Name: 转化生长因子β信号诱导内皮-间质转移的分子分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学习利用TGF-β2诱导MS-1小鼠胰腺微血管内皮细胞发生内皮-间质转移的体外方法，分析形态学及分子标志物变化。该方案为研究血管生物学和疾病中的EndMT机制提供了可靠平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢Zea Borok和Kohei Miyazono在手稿准备过程中提出的建议。H.I.S.和M.H.获得上原纪念基金会研究奖学金的支持，H.I.S.还获得林修一海外留学奖学金的支持。本研究工作获得了武田科学基金会资助（A.S.）。

1. 内皮间质转化的诱导
<ol>
	<li>在标准培养条件下培养MS-1细胞，避免细胞汇合。MS-1细胞的来源见于 材料表对于MS-1细胞，使用含10%胎牛血清（FCS）、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素的α最低必需培养基（MEM-α）。</li>
	<li>用1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗10 cm培养皿中的MS-1细胞，加入1.0 mL胰蛋白酶。于37 °C孵育5分钟。</li>
	<li>使用 9 mL 培养基消化细胞，将细胞悬液收集至 15 mL 离心管中。</li>
	<li>将细胞悬液在300–400 x g 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于预热的培养基中。</li>
	<li>使用台盼蓝溶液和标准血细胞计数板或自动细胞计数仪计数活细胞。</li>
	<li>将MS-1细胞接种于未包被的标准培养板中，密度为0.5 × 10⁶ cells/mL3 每平方厘米细胞数2 用于长期培养。例如，接种 5.0 x 103 每孔接种细胞于6孔培养板中。使用相同的培养基，包括相同浓度的胎牛血清（FCS）。在MS-1细胞中，TGF-β在含FCS的长期培养（至少48–72小时）中可诱导内皮-间质转化（EndMT）。</li>
	<li>24小时后，用TGF-β2（终浓度为1 ng/mL）刺激内皮细胞。</li>
	<li>在加湿培养箱（5% CO₂）中培养细胞2，37 °C）。若需观察形态学变化，应每日监测细胞。</li>
	<li>在长期培养中，经 TGF-β 处理 48 小时后，更换为含 TGF-β2 的新鲜预热培养基。</li>
	<li>进行下游分析。通常在给予处理24小时后可观察到肌动蛋白的重组，而在使用TGF-β处理48–72小时后可观察到内皮标志物的下调和间充质标志物的上调。</li>
</ol>
2. 免疫细胞化学分析
<ol>
	<li>在标准培养条件下维持 MS-1 细胞。</li>
	<li>将 MS-1 细胞以每孔 1.0 × 103 个细胞（1.7 cm2）的密度接种至 4 孔细胞培养板中。载玻片预先用明胶包被。每孔加入 0.5–1.0 mL 培养基。</li>
	<li>24 小时后，用 TGF-β2（终浓度为 1 ng/mL）刺激内皮细胞。若需分析 ROCK 在内皮-间质转化（EndMT）中的作用，则在 TGF-β 处理前 1 小时加入 ROCK 抑制剂 Y-27632（10 μM）。若需评估 TGF-β 信号通路抑制的影响，可使用 TGF-β 受体激酶抑制剂。</li>
	<li>将细胞置于加湿培养箱中培养（5% CO2，37 °C）。TGF-β 处理 24 小时后可在 MS-1 细胞中观察到肌动蛋白的重排。其他变化在处理 48–72 小时后变得明显。对于 72 小时的培养，在 TGF-β 处理 48 小时后更换为含 TGF-β 的新鲜培养基。</li>
	<li>F-肌动蛋白染色
	<ol>
		<li>TGF-β 处理 24 小时后，吸除培养基，用含 4% 多聚甲醛的 1× PBS 在室温下固定细胞 20 分钟，然后用 1× PBS 洗涤细胞。</li>
		<li>在室温下用 0.2% Triton X-100 孵育 5 分钟。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤细胞三次。</li>
		<li>将来自毒伞属（Amanita phalloides）的异硫氰酸四甲基罗丹明标记鬼笔环肽（phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate）按 150 倍稀释于封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤细胞三次。</li>
		<li>在室温下用花青类核酸结合染料对细胞核染色 5 分钟。</li>
