Name: 用于细胞培养和皮肤应用的薄膜复合硅弹性体: 制造和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学习制造和表征用于细胞培养与皮肤应用的硅弹性体薄膜复合材料。该方法通过PDMS制备、粘附测量和L929细胞培养实验，可在约三小时内高效完成生产，为生物医学材料应用提供可靠技术支持。

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感谢 Martin Danner 在样品制备和细胞培养方案建立过程中提供的帮助。作者感谢德国汉堡 Biesterfeld Spezialchemie GmbH 公司，特别是 Robert Radsziwill，对本研究持续的支持与讨论。本研究工作获得了欧洲研究理事会（European Research Council）在欧盟第七个框架计划（FP/2007-2013）下的资助，项目编号为 340929。

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作者无任何利益冲突需要披露。

复合结构的设计使得材料性能（如杨氏模量或样品厚度）的调节变得简单。通过改变两种组分之间的混合比例，或使用不同的硅橡胶制备共混物，可以在较宽范围内有效调节聚二甲基硅氧烷（PDMS）的杨氏模量30,31。本研究所述方法不仅限于当前所用的PDMS类型，尤其粘附性能会显著依赖于所使用的具体类型。本实验方案中的一个关键步骤是复合薄膜的制备过程（图1）。研究表明，薄膜厚度显著影响其在不同基底（包括皮肤）上的粘附行为（图5 和 图6）。除了薄膜厚度外，固化过程中的时间和温度也会影响材料性能32。因此，聚合物层的厚度等参数必须仔细调整并验证。
采用法向力黏附测量法，使用两种不同表面粗糙度（最大至Ra = 0.338 µm）的玻璃基底对薄膜的黏附性能进行了分析（图3）。通常情况下，粗糙度对表面黏附性具有显著影响，尤其是对弹性材料的影响更为明显33,34。通过使用不同粗糙度的砂纸对玻璃进行研磨，可方便地调节其表面粗糙度，从而制备出具有更高粗糙度值的基底21。此外，也可使用其他材料（例如环氧树脂）制备基底15,35，这可能是本实验方案的重要改进策略。例如，当需要具有不同表面自由能或特定表面形貌的基底时。本研究中，采用自行搭建的装置（宏观黏附测量装置（MAD，图4））分析了由PDMS和SSA制成的薄膜的脱附应力和分离功36。基底与压头的光学对准是测量结果分析中的关键步骤，因此需尽可能精确地利用测角仪调节倾斜角度。该步骤可通过手动将基底与薄膜表面接触，直至实现水平接触，从而达到足够的精度。
在本实验方案中，保压时间保持恒定，为1秒（图5和图7）。特别是对于研究弹性薄膜与粗糙基底表面之间的粘附性能，延长保压时间可提供额外的信息。例如，已有研究报道，随着保压时间的增加，脱附应力也随之增大8。除了本方案中所进行的测量外，还可采用其他方法，例如剥离测试，以更全面地评估粘附性能37。
测定了具有不同软性表层胶粘剂厚度的复合薄膜的粘附性能（图7）。我们的结果与已发表的数据一致，表明随着限制度（i.e.，基底直径与薄膜厚度之比）的增加，薄膜厚度的减小会导致脱粘应力增大38,39。基于这些结果以及图7所示数据，我们得出结论：总厚度约为100 µm（在厚度约为40 µm的PDMS薄膜上涂覆一层厚度约为60 µm的SSA层）的复合薄膜在粗糙表面上表现出良好的粘附性能。
接下来，在原始复合薄膜和等离子体处理的复合薄膜上进行了与生物学表征相关的实验（图8）。对硅基弹性体进行等离子体处理是一种常用且多功能的技术，可增强表面的亲水性，并促进细胞黏附与铺展40,41。硅橡胶以其低毒性和高生物稳定性而著称，但可能含有残留的单体或催化剂，这些成分可能影响生理过程，从而导致细胞毒性42,43。在本研究的实验中，我们采用乳酸脱氢酶（LDH）释放作为指标，并结合台盼蓝排斥实验，观察到细胞毒性低于5%。在本方案中，增殖分析涵盖了全部细胞群体，包括从表面脱落的细胞聚集体（图9B）。对该方案的改进可获得更具区分性的结果：对于每个样品，可将含有脱落细胞聚集体的上清液转移至独立的反应管中，而不与通过酶法从聚合物表面解离的细胞混合。这种方法能够精确评估附着在表面的细胞数量，进而更详细地揭示聚合物对细胞黏附过程的影响。除了本文所介绍的免疫细胞化学方法外，还可收集细胞用于免疫印迹法分析，从而对蛋白表达水平进行详细的定量评估。
综上所述，我们已建立了用于生产超薄弹性复合膜的制造条件，可用于先进的细胞培养研究。此外，这些超薄薄膜对皮肤粗糙度具有高度适应性，能够实现皮肤粘合剂的精密设计。

