long+lasting+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Selective targeting of TRPV1 expressing sensory nerve terminals in the spinal cord for long lasting analgesia.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7021(2009).</li>
<li>Jancsó, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracisternal+capsaicin%3A+selective+degeneration+of+chemosensitive+primary+sensory+afferents+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Intracisternal capsaicin: selective degeneration of chemosensitive primary sensory afferents in the adult rat.</a> Neuroscience letters. 27 (1), 41-45 (1981).</li>
<li>Gamse, R., Saria, A., Lundberg, J. M., Theodorsson-Norheim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+neurochemical+changes+after+intracisternal+capsaicin+treatment+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Behavioral and neurochemical changes after intracisternal capsaicin treatment of the guinea pig.</a> Neuroscience Letters. 64 (3), 287-292 (1986).</li>
<li>Neubert, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mouse+orofacial+pain+and+the+effects+of+lesioning+TRPV1-expressing+neurons+on+operant+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pain%22%5BJournal%5D)">Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior.</a> Molecular pain. 4, 43(2008).</li>
<li>Karai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+vanilloid+receptor+1-expressing+primary+afferent+neurons+for+pain+control%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control.</a> The Journal of clinical investigation. 113 (9), 1344-1352 (2004).</li>
<li>Fukushima, A., Mamada, K., Iimura, A., Ono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supraspinal-selective+TRPV1+desensitization+induced+by+intracerebroventricular+treatment+with+resiniferatoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Supraspinal-selective TRPV1 desensitization induced by intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin.</a> Scientific reports. 7 (1), 12452(2017).</li>
<li>Haley, T. J., McCormick, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+effects+produced+by+intracerebral+injection+of+drugs+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+pharmacology+and+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse.</a> British journal of pharmacology and chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).</li>
<li>Tjølsen, A., Berge, O. G., Hunskaar, S., Rosland, J. H., Hole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formalin+test%3A+an+evaluation+of+the+method%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">The formalin test: an evaluation of the method.</a> Pain. 51 (1), 5-17 (1992).</li>
<li>Ohsawa, M., Miyabe, Y., Katsu, H., Yamamoto, S., Ono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+sensory+nerve+fiber+responsible+for+lysophosphatidic+acid-induced+allodynia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of the sensory nerve fiber responsible for lysophosphatidic acid-induced allodynia in mice.</a> Neuroscience. 247, 65-74 (2013).</li>
<li>Tanabe, M., Tokuda, Y., Takasu, K., Ono, K., Honda, M., Ono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthetic+TRH+analogue+taltirelin+exerts+modality-specific+antinociceptive+effects+via+distinct+descending+monoaminergic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+pharmacology%22%5BJournal%5D)">The synthetic TRH analogue taltirelin exerts modality-specific antinociceptive effects via distinct descending monoaminergic systems.</a> British journal of pharmacology. 150 (4), 403-414 (2007).</li>
<li>Ono, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+sympathetic+nerve+activity+as+a+possible+mechanism+for+the+hypothermic+effect+of+oseltamivir%2C+an+anti-influenza+virus+drug%2C+in+normal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+%26+clinical+pharmacology+%26+toxicology%22%5BJournal%5D)">Reduction in sympathetic nerve activity as a possible mechanism for the hypothermic effect of oseltamivir, an anti-influenza virus drug, in normal mice.</a> Basic & clinical pharmacology & toxicology. 113 (1), 25-30 (2013).</li>
<li>Kauer, J. A., Gibson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+flash%3A+TRPV+channels+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Hot flash: TRPV channels in the brain.</a> Trends in neurosciences. 32 (4), 215-224 (2009).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突

这些实验中最关键的步骤是脑室内注射（i.c.v.注射）的成功。此处使用的i.c.v.注射技术虽然较为简单，但需要一定的练习。在正式实验前，建议先使用染料（例如生理盐水中含0.5%台盼蓝）进行练习。如果注射操作正确，应在冠状缝处可见针尖痕迹，且注入的染料应出现在对侧脑室和第三脑室。此外，注射过程中应避免用力插入。若针尖正确放置于冠状缝位置，针头应能顺利穿透颅骨。
这种脑室内给药技术也可应用于清醒、未麻醉的小鼠，我们已报道过利用该技术检测药物的急性中枢作用23,24。尽管当前操作方法的优势在于无需特殊的插管设备，但脑室内注射仅能进行一次。若需重复给药，则必须进行插管处理。
本文介绍的RTX检测是一种易于使用的评估外周TRPV1功能的方法3,19。伤害性行为在注射1–10 ng RTX剂量时表现最为明...