		<li>洗涤载玻片，并用封片剂将盖玻片面向下封固于载玻片上。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜观察。检测鬼笔环肽荧光时使用 543 nm 激光和 560–615 nm 发射滤光片；检测细胞核染色时使用 633 nm 激光和波长超过 650 nm 的发射滤光片。经 TGF-β 处理后，可观察到粗大的应力纤维形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>VE-钙黏蛋白和 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色
	<ol>
		<li>TGF-β 处理 72 小时后，吸除培养基，用冰冷的 50% 甲醇和 50% 丙酮（每孔 0.5–1.0 mL）在 4 °C 下固定细胞 5 分钟。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤细胞三次（每孔 0.5–1.0 mL）。</li>
		<li>根据生产商推荐浓度，将一抗溶于封闭缓冲液中，在 4 °C 避光条件下孵育过夜。使用 VE-钙黏蛋白单克隆抗体（BV13，1:100 稀释）和 Cy3 标记的 α-SMA 单克隆抗体（1A4，1:200 稀释）20。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤细胞三次。</li>
		<li>根据生产商推荐浓度，将绿色荧光标记的二抗溶于封闭缓冲液中，在室温避光条件下孵育 1 小时，用于检测 VE-钙黏蛋白抗体。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤细胞三次。</li>
		<li>在室温下用花青类核酸结合染料对细胞核染色 5 分钟。</li>
		<li>洗涤载玻片，并用封片剂将盖玻片面向下封固于载玻片上。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜观察。检测 α-SMA（Cy3）时使用 543 nm 激光和 560–615 nm 发射滤光片；检测 VE-钙黏蛋白时使用 488 nm 激光和 505–550 nm 发射滤光片。通常在 TGF-β 处理后，可观察到 VE-钙黏蛋白信号减少，而 α-SMA 信号增强。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 三维胶原凝胶收缩实验
<ol>
	<li>在进行胶原凝胶收缩实验前72小时，对MS-1细胞进行培养，分为添加和不添加TGF-β的两组。</li>
	<li>在冰上制备I型胶原凝胶。按8:1:1的比例混合冷的胶原溶液、10倍浓缩的MEM培养基以及含有0.05 N NaOH、2.2% NaHCO3和200 mM HEPES（pH 7.4）的胶原稀释缓冲液。</li>
	<li>将200 μL对照组或经TGF-β处理的内皮细胞悬液（1.0 × 106 细胞/200 μL）与800 μL胶原凝胶溶液混合。对于TGF-β处理组，在细胞悬液中加入TGF-β2（1 ng/mL）。</li>
	<li>将1.0 mL上述混合液加入12孔板的每个孔中，置于37 °C培养箱中孵育30–60分钟，使其凝固。</li>
	<li>凝胶化完成后，在凝胶表面覆盖1.0 mL含10% FCS、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素的MEM-α培养基，使凝胶漂浮。对于TGF-β处理组，需在培养基中加入TGF-β2（1 ng/mL）。 
	注意：对于TGF-β处理组，需在凝胶和培养基中均加入TGF-β。</li>
	<li>将漂浮的凝胶在37 °C下继续孵育48小时。</li>
	<li>使用扫描仪从培养板底部扫描凝胶图像。或者，使用数码相机在固定高度对凝胶进行拍照记录。</li>
	<li>利用ImageJ软件根据像素数量定量分析凝胶表面积。可使用手绘选区或其他选区工具选择凝胶区域，或使用&#34;图像 | 调整 | 颜色阈值&#34;工具选择凝胶，然后通过&#34;分析 | 测量&#34;命令确定凝胶面积。</li>
</ol>
4. 利用基于锁核酸的miRNA抑制剂抑制miRNA活性
<ol>
	<li>在标准培养条件下维持 MS-1 细胞。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用脂质转染试剂转染锁定核酸（LNA）miRNA 抑制剂、合成 miRNA 双链体或 siRNA（20 或 50 nM）。LNA miRNA 抑制剂、合成 miRNA 双链体和 siRNA 的详细信息及来源见我们之前的研究报告26,27。在 MS-1 细胞中，基于制造商说明书的标准转染程序可有效导入 LNA miRNA 抑制剂、合成 miRNA 双链体或 siRNA。</li>
	<li>转染后 16–48 小时，用 TGF-β2（终浓度为 1 ng/mL）刺激内皮细胞。</li>
	<li>进行多种下游分析，包括 RNA 表达分析（定量 RT-PCR 和 RNA 测序（RNA-seq）分析）、免疫细胞化学分析和报告基因检测。下游分析方法已在我们之前的研究报告中描述20,26,27。</li>
</ol>