本方案中介绍了制造薄型弹性体薄膜的详细方法。采用广泛使用的刮刀涂布技术来制备薄型复合薄膜。该制造工艺在聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜上进行，可实现此类薄膜的大规模后续生产。本方案的重点在于评估可重复性、精确制备复合薄膜的不同层结构，并测定最终复合贴片的生物学性能和粘附性能。有机硅弹性体聚二甲基硅氧烷（PDMS）在生物医学技术中被广泛应用，包括皮肤粘合剂、微流控应用及其他研究领域1,2,3,4。最近，另一类PDMS材料即所谓的柔软皮肤粘合剂（SSAs）已被引入，特别适用于温和的皮肤粘接与脱粘。
硅酮SSA是乙烯基官能化的弹性体，与类似聚合物的区别在于不含增强型二氧化硅5。与其他PDMS类似，通过调节交联剂浓度或固化时间，可在较宽范围内调整SSA的杨氏模量6,7,8 。硅酮弹性体杨氏模量的这种变化会显著影响材料的粘附性能，同时对培养在其表面的原核和真核细胞也产生深远影响9,10,11。在细胞生物学层面，已有研究表明，真核细胞在信号转导层面会响应基质弹性或表面厚度的调节9,10,12,13,14。因此，人们对具有可调机械性能的聚合物在细胞培养中的应用产生了广泛兴趣。重要的是，基于硅酮的弹性体本身表面能较低，无法为真核细胞的培养提供理想条件。氧气等离子体处理是一种广泛应用的技术，可暂时提高PDMS的低表面能，从而增强其剥离强度，减少分子在表面的吸附，同时促进真核细胞的贴附、铺展和增殖15,16,17,18。
除了材料特性外，表面形貌也显著影响细胞黏附以及两种材料之间的黏附相互作用19,20,21,22表面粗糙度对两个表面之间接触的形成具有多种影响：接触面积的减小、粗糙峰周围较高的弹性应变能以及对裂纹扩展的影响均可能改变黏附强度23,24自粘性薄膜与人体皮肤的粘附是一个新兴的应用领域， 例如， 伤口敷料，心电图电极或其他可穿戴电子设备的固定25,26,27,28为了测量自粘材料的粘附性能与表面形貌之间的关系，可在常规粘附力测试中使用具有不同粗糙程度的玻璃基底。8,21此处选择了两种玻璃基底来研究聚合物薄膜的粘附性能。首先，制备了以10:1质量比的PDMS作为背衬层、表面覆盖不同混合比例PDMS的复合薄膜，并对其进行表征。随后，在支撑性PDMS薄膜上，采用等量质量比的组分制备了粘附性SSA层，并调控其薄膜厚度进行进一步研究。