动物通过外周神经上的感受器接收来自环境的各种物理和化学刺激。瞬时受体电位香草素亚型1（TRPV1）是一种热敏感的非选择性阳离子通道，可作为温度感受器1,2，已知在正常和炎症状态下，TRPV1的激活和/或调节是伤害性感受的关键步骤3。尽管其整体表达模式尚存争议，但已有研究提示TRPV1在脊髓上区域也有表达，并参与多种脑功能活动（包括伤害性感受4、体温调节5、焦虑6、注意缺陷多动障碍7和癫痫8）。此外，最近有研究表明，广泛使用的止痛药对乙酰氨基酚可通过激活中枢TRPV1来发挥其镇痛作用9,10。
向动物施用过量的TRPV1激动剂（包括辣椒素和树脂毒素（RTX））可导致TRPV1阳性神经元死亡，并对TRPV1激动剂产生持久性脱敏11,12。结合局部给药方式（鞘内13,14、小脑延髓池内15,16,17和神经节内18），这种化学消融方法为研究TRPV1的生理功能提供了替代手段。我们近期报道了脑室内（i.c.v.）注射RTX可抑制对乙酰氨基酚在小鼠中的镇痛作用，提示存在脊髓上选择性TRPV1脱敏效应19。在本论文中，我们提供了i.c.v.注射及后续疼痛检测的精确操作方案。
将药物直接注射到脑室中，可以在最小化外周效应的同时研究其中枢作用。本文介绍的脑室内（i.c.v.）注射方法是对Haley和McCormick20报道的方法进行的改良。该方法&#160;操作简便，通过冠状缝插入注射针至侧脑室，无需任何特殊设备或手术插管操作。
外周局部应用TRPV1激动剂可引发烧灼样疼痛感和神经源性炎症。全身性给予RTX处理的小鼠以及TRPV1基因敲除小鼠对该刺激不敏感13。我们通过足底注射RTX（RTX试验）来确认RTX-i.c.v.小鼠外周TRPV1功能的保留情况。该方法是对传统福尔马林试验的一种改良21。
已有报道称，经RTX全身处理的小鼠以及TRPV1基因敲除小鼠对机械刺激的反应阈值正常11,13,22。本文介绍了一种用于检测对乙酰氨基酚镇痛效果变化的尾部压力测试方法。
这些方法均为常规且通用的技术，可应用于其他药物的研究。

<table><tbody><tr><td>树脂毒素</td><td>LKT Laboratories</td><td>R1774</td><td>用于皮下/脑室内预处理及RTX测试</td></tr><tr><td>对乙酰氨基酚</td><td>IWAKI SEIYAKU</td><td></td><td>由IWAKI SEIYAKU赠送</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠盐</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>P0776</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>乙醇（99.5）</td><td>和光纯药工业</td><td>057-00456</td><td>用于溶解RTX</td></tr><tr><td>聚氧乙烯（20）山梨醇单油酸酯</td><td>和光纯药工业</td><td>161-21621</td><td>用于溶解RTX</td></tr><tr><td>25 &amp;#956;L 微量注射器</td><td>Hamilton</td><td>1702LT</td><td>用于脑室内注射</td></tr><tr><td>100 &amp;#956;L 微量注射器</td><td>Hamilton</td><td>1710LT</td><td>用于足底注射</td></tr><tr><td>26号一次性针头</td><td>TERUMO</td><td>NN-2613S</td><td>用于脑室内注射</td></tr><tr><td>30号一次性针头</td><td>NIPRO</td><td>01134</td><td>用于足底注射</td></tr><tr><td>压力计</td><td>Ugo Basile</td><td>Analgesy-Meter Type 7200</td><td>用于尾部加压测试</td></tr></tbody></table>

小鼠脑室内注射辣椒素类似物树脂毒素治疗及疼痛检测

Intracerebroventricular Treatment with Resiniferatoxin and Pain Tests in Mice

瞬时受体电位香草素亚型1（TRPV1）是一种对温度敏感的阳离子通道，已知可引发外周神经中的疼痛反应。除了其在外周的功能外，TRPV1参与脑功能的作用也已被提出。树脂毒素（Resiniferatoxin, RTX）是一种极强效的TRPV1激动剂，已知可诱导TRPV1的长期脱敏，而这种脱敏已成为研究表达TRPV1细胞生理相关性的替代方法。本文描述了一种在小鼠中进行脑室内（i.c.v.）注射RTX的实验方案。随后介绍了检测外周TRPV1刺激（RTX测试）和机械刺激（尾部压力测试）所致伤害感受的实验操作流程。尽管接受脑室内注射RTX的小鼠对外周刺激的伤害感受反应与对照组相当，但这些小鼠对对乙酰氨基酚的镇痛作用不敏感，提示脑室内给予RTX可诱导中枢神经系统选择性的TRPV1脱敏。该小鼠模型可作为研究TRPV1在脑/高级中枢功能中作用的便捷实验体系。这些技术也可应用于其他药物中枢作用的相关研究。

脑室内给药处理的小鼠在外观、自发活动、体重19和核心体温方面均未表现出明显异常（溶剂对照组：38.4 ± 0.3 °C，n = 6；RTX处理组：38.7 ± 0.2 °C，n = 6）。
图2A-B展示了皮下注射（s.c.）或脑室内注射（i.c.v.）处理的小鼠对足底注射RTX的反应性。溶剂处理小鼠在注射后前10分钟内表现出显著的舔咬行为19。尽管皮下预处理小鼠完全未表现出舔咬行为，但脑室内预处理小鼠对RTX足底注射仍表现出正常反应。此外，如图2B所示，腹腔注射对乙酰氨基酚（300 mg/kg）可减轻溶剂-脑室内处理小鼠的舔咬行为，但对RTX-脑室内处理小鼠的舔咬行为无明显影响。
<p class...

