转化生长因子-β信号诱导的内皮-间充质转化的分子分析

该方法有助于解答血管生物学和癌症生物学领域中的关键问题，例如在包括癌症在内的各种病理条件下内皮细胞可塑性的机制。该技术的主要优势在于，通过使用TGF处理MS-1内皮细胞，可在体外有效诱导内皮-间质转化（EndMT）。首先，在标准培养条件下培养MS-1细胞，并避免细胞培养达到汇合状态。

接下来，在10 cm培养皿中，用1×磷酸盐缓冲液清洗MS-1细胞。然后向培养皿中加入1 mL胰蛋白酶，并在37°C下孵育5分钟。随后向消化后的细胞中加入9 mL培养基以使细胞脱落。

然后将胰蛋白酶消化后的细胞悬液收集至15 mL离心管中。在室温下以300至400 × g离心5分钟。接着，使用自动细胞计数仪对活细胞数量进行计数。

然后将MS-1细胞接种于未包被的标准培养板中进行长期培养。24小时后，用终浓度为每毫升1纳克的TGF-β2刺激内皮细胞。随后将培养板置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育。

处理48小时后，将培养基更换为含有TGF-β2的预热新鲜培养基。为进行后续分析，将MS-1细胞接种于预先用明胶包被的8孔细胞培养腔载玻片上。24小时后，向细胞培养物中加入10 µM的ROCK抑制剂。1小时后，用终浓度为1 ng/mL的TGF-β2刺激内皮细胞。

然后将细胞在37摄氏度下孵育。对于持续72小时的培养，在48小时后用含有TGF-2的新鲜培养基替换旧培养基。TGF处理一整天后，移除培养基。

然后在室温下用4%多聚甲醛和磷酸盐缓冲液固定细胞20分钟。固定结束后，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞。随后在室温下用0.2%Triton X-100孵育细胞5分钟。

五分钟后，再次用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次。三次洗涤后，在室温下用含阻断缓冲液的稀释荧光鬼笔环肽孵育细胞一小时。孵育结束后，用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次。

然后在室温下用氰基核酸结合染料对细胞核染色五分钟。五分钟后，冲洗玻片，并使用玻片封片介质在玻片上加盖盖玻片。在共聚焦显微镜下观察细胞。

经 TGF-2 处理后，细胞显示出粗大的应力纤维发生重组。这表明 TGF-2 具有诱导内皮细胞发生内皮-间质转化（EndMT）的能力。TGF-2 处理 72 小时后，弃去培养基，并用 0.5 至 1 ml 的 50% 冷甲醇和 50% 丙酮固定细胞 5 分钟。

然后用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞，共三次。完成三次洗涤后，在4摄氏度避光条件下，用封闭缓冲液将细胞与一抗共同孵育过夜。次日，再次用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞，共三次。

然后在避光条件下，用含绿色染料标记的VE-钙黏蛋白二抗工作液在封闭缓冲液中孵育细胞1小时。再次用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次。随后在室温下用氰基核酸结合染料对细胞核染色5分钟。

五分钟后，冲洗载玻片，并使用封片剂将盖玻片封固在载玻片上。随后在共聚焦显微镜下观察细胞。经 TGF-β2 处理 48 至 72 小时后，细胞显示出 VE-钙黏蛋白表达减少，平滑肌肌动蛋白表达增加。

在进行胶原凝胶收缩实验之前，将MS-1细胞在有或无TGF-2的条件下培养72小时。然后在冰上制备I型胶原凝胶。随后，将800 µL胶原凝胶溶液与200 µL对照组或经TGF-2处理的内皮细胞混合。

接下来，将1 mL该混合物加入12孔细胞培养板的每个孔中。在37摄氏度下静置30至60分钟，使凝胶凝固。凝胶完全凝固后，加入1 mL含10%胎牛血清、50单位/毫升青霉素和50 µg/毫升链霉素的MEM Alpha培养基，使凝胶漂浮。

然后将凝胶从孔壁上分离，将游离的凝胶在37摄氏度下孵育48小时。孵育48小时后，使用扫描仪从培养板底部扫描凝胶的图像。可见明显的形态学变化，由于暴露于TGF-2处理72小时，细胞从铺路石样形态转变为间充质纺锤形结构。

有趣的是，用 TGF-β2 处理 48 至 72 小时后，MS-1 细胞中平滑肌肌动蛋白的 mRNA 和蛋白表达水平均有所升高。胶原凝胶收缩实验也显示，在 TGF-β2 处理后，I 型胶原凝胶显著收缩。有趣的是，去除 TGF-β2 后，平滑肌肌动蛋白水平降至基础水平，细胞恢复铺路石样形态，表明内皮-间质转化（EndMT）是一个动态过程。

事实上，使用LNA microRNA抑制剂在MS-1细胞中抑制microRNA 31，可减弱间充质标志物的诱导表达。然而，该抑制剂并不影响TGF-靶基因（如Fibronectin 1、PAI-1和Smad 7）的诱导表达。通过采用该方法进行基因表达分析、基因敲低或微阵列调控等后续实验，可进一步探究特定基因和microRNA在内皮-间充质转化（EndMT）中的功能。