<table><tbody><tr><td>2-丙醇，97%</td><td>Stockmeier Chemie</td><td>1000452610000</td><td>异丙醇</td></tr><tr><td>金刚石研磨手垫</td><td>Bohle</td><td>MO 5007522</td><td>粒度：220</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Capricorn Scientific</td><td>ACC-1B</td><td></td></tr><tr><td>白蛋白第五组分</td><td>Roth</td><td>0163.2</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 鬼笔环肽</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A12379</td><td>高毒性</td></tr><tr><td>Aquamount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td>水溶性封片剂</td></tr><tr><td>CytoTox-ONE 均一性膜完整性检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G7890</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;、Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;的 DPBS</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>优质胎牛血清</td><td>GE Health Care Life Science</td><td>A15-151</td><td>FBS</td></tr><tr><td>接触角测量仪 OCA35</td><td>Dataphysics</td><td></td><td>用于静态水接触角测定</td></tr><tr><td>Hoechst 染料 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1155-100MG</td><td>双苯并咪唑 H 33342 三盐酸盐，高毒性</td></tr><tr><td>显微镜 Axiovert 25</td><td>Zeiss</td><td></td><td>用于细胞培养记录的显微镜</td></tr><tr><td>显微镜 Eclipse LV100ND</td><td>Nikon</td><td></td><td>用于薄膜厚度测定的显微镜</td></tr><tr><td>多聚甲醛，16% 水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td>电镜级</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Phenom XL 扫描电子显微镜（SEM）</td><td>Phenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇 4-88，分子量 31000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381-1KG</td><td>Mowiol 4-88</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷，Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>(400)000108351397</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>RPMI 1640 基础培养基</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>软性皮肤粘合剂（SSA）</td><td>Dow Corning</td><td>(400)000108251792</td><td>MG 7-9800 软性皮肤粘合剂（SSA）</td></tr><tr><td>高速混合器 DAC 600.2 VAC-P</td><td>Hauschild</td><td></td><td></td></tr><tr><td>触针式表面轮廓仪</td><td>Zeiss</td><td></td><td>型号：SURFCOM 1500SD3</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 pro</td><td>Tecan</td><td></td><td>荧光酶标仪</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Calbiochem</td><td>648466</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>高毒性</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA 溶液</td><td>PAN-Biotech</td><td>P10-023500</td><td>含 0.05% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的 PBS 溶液</td></tr><tr><td>紫外固化胶</td><td>Bohle</td><td>BO MV76002</td><td>中等黏度</td></tr></tbody></table>

用于细胞培养和皮肤应用的薄膜复合硅胶弹性体：制造与表征

Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

在本实验方案中，我们介绍了用于先进细胞培养应用及皮肤粘合剂开发的薄型弹性体复合膜的制备方法。研究中采用了两种不同的聚二甲基硅氧烷（PDMS 和软性皮肤粘合剂 SSA），以深入探究其生物学效应与粘附特性。该复合膜由柔性背层和粘性表层涂层组成，两层均采用刮刀涂布法制备。本研究考察了复合膜的粘附性能随涂层厚度或表层杨氏模量变化的关系。通过调节 PDMS 基体与交联剂的混合比例来改变其杨氏模量。此外，SSA 膜的厚度在约 16 µm 至约 320 µm 范围内进行调控。采用扫描电子显微镜（SEM）和光学显微镜进行厚度测量。弹性体薄膜的粘附性能强烈依赖于膜厚、聚合物的杨氏模量以及表面特性。因此，研究了这些薄膜在光滑和粗糙玻璃基底上的法向粘附性能。剥离应力和分离功均受硅酮弹性体混合比例的影响。
此外，通过改变置于支撑背衬层上方的软性皮肤粘合剂的厚度，制备了适用于皮肤的贴片。已对L929小鼠成纤维细胞在PDMS薄膜（混合比例10:1）和SSA薄膜（混合比例50:50）上的细胞毒性、增殖及细胞粘附性进行了研究。本文首次并列比较了由这两种聚合物制成的薄型复合薄膜，并对其生物学性能和粘附性能进行了考察。