<ol><li>Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases%3A+Developmental+signaling+pathways+gone+awry%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry.</a> Developmental Dynamics. , (2017).</li>
<li>Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0012160675903218">Structural analysis of endocardial cytodifferentiation.</a> Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).</li>
<li>Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+atrioventricular+valvuloseptal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis.</a> Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+are+progenitors+of+cardiac+pericytes+and+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells.</a> Nature Communications. 7, 12422(2016).</li>
<li>DeRuiter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+endothelial+cells+transdifferentiate+into+mesenchymal+cells+expressing+smooth+muscle+actins+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro.</a> Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).</li>
<li>Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+occurs+during+embryonic+pulmonary+artery+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endothelium%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development.</a> Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).</li>
<li>Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+partial+endothelial-mesenchymal+transitions+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).</li>
<li>Zeisberg, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+contributes+to+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis.</a> Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+drives+atherosclerosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).</li>
<li>Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+in+atherosclerotic+lesion+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification.</a> Atherosclerosis. , 124-127 (2016).</li>
<li>Qiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+fate+mapping+in+mice+with+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension.</a> Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).</li>
<li>Ranchoux, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25593290">Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension.</a> Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).</li>
<li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li>
<li>Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+fibroblasts+and+mechanism+of+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis.</a> Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).</li>
<li>Cooley, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+mediates+endothelial-to-mesenchymal+transition+%28EndMT%29+during+vein+graft+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling.</a> Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234(2014).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+Growth+Factor-beta1+Induces+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition+via+Akt+Signaling+Pathway+in+Renal+Transplant+Recipients+with+Chronic+Allograft+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction.</a> Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).</li>
<li>Xu-Dubois, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%3A+Evidence+for+Antibody-Endothelium+Interaction+during+Antibody-Mediated+Rejection+in+Kidney+Recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+endothelial+to+mesenchymal+transition+as+a+source+for+carcinoma-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts.</a> Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).</li>
<li>Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-Induced+Endothelial-Mesenchymal+Transition+in+Fibrotic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).</li>
<li>Mihira, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+mesenchymal+transition+of+MS-1+endothelial+cells+requires+Smad-dependent+cooperative+activation+of+Rho+signals+and+MRTF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A.</a> Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).</li>
<li>Hashimoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).</li>
<li>Suzuki, H. I., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+microRNA+biogenesis%3A+crosstalk+between+p53+network+and+microRNA+processing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway.</a> Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).</li>
<li>Suzuki, H. I., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+complexity+of+microRNA+generation+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Emerging complexity of microRNA generation cascades.</a> Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).</li>
<li>Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19262572">MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).</li>
<li>Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-23+restricts+cardiac+valve+formation+by+inhibiting+Has2+and+extracellular+hyaluronic+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production.</a> Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).</li>
<li>Katsura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-31+is+a+positive+modulator+of+endothelial-mesenchymal+transition+and+associated+secretory+phenotype+induced+by+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta.</a> Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).</li>
<li>Suzuki, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TGF-beta-mediated+endothelial-mesenchymal+transition+by+microRNA-27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27.</a> Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).</li>
<li>Camenisch, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+distinct+TGFbeta+ligand+requirements+during+mouse+and+avian+endocardial+cushion+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis.</a> Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).</li>
<li>Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cells+for+use+in+vascular+tissue+engineering+obtained+by+endothelial-to-mesenchymal+transdifferentiation+%28EnMT%29+on+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices.</a> Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).</li>
<li>Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta2+promotes+Snail-mediated+endothelial-mesenchymal+transition+through+convergence+of+Smad-dependent+and+Smad-independent+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling.</a> Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).</li>
<li>Krizbai, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+of+brain+endothelial+cells%3A+possible+role+during+metastatic+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation.</a> PLoS One. 10 (3), e0119655(2015).</li>
<li>Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+1+promotes+the+differentiation+of+endothelial+cells+into+smooth+muscle-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro.</a> Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).</li>
<li>Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+induces+transdifferentiation+of+iBREC+to+alphaSMA-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).</li>
<li>Paranya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li>
<li>Maleszewska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+and+TGFbeta2+synergistically+induce+endothelial+to+mesenchymal+transition+in+an+NFkappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner.</a> Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-endothelial+transition+contributes+to+cardiac+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization.</a> Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+balance+of+aberrant+Rasal1+promoter+methylation+and+hydroxymethylation+regulates+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis.</a> Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Endothelial+Cells+with+Distinct+Patterns+of+TGFbeta-Driven+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

