从小鼠眼中激光捕捉高纯大梁网的基因表达分析
June 3rd, 2018
在这里, 我们描述了一个可重现的激光捕获显微切割 (LCM) 的协议, 用于分离小梁网 (TM) 的下游 RNA 分析。分析 tm 基因表达变化的能力有助于了解 tm 相关眼部疾病的基本分子机制。
该激光显微切割程序的总体目标是开发一种稳健且可重复的方法，用于使用激光捕获显微镜从小鼠眼睛中分离高度丰富的小梁网，用于随后的 RNA 分离和下游表达分析。这种方法可以帮助回答眼科领域的关键问题，例如当调控错误时会导致眼部疾病的重要基因和信号通路是什么。该技术的主要优点是可以可重复地分离来自小鼠眼睛小梁网的高质量 RNA，用于基因表达分析。
通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为激光显微切割是一项强大的技术，它涉及整个协议中的各种故障排除步骤。如文本方案中所述，从激光显微切割的最佳组织收集开始此过程。将 RNase 去污溶液喷洒在刷子、镊子、耦合罐和安装卡盘上。
彻底擦拭后，用不含核酸酶的水冲洗设备并擦干。用 100% 乙醇擦拭低温恒温器，以避免交叉污染。将少量 O.C.T. 挤到安装卡盘上，然后从模具中取出纸巾块，小心地将纸巾块放在安装卡盘上。
一旦安装卡盘上的组织块成为冷冻固体，插入低温恒温器的样品架上。接下来，调整低温恒温器以切割 8 微米的切片，并小心地穿过 O.C.T.block 以到达组织样本。观察组织后，停止切片。
使用干净的剃须刀片修剪四面八方的冰块，并在组织周围留出 3 到 4 毫米的 O.C.T.，以便用油漆刷处理。切面穿过眼睛，快速工作。用快速一步 H&E 染色剂淹没玻片 60 秒，每三个切片染色一次。
用自来水冲洗切片并风干。用清除剂清除切片后，用盖玻片将切片安装在带电的载玻片上，在显微镜下查看。继续切片，直到 TM 在染色切片中变得明显。
一旦 TM 开始出现，切割两部分并将它们安装在带电载玻片上进行常规 H&E 染色，以形成用于激光捕获显微切割切割的图谱。在第一张 H&E 映射载玻片之后，在低温恒温器中切割并排列六个连续的 8 微米厚的切片，然后同时将它们安装到 PET 膜载玻片上。用戴手套的拇指沿着膜的背面短暂滑动，粘附组织。
封片后，立即将 PET 膜载玻片放入干冰上的载玻片盒中。继续对眼睛进行切片。在每两张 PET 膜载玻片（每张载玻片有六个切片）之后，在带电的载玻片上收集两个切片，以创建另一个用于 H&E 染色的图谱载玻片。
继续切片大约 100 个 8 微米厚的连续切片，直到 TM 不再可见。通过在带电的载玻片上快速染色一个切片来确认 TM 的缺失。按照文本协议中的说明进行 H&E 图载玻片染色后，使用显微镜目视查看 H&E 载玻片。
使用 TM 识别地图幻灯片，清晰可见且易于切割。使用这些映射载玻片之间的 PET 膜载玻片进行 LCM。从零下 80 摄氏度的冰箱中取出装有冷冻组织切片的载玻片盒，并将其放在干冰上。
一次处理一张幻灯片。将玻片立即放入含有 RNase 抑制剂的 75% 冷乙醇中 30 秒，以固定切片。将玻片轻轻浸入不含核酸酶的水中 10 至 15 秒，以溶解 O.C.T.，而不会干扰组织切片。
小心地将 300 微升 1.5% 甲酚紫乙酸溶液直接移液到切片上，并在室温下孵育 45 秒。然后将切片放入 75% 乙醇浴中 30 秒，清洗切片一次。将 200 微升 Eosin Y 溶液移液到切片上，孵育 3 到 5 秒。
随后将载玻片放入 75% 乙醇、95% 乙醇中，最后放入 100% 乙醇浴中，每次 30 秒，使组织脱水。在每个步骤之间用纸巾擦拭玻片的末端，以去除多余的液体。让载玻片在引擎盖下完全风干 5 分钟。
干燥后，立即进行 LCM。避免在最后的清除步骤中使用二甲苯。二甲苯处理会导致组织切片不能充分附着在载玻片上。
二甲苯还会降低 LCM 捕获组织的效率。将 PET 膜载玻片，染色组织面朝下，直接放在已加载到显微镜载物台上的新载玻片的顶部。确保膜和载玻片在显微镜载物台上紧密配对。
首先通过设置玻片限制来启动 LCM。在"物镜"面板中选择最低的 4 倍放大倍率，然后通过移动显微镜的 XY 载物台来定义膜载玻片的工作区域，直到在实时视频源中可以看到金属和膜相遇的左上角。此时，按下 限制 1 按钮，路线图上会出现一个红色矩形。
接下来，将 XY 舞台移动到对面的角落，然后按 Limit 2（限制 2）按钮。按下 Scan 按钮，在设定的限值之间创建膜和组织的路线图图像。双击路线图中其中一个眼部部分的 TM 附近。
TM 可以位于虹膜角膜角的顶点附近。识别出 TM 后，将放大倍率增加到 10 倍并手动聚焦在 TM 上。重复 20 倍和 40 倍物镜。当 TM 与 40 倍物镜聚焦时，导航到空白区域，选择手绘工具，然后在组织的空白区域上画一条长线。
设置激光参数，使切割速度为 34%，焦距为 58%，功率为 70%，然后按下切割按钮。对速度、焦距和功率参数进行精细的激光调整，直到观察到清晰细腻的切割线。为了进行精确切割，请确保切割动作遵循绘制的线条。
接下来，将隔离管盖装入瓶盖支架并打开管。将瓶盖支架安装到瓶盖提升器上，并确保管子倒置。还要确保粘性盖材料伸出盖子的尖端，以确保正确捕获所需的组织。
目视确保小梁网被拾取并连接到隔离帽上至关重要。在软件面板上选择 Manual Dissection（手动解剖）模式。仔细检查 TM 是否位于隔离管的正下方。
设置 白平衡 并调整 亮度 以获得最佳图像质量。要开始剪切，请手动调整焦距并使用手绘工具画一条线。确保收集盖保持在向上位置，尚未接触膜。
在 TM 与巩膜相交的位置附近画一些圆圈，然后按 Cut。完成第一次切割后，将盖子置于向下位置并重新调整焦距，然后在开放或自由空间中画两条线以连接两个部分圆圈，完成围绕 TM 的圆圈。然后按 切 并从切片中收集组织。确保显微解剖帽拾取 TM。
将瓶盖放回向上位置，然后在其余部分重复。稍微调整瓶盖位置，使所有分离的样品都适合瓶盖而不会重叠。对于下一个 PET 膜，插入新的隔离管并重复此部分。
