从小鼠眼球中激光捕获显微切割高纯度小梁网用于基因表达分析

本激光显微切割实验的总体目标是建立一种稳定且可重复的方法，利用激光捕获显微技术从小鼠眼球中分离出高度富集的小梁网组织，进而进行RNA提取及后续的表达分析。该方法有助于解答眼科领域中的关键问题，例如：哪些重要基因和信号通路在调控异常时可能导致眼病的发生。该技术的主要优势在于，能够从小鼠眼球的小梁网中可重复地分离出高质量的RNA，用于基因表达分析。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为激光显微切割是一种强大的技术，整个实验流程中涉及多个需要排查的问题。应按照文本方案中所述，从优化组织样本采集开始进行激光显微切割操作。将RNase去污染溶液喷洒在毛刷、镊子、耦合罐和载物台夹具上。

彻底擦拭后，用无核酸酶的水冲洗仪器并晾干。用100%乙醇擦拭冷冻切片机，以避免交叉污染。挤少量O.C.T.至持样夹上，然后将组织块从模具中取出，并小心地将其放置在持样夹上。

当固定在持样夹上的组织块完全冻结后，将其插入冷冻切片机的样本架上。随后调整冷冻切片机以切出八微米厚的切片，并小心切过O.C.T.包埋块，直至暴露组织样本。一旦观察到组织，即停止切片。

使用洁净的剃刀从各个方向修整冷冻组织块，周围保留三到四毫米的O.C.T.包埋剂，以便用画笔进行操作。快速切穿眼球组织。每间隔两个切片，取一个切片进行染色，将切片置于载玻片上，滴加快速一步式H&E染液，染色60秒。

用自来水冲洗切片并自然晾干。使用透明剂透明切片后，将切片置于带电荷的玻片上，加盖盖玻片，于显微镜下观察。继续切片，直至染色切片中明显可见鼓膜（TM）。

一旦出现鼓膜组织，即刻切取两段，贴附于带电荷的玻璃载玻片上，进行常规苏木精-伊红（H&E）染色，以制备用于激光显微切割的定位图谱。在制备完第一张H&E染色定位图谱载玻片后，在冷冻切片机中连续切取六张厚度为8 µm的连续切片，并将其依次贴附于PET膜载玻片上。通过戴手套的拇指在膜背面轻轻滑动，使组织牢固黏附。

安装后，立即将 PET 膜玻片放入盛有干冰的玻片盒中。继续切片眼球组织。每切完两张各含六个切片的 PET 膜玻片后，取两个切片收集到一张带电荷的玻璃玻片上，以制备另一张用于 H&E 染色的定位玻片。

继续切取约100张连续的8微米厚切片，直至小梁网（TM）不再可见。通过将一张切片快速染色于带电荷的玻璃载片上，确认小梁网的缺失。按照文本方案中所述进行H&E染色制片后，使用显微镜目视检查H&E染色切片。

确定组织芯片切片上 TM 标记清晰可见且便于切割。在这些组织芯片切片之间使用 PET 膜切片进行激光显微切割（LCM）。从 -80 摄氏度冰箱中取出含有冷冻组织切片的切片盒，并将其放置于干冰上。

每次处理一张载玻片。将载玻片立即浸入含有RNase抑制剂的冷75%乙醇中固定30秒。随后将载玻片轻轻浸入无核酸酶水中10至15秒，以溶解O.C.T.包埋剂，同时不干扰组织切片。

用移液器小心地将300微升1.5%醋酸克里西尔紫溶液直接滴加到切片上，在室温下孵育45秒。然后将切片放入75%乙醇溶液中浸泡30秒，清洗一次。再向切片上滴加200微升伊红Y溶液，孵育3至5秒。

将切片依次放入75%乙醇、95%乙醇，最后放入100%乙醇中，每步30秒，以脱水组织。每步之间用纸巾轻轻吸干切片末端，去除多余液体。将切片置于通风橱中完全空气干燥5分钟。

干燥后，立即进行激光显微切割。避免在最后的透明步骤中使用二甲苯。二甲苯处理会导致组织切片无法充分贴附到膜片上。

二甲苯还会降低激光显微切割捕获组织的效率。将带有染色组织面朝下的PET膜载玻片直接放置在已装入显微镜载物台的新玻璃载玻片上。确保膜与玻璃载玻片在显微镜载物台上紧密贴合。