已有报道称，活化的Ras联合TGF-β处理24小时可诱导MS-1细胞发生内皮-间充质转化（EndMT），而单独使用TGF-β在这一较短时间内则无法诱导EndMT21。与此一致，我们观察到在MS-1细胞中，经较长时间（48–72小时）TGF-β处理后可显著诱导EndMT20。在多种内皮细胞中，包括人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人皮肤微血管内皮细胞（HCMEC）、人冠状动脉内皮细胞（HCEC）、小鼠肺内皮细胞（MLEC）、大鼠脑内皮细胞（BEC）、牛主动脉内皮细胞（BAEC）、永生化牛视网膜微血管内皮细胞（iBREC）以及绵羊主动脉瓣内皮细胞，长期（2–6天）TGF-β处理后也反复观察到EndMT的发生8,18,29,30,31</s...

内皮-间充质转化（EndMT）是指已分化的内皮细胞经历一系列分子变化，最终转变为成纤维细胞样的间充质细胞1。EndMT最初被描述为心脏发育过程中内皮细胞的一种转化现象2,3。在心脏早期发育阶段，心脏管由内层的心内膜和外层的心肌层组成，两者之间由一层称为心胶质的细胞外基质分隔。胚胎期的心内膜细胞获得内皮细胞标志物后，会转化为间充质细胞，侵入下方的心胶质，并促进心垫的形成，为房室瓣、室间隔以及半月瓣的发育奠定基础。此外，研究表明EndMT还可能是其他胚胎血管系统（包括冠状血管、腹主动脉和肺动脉）中周细胞和血管平滑肌细胞的来源之一4,5,6。同时，EndMT也参与生理性血管生成出芽过程7。
越来越多的证据表明，内皮-间质转化（EndMT）也参与多种心血管疾病及其他疾病的发生发展1,8。与EndMT相关的疾病包括血管钙化、动脉粥样硬化、肺动脉高压、海绵状血管畸形、器官纤维化、静脉移植后重塑、肾移植中的同种移植物功能障碍以及癌症8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。最近一项研究报告指出，若干分子水平的EndMT标志物可作为肾移植中移植物功能障碍诊断和预后预测的工具17。调控与EndMT相关的细胞信号通路已被证明可在动物模型中改善包括心肌纤维化和静脉移植后重塑在内的多种疾病状态8,15。因此，深入理解EndMT的分子机制对于开发靶向EndMT的诊断和治疗策略具有重要意义。
内皮-间质转化（EndMT）的特征是细胞间连接的丧失、迁移潜能的增加、内皮特异性基因（如VE-钙黏蛋白）的表达下调，以及间充质基因（包括α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA））的表达上调。此外，EndMT与上皮-间质转化（EMT）——一种将上皮细胞转化为间充质细胞的类似过程——均与多种细胞外基质成分的产生异常相关，这可能促进组织纤维化的发生8,19。
最近，一些 体外 内皮-间质转化（EndMT）的研究已阐明了EndMT的分子机制细节15,20内皮-间质转化（EndMT）可由多种信号通路诱导，包括转化生长因子（TGF）-β、Wnt 和 Notch 通路。1其中，TGF-β 在诱导 EMT 和 EndMT 过程中均发挥关键作用。在 EndMT 中，内皮细胞长期暴露于 TGF-β 会引发 EndMT，而短期暴露则似乎不足以诱导该过程。21我们在此描述了一种诱导内皮-间充质转化（EndMT）的简便方案，其中MILE SVEN 1（MS-1）小鼠胰腺微血管内皮细胞发生EndMT 体外 长期暴露于 TGF-β 后20在此模型中，可进行多种下游分析，以研究内皮-间质转化（EndMT）的标志性特征，包括形态学变化、内皮细胞标志物的下调、间质细胞标志物和炎症基因的上调、细胞骨架重排以及胶原凝胶收缩。