要裂解显微解剖的 TM 组织，请小心地将 10 微升裂解缓冲液移液到收集管的盖子上，确保裂解缓冲液完全覆盖显微解剖的 TM。轻轻盖上粘性盖，将收集管倒置在室温下孵育 10 分钟。孵育后，以 800 g 离心 2 分钟，然后将裂解液置于干冰上。将裂解物储存在零下 80 摄氏度，以便以后进行纯化和分析。
快速降解的 RNA 会影响下游 RNA 分析。应使用基于微流体的平台测量和定量 RNA 质量。此处显示了从小梁网中纯化的高质量总 RNA 的基因表达分析的代表性结果。
激光显微切割后眼组织中剩余总 RNA 的数字凝胶显示高 RNA 完整性值，这是后续下游 RNA 分析所必需的。从组织中提取出优质 RNA 后，即可进行下游分析，如微阵列、RNA-Seq 和 qPCR。在这里，使用定量数字 PCR 分析来分析 LCM 收集的 RNA 中小梁网状相关基因、肌纤蛋白和 ACTA2 的表达。
从微阵列分析获得的数据生成的热图表明，该技术可用于了解野生型小鼠和 IOP 表型升高的敲除小鼠小梁网中的基因表达变化。一旦掌握，如果作得当，每只生物动物可以在短短一天内完成这项技术。这种方法的视觉演示是必不可少的，因为激光显微切割步骤很难学习，因为目标细胞的可视化困难，而且这些独特样品没有标准品。
依靠熟练的作员至关重要。在尝试此过程时，重要的是要记住少量组织中的 RNA 会迅速降解。应采取预防措施，例如对设备进行 RNase 净化、尽量减少与空气的接触以及保持组织低温。
虽然这种方法可以深入了解眼压升高对小梁网特异性基因表达的影响，但它也可以应用于其他系统，例如评估由眼压升高引起的视网膜基因表达变化。在此程序之后，可以执行其他方法，如 RNA-Seq 或微阵列，以回答其他问题，例如眼压升高的小鼠小梁网中哪些信号通路发生了变化。开发后，这项技术为研究人员更有效地研究小鼠模型中小梁网的基因表达变化铺平了道路。
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概述
本文介绍了一种激光捕获显微切割（LCM）协议，旨在从小鼠眼中分离小梁网（TM）用于RNA分析。该方法有助于加深对眼部疾病相关基因表达变化的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 眼科
- 基因表达分析
- 激光捕获显微切割
背景
- 小梁网对眼部健康至关重要。
- TM中基因的错误调控可能导致眼部疾病。
- 高质量的RNA分离对于准确分析至关重要。
- 激光显微切割需要谨慎的技术和故障排除。
研究目的
- 开发一种可重复的TM分离方法。
- 促进下游RNA分析。
- 识别眼部疾病相关的关键基因和途径。
使用的方法
- 用于组织分离的激光捕获显微镜。
- 最佳组织采集技术。
- RNase去污程序。
- 基因表达研究的RNA提取。
主要结果
- 成功从TM中分离出高质量的RNA。
- 识别与眼部健康相关的基因表达变化。
- 建立了一个可靠的协议供未来研究使用。
- 对TM相关疾病的分子机制有了新的认识。
结论
- LCM方法对TM分离是有效的。
- 研究结果有助于理解眼部疾病机制。
- 该协议可以帮助未来的眼科研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Laser capture microdissection enables precise isolation of trabecular meshwork from mouse eyes, providing a reproducible source of high-quality RNA for gene expression analysis. This approach supports target validation in glaucoma research by linking molecular changes in a disease-relevant tissue to intraocular pressure regulation. The method enhances predictive confidence in preclinical models by reducing biological noise from heterogeneous tissue samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of trabecular meshwork-specific gene expression to validate therapeutic targets in glaucoma pathways.
- Operational Value: Provides a standardized method for isolating pure cell populations, reducing variability in downstream molecular assays.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating RNA from anatomically defined ocular compartments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-integrity RNA suitable for quantitative PCR, microarray, and RNA-Seq applications in target screening.
- Operational Value: Establishes a reproducible workflow for serial sectioning and LCM collection, enabling assay standardization across studies.