开始激光显微切割（LCM）时，首先设置切片范围。在物镜面板中选择最低的4X放大倍数，然后通过移动显微镜的XY载物台，使金属与膜交界处的左上角在实时视频中可见，从而确定膜切片的工作区域。此时，按下“Limit 1”按钮，路线图上将出现一个红色矩形。

接下来将XY载物台移动到对角，然后按下“限位2”按钮。按下“扫描”按钮，以生成设定限位范围内膜及组织的概览图像。在概览图像中，于其中一只眼球切片的鼓膜附近双击。

小梁网可位于虹膜角膜角的顶端附近。一旦确定小梁网位置，将放大倍数调至10倍，并手动对小梁网进行聚焦。随后使用20倍和40倍物镜重复此操作。当使用40倍物镜使小梁网清晰对焦后，移动至组织的空白区域，选择自由手绘工具，在组织的空白区域绘制一条长线。

设置激光参数，使切割速度为34%，焦距为58%，功率为70%，然后按下“切割”按钮。微调激光的速度、焦距和功率参数，直至观察到清晰且精细的切割线。进行精确切割时，确保切割轨迹与所绘制的线条一致。

接下来，将分离管盖装入盖子固定架并打开管子。将盖子固定架连接到盖子提升装置上，并确保管子处于倒置状态。同时，确保粘性盖子材料突出于盖子尖端之外，以保证目标组织被正确捕获。

必须直观确认小梁网被钩住并附着在分离帽上。在软件面板上选择手动解剖模式。仔细检查小梁网是否正位于分离管下方。

设置白平衡并调节亮度以获得最佳图像质量。开始切割前，手动调节焦距，并使用手绘工具画一条线。确保收集盖处于上方位置，尚未接触膜。

在虹膜小梁（TM）与巩膜交界处附近绘制部分圆圈，然后按“切割”键。完成首次切割后，将帽状刀头移至下方位置并重新调整焦距，接着在开放或空白区域绘制两条线，连接两个部分圆圈，从而完成围绕虹膜小梁的完整圆周。然后按“切割”键，并从该区域收集组织。确保虹膜小梁已被显微解剖刀头捕获。

将盖子重新放回上方位置，并在其余部分重复此操作。略微调整盖子的位置，确保所有分离的样本都能放置在盖子上且不相互重叠。对于下一个PET膜，插入新的分离管，并重复本步骤。

为了裂解显微切割的巩膜微细组织（TM），请小心地将10微升裂解缓冲液用移液器滴加到收集管的管盖上，确保裂解缓冲液完全覆盖显微切割的TM组织。轻轻盖上粘性盖子，并将收集管倒置在室温下孵育10分钟。孵育结束后，在800 ×g条件下离心2分钟，并将裂解液置于干冰上。将裂解液在-80摄氏度条件下保存，用于后续的纯化与分析。

快速降解的RNA可能影响下游的RNA分析。应使用基于微流控技术的平台对RNA质量进行检测和定量。此处展示了从小梁网组织中纯化的高质量总RNA进行基因表达分析的代表性结果。

激光显微切割后从眼组织中提取的剩余总RNA的数字凝胶显示其RNA完整性数值较高，这是后续下游RNA分析所必需的。一旦从组织中获得高质量的RNA，即可进行微阵列、RNA-Seq和qPCR等下游分析。本研究采用定量数字PCR分析了由LCM收集的RNA中与小梁网相关的基因myocilin和ACTA2的表达水平。

通过微阵列分析获得的数据生成的热图表明，该技术可用于了解野生型小鼠和具有高眼压表型的基因敲除小鼠小梁网组织中基因表达的变化。一旦掌握，若操作得当，每只实验动物仅需一天即可完成该技术。由于难以观察到目标细胞，且此类独特样本缺乏标准化操作流程，激光显微切割步骤的学习难度较高，因此该方法的可视化演示至关重要。

依赖熟练的操作人员至关重要。在进行该操作时，必须注意少量组织中的 RNA 可能会迅速降解。应采取预防措施，例如对设备进行 RNase 去污染、尽量减少组织暴露于空气中的时间，以及保持组织低温。

尽管该方法可揭示眼内压升高对小梁网特异性基因表达的影响，也可应用于其他系统，例如评估眼内压升高引起视网膜基因表达的变化。在完成该操作后，可进一步采用RNA-Seq或微阵列等方法，以回答更多问题，例如在眼内压升高的小鼠小梁网中哪些信号通路发生了改变。该技术建立后，为研究人员更有效地在小鼠模型中研究小梁网基因表达变化奠定了基础。