microRNA（miRNA）是一类长约22个核苷酸的小分子调控RNA，可介导多种mRNA靶标的转录后抑制22,23。通过种子序列介导的靶标识别，miRNA能够抑制数百个靶基因，调控细胞分化、增殖和运动性等多种细胞功能。在内皮-间质转化（EndMT）和上皮-间质转化（EMT）的调控中亦是如此，已有多个miRNA被报道为EMT和EndMT的调控因子24,25。本文综述中所介绍的EndMT模型可方便地与miRNA调控方法相结合，用于检测miRNA在EndMT过程中的作用。本综述总结了我们在MS-1细胞中研究TGF-β诱导EndMT的实验流程，并比较了TGF-β在其他内皮细胞中诱导EndMT的条件。

<table><tbody><tr><td>MS-1 细胞</td><td>美国模式培养物集存库</td><td>CRL-2279</td><td></td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>32571036</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta2</td><td>R&amp;D</td><td>302-B2-002</td><td></td></tr><tr><td>4 孔 Lab-Tek II 培养皿载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632&amp;nbsp;</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>封闭剂 One</td><td>那卡莱泰斯克</td><td>03953-95</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽-四甲基罗丹明异硫氰酸盐</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3 碘化物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>VE 钙黏蛋白单克隆抗体 (BV13)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14-1441-82</td><td></td></tr><tr><td>α-平滑肌肌动蛋白 Cy3 单克隆抗体 (1A4)</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>174934</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白溶液</td><td>新田明胶株式会社</td><td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白稀释缓冲液</td><td>新田明胶株式会社</td><td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>LNA miRNA 抑制剂</td><td>EXIQON&amp;nbsp;</td><td>miRCURY LNA microRNA Power Inhibitor（阴性对照 B 和靶向 miRNA）</td><td></td></tr><tr><td>合成 miRNA 双链体</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>miScript miRNA Mimic</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13778030</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11668027</td><td></td></tr></tbody></table>