已有研究表明，脑内区域的瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）在脑功能中发挥一定作用。本文介绍了一种在小鼠中通过脑室内注射树脂毒素以实现脑内TRPV1去敏感化的实验方案。同时，还提供了若干疼痛检测实验的操作步骤。

瞬态受体电位香草素亚型1（TRPV1）是一种对温度敏感的阳离子通道，已知可在外周神经中引发疼痛。在……

本预处理的总体目标是建立一种小鼠模型，使其在脊髓上区域的TRPV1通道发生脱敏。该方法有助于解答神经药理学领域中的关键问题。该技术的主要优势在于，可通过一种相当简便的方法诱导脊髓上区域选择性TRPV1脱敏。开始此操作时，通过腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，并检查其翻正反射是否消失。对于皮下给药处理，将RTX以每毫升20微克的浓度按每10克体重0.1毫升的体积注射至小鼠颈部背部。对照组以相同方式注射溶剂。将一次性27号针头穿过金属管，使针尖露出3至3.5毫米。然后用手指牢固地固定小鼠的鳞状骨。将针头在头皮上横向移动，当针尖钩住缝合线时即可找到矢状缝。将针尖向右移动约一毫米，然后将针尖向头侧移动以找到冠状缝。随后缓慢垂直插入针头，在10秒内注射RTX溶液，注射完成后继续留针10秒。随后，缓慢拔出针头，并将小鼠放回其饲养笼中。在RTX注射后一周，于测试前至少60分钟，将小鼠转移至测试室。在测试前至少30分钟，将小鼠放入一个聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）笼中，以使其适应环境。然后在测试前20分钟，以每公斤300毫克的剂量向小鼠腹腔内注射对乙酰氨基酚。将小鼠松松地包裹在小布袋中，将30号针头插入右后肢足跟部。将针头皮下推进至足垫附近，注射20微升浓度为0.05微克/毫升的RTX溶液。随后，在每个五分钟的时间段内，测量小鼠患肢无毛区域舔舐和咬啮行为的持续时间。RTX注射一周后，将小鼠转移至测试室，放入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）笼中。在距离尾部基部1.5厘米和2.5厘米处做标记。接着，将小鼠轻轻放入一个小布袋中，用钝头探针在标记处施加压力。请注意，为避免组织损伤，设定的截断压力为250克。确定引发逃避行为所需的压力，并通过计算两个位点测得压力的平均值来确定伤害性感受阈值。每15分钟重复一次上述操作。在获得基线数据后，以每千克300微克的剂量向小鼠腹腔注射对乙酰氨基酚，随后每15分钟重复一次尾部压力测试，直至达到90分钟。这两张图显示了皮下注射（SC）或脑室内注射（ICV）处理的小鼠对足底注射RTX的反应性。溶剂处理小鼠在前10分钟内表现出明显的舔舐和啃咬行为。尽管皮下预处理小鼠完全未表现出舔舐和啃咬行为，但脑室内预处理小鼠仍正常地对足底注射RTX产生反应。此外，腹腔注射对乙酰氨基酚可减少脑室内给予溶剂的小鼠的舔咬行为，但对脑室内给予RTX的小鼠无此作用。该图显示了对乙酰氨基酚在尾部加压实验中以300微克/千克剂量产生的镇痛效果。在两项实验中，对乙酰氨基酚均降低了预先给予溶剂小鼠的伤害性反应，但对预先脑室内注射RTX的小鼠，对乙酰氨基酚的镇痛作用受到抑制。一旦掌握，该ICV注射技术也可用于其他药物。切记，操作树脂毒素（Resiniferatoxin）可能具有极高危险性，操作时务必佩戴橡胶手套和护目镜以进行防护。

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Research

科研

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Neuroscience

神经科学

小鼠用树脂叶毒素和疼痛测试进行脑血管内治疗

本视频演示了一种利用TRPV1激动剂树脂毒素（resiniferatoxin,...

使用树脂毒素建立小纤维神经病小鼠模型

来源：Fukushima, A., et al. 小鼠脑室内注射树脂毒素及疼痛测试. J. Vis. Exp.

小鼠脑内脑室注射树脂毒素实现TRPV1去敏感化治疗

来源：Martinez, E., et al. 啮齿类动物颅内药物治疗与疼痛检测。 J. Vis. Exp.

颅内与腹腔联合给药对大鼠热痛反应的协同镇痛效应

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建立纯小纤维神经病小鼠模型的瞬时受体电位香草素受体1超强激动剂方法

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细面条与细意面操作测试：大鼠和小鼠前爪灵巧功能的简单定量评估方法

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