本文介绍了一种用于制备具有不同杨氏模量或厚度的聚合物薄膜复合结构的制造工艺。所制备的薄膜可用于高级细胞培养研究或作为皮肤粘合剂。

在本方案中，我们介绍了制备用于先进细胞培养应用及皮肤模拟物开发的薄型弹性体复合薄膜的方法。

本实验的总体目标是制备并表征用于高级细胞培养研究或作为皮肤粘合剂的聚合物薄膜复合结构。该方法有助于解答关于弹性体复合材料如何在不规则表面上实现最佳粘附效果的关键问题。这些技术的主要优势在于其操作简便且具有广泛的适用性。这使得能够以极高的精度进行大规模制造。通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为黏附力测量需要经过 intensive 的培训和练习才能达到所需的精度。细胞培养操作和等离子体应用的演示将由本实验室的技术员 Angela Rutz 进行。制备PDMS时，在真空条件下，将1.1克预聚物混合物置于高速混合器中，以2350 RPM转速搅拌并脱气3分钟。制备PDMS背衬层时，使用自动控制的刮刀涂布机。将刮刀置于经100%异丙醇清洗过的PET薄膜上，并利用微调定位螺钉调节背衬层的厚度。将PDMS装入一次性10毫升注射器中。用聚合物填充刮刀的储液槽，并以约2毫米/秒的速度启动刮刀移动。当PET薄膜涂覆完成后，将薄膜转移至95°C的烘箱中加热一小时。为了制备复合薄膜的上层，使用刀片从基底层的长边去除薄条。使刮刀能够在 PET 薄膜上滑动，并如前所述涂覆第二层 PDMS。然后，将薄膜放入烘箱中。为进行黏附力测量的样品制备，使用剃刀将 PET 酞基薄膜切割成面积为 4 平方厘米的片状，并使用紫外光固化胶将这些片状样品固定在玻璃载片上。用紫外光照射样品 3 分钟，然后将第一个聚合物样品安装到样品台上。使用测角仪调节倾斜角度，直至基底与聚合物薄膜表面完全平行接触，该状态可通过相机图像进行观察确认。基底与样品的光学对准对于解读测量结果至关重要。因此，必须使用倾角仪尽可能精确地调整倾斜角度。将已对准的基底移动至聚合物薄膜表面，直至达到13 ± 5千帕的预加载应力，然后启动用LabView编写的自定义程序软件包。然后，设置所需的测量参数，以测量每张薄膜表面六个不同位置上三个独立制备样品的黏附性能。为进行光学显微镜观察，使用剃刀将聚合物样品切割成0.25平方厘米的片状，并将这些片状样品贴附在玻璃载玻片的边缘。接着，将载玻片垂直放置在正置显微镜下，测量薄膜横截面的厚度。为准备细胞培养实验，首先使用手术刀从 PET 支撑层上切割出约 5×5 毫米的片状样品，并用镊子将这些样品转移至各自的 12 毫米玻璃盖玻片上。将盖玻片放入等离子体设备的反应室中，并关闭设备盖子。抽真空至反应室内压力达到 1.6×10⁻² 毫巴，随后对薄膜进行 3 分钟的等离子体处理。然后，通风反应室并将样品转移至24孔板的各个孔中。接着，在超净工作台中用不含钙和镁的DPBS冲洗70%至80%融合度的L929细胞培养物30秒。随后在37°C、5% CO₂条件下，用两毫升适当的蛋白酶和胶原酶溶液孵育五分钟。当细胞脱落后，加入8毫升含血清的培养基，将细胞转移至15毫升锥形管中。计数后，按每毫升培养基接种60,000个细胞的密度，接种于含有聚合物样品的24孔板各孔中，随后将培养板置于细胞培养箱中孵育三天，之后进行相差显微成像及固定。根据顶层薄膜的厚度不同，无论基底表面形貌如何，随着薄膜厚度的增加，均观察到脱附应力下降。然而，与光滑基底表面相比，粗糙基底表面的分离功通常略低。当记录剥离机制时，最薄的薄膜上观察到的空化现象较少，而在较厚的薄膜上则可观察到指状裂纹的出现。细胞培养实验表明，接种在原始聚合物表面的细胞表现出较差的黏附和铺展行为，而在经等离子体处理的表面培养的细胞则形成融合的单层细胞层。总体而言，细胞在两种聚合物材料上培养时，乳酸脱氢酶水平相似，细胞毒性低于5%。一旦掌握，聚合物薄膜复合材料的制备可在约三小时内完成。尽管后续采用常规粘性测试进行分析需要经过培训，但该方法是研究薄膜黏附性能的有力工具。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备薄型聚合物复合膜，并利用特定的黏附力测试和细胞生物学工具对这些薄膜进行分析。请务必注意，操作化学品和生物材料可能具有极高危险性，因此必须采取适当的预防措施，例如遵循强制性的安全操作规程、佩戴个人安全防护装备，并在安全柜内处理这些材料。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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