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological samples for reliable compound evaluation in phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects gene expression changes in trabecular meshwork to elevated IOP phenotypes, supporting disease-relevant system modeling.
- Operational Value: Enables longitudinal analysis of molecular changes across wild-type and knockout models, improving translational continuity.
- Scientific Value: Assists in identifying transcriptional biomarkers associated with glaucoma progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by providing purified tissue inputs for molecular profiling, supporting hypothesis-driven target identification and pathway analysis in ocular disease models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing through isolation of trabecular meshwork for gene expression profiling in genetic and pharmacological models.
- Screening: Delivers standardized RNA samples with high integrity numbers, ensuring reliable readouts in gene expression assays.
- Analytics: Produces quantifiable outputs from digital PCR, microarray, and sequencing platforms for comparative condition analysis.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by linking TM-specific molecular signatures to IOP elevation phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a adaptable platform for isolating other ocular compartments, increasing utility across multiple discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing cellular heterogeneity in gene expression data.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized fixation, staining, and LCM parameters.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by providing mechanistic insights into IOP-regulating pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on disease-relevant expression changes in trabecular meshwork.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, cryosectioning, and laser capture microscopy.
- Dependent on RNase-free environment, cryostat, UV laser microdissection system, and RNase inhibitor-treated reagents.
- Necessitates standardization of staining, fixation, and dehydration steps across operators and laboratories.
- Adaptation to other ocular tissues may require optimization of section thickness and staining protocols.
- Limited by RNA degradation risk; demands rapid processing and cold-chain maintenance post-dissection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Frozen Section Preparation for Laser Microdissection
4:25
Polyethylene Terephthalate (PET) Membrane Slides Processing and Staining Protocol
6:14
Laser Microdissection with UV Laser
11:01
Results: Evaluation of RNA Quality and Downstream RNA Analysis
12:25
Conclusion