转化生长因子-β信号诱导的内皮-间充质转化的分子分析

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

内皮细胞的表型可塑性是心血管系统发育、心血管疾病以及多种器官纤维化相关疾病的基础。在这些病理状态下，已分化的内皮细胞获得类似间充质细胞的表型，这一过程称为内皮-间充质转化（EndMT），其特征是内皮标志物表达下调、间充质标志物表达上调以及细胞形态学改变。EndMT 可由多种信号通路诱导，包括转化生长因子（TGF）-β、Wnt 和 Notch 通路，其分子调控机制与上皮-间充质转化（EMT）相似，而 EMT 在原肠胚形成、组织纤维化和癌症转移中具有重要作用。深入理解 EndMT 的分子机制，对于开发靶向 EndMT 的诊断和治疗策略至关重要。体外高效诱导 EndMT 有助于鉴定共有的基因表达特征、发现可药物靶向的分子机制，并筛选 EndMT 的调控因子。本文介绍了一种体外诱导 EndMT 的实验方法：小鼠胰腺微血管内皮细胞系 MS-1 在长期暴露于 TGF-β 后发生 EndMT，表现为间充质标志物表达上调、形态学改变，以及多种炎症趋化因子和细胞因子的诱导表达。文中还包含了微小 RNA（miRNA）调控分析的相关方法。这些方法为研究 EndMT 的分子机制以及 miRNA 在 EndMT 中的作用提供了有效平台。

TGF-β 是多种内皮细胞发生内皮-间质转化（EndMT）的强效诱导因子。在 MS-1 细胞中经 TGF-β 处理 24 小时后，F-actin 染色显示肌动蛋白应力纤维发生重排（图 1A）20。预先使用 ROCK 抑制剂 Y-27632 处理可抑制肌动蛋白重排的诱导20。MS-1 内皮细胞经 TGF-β 处理后，由典型的鹅卵石样形态转变为间充质样纺锤形形态（图 1B），并失去细胞间接触。经 TGF-β 处理 48–72 小时后，免疫细胞化学分析显示 VE-钙黏蛋白表达减少，而 α-SMA 表达增加（图 1C）。TGF-β 在处理 48–72 小时后，显著诱导 MS-1 细胞中 α-SMA 在 mRNA 和蛋白水平的表达（图 1D 和 1E</stro...

体外诱导内皮-间充质转化（EndMT）的实验方案，可用于研究参与EndMT的细胞信号通路。在此实验模型中，通过TGF-β处理MS-1内皮细胞以诱导EndMT。

内皮细胞的表型可塑性是心血管系统发育、心血管疾病及多种相关疾病的生物学基础……

该方法有助于解答血管生物学和癌症生物学领域中的关键问题，例如在包括癌症在内的各种病理条件下内皮细胞可塑性的机制。该技术的主要优势在于，通过使用TGF处理MS-1内皮细胞，可在体外有效诱导内皮-间质转化（EndMT）。首先，在标准培养条件下培养MS-1细胞，并避免细胞培养达到汇合状态。接下来，在10 cm培养皿中，用1×磷酸盐缓冲液清洗MS-1细胞。然后向培养皿中加入1 mL胰蛋白酶，并在37°C下孵育5分钟。随后向消化后的细胞中加入9 mL培养基以使细胞脱落。然后将胰蛋白酶消化后的细胞悬液收集至15 mL离心管中。在室温下以300至400 × g离心5分钟。接着，使用自动细胞计数仪对活细胞数量进行计数。然后将MS-1细胞接种于未包被的标准培养板中进行长期培养。24小时后，用终浓度为每毫升1纳克的TGF-β2刺激内皮细胞。随后将培养板置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育。处理48小时后，将培养基更换为含有TGF-β2的预热新鲜培养基。为进行后续分析，将MS-1细胞接种于预先用明胶包被的8孔细胞培养腔载玻片上。24小时后，向细胞培养物中加入10 µM的ROCK抑制剂。1小时后，用终浓度为1 ng/mL的TGF-β2刺激内皮细胞。然后将细胞在37摄氏度下孵育。对于持续72小时的培养，在48小时后用含有TGF-2的新鲜培养基替换旧培养基。TGF处理一整天后，移除培养基。然后在室温下用4%多聚甲醛和磷酸盐缓冲液固定细胞20分钟。固定结束后，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞。随后在室温下用0.2%Triton X-100孵育细胞5分钟。五分钟后，再次用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次。三次洗涤后，在室温下用含阻断缓冲液的稀释荧光鬼笔环肽孵育细胞一小时。孵育结束后，用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次。然后在室温下用氰基核酸结合染料对细胞核染色五分钟。五分钟后，冲洗玻片，并使用玻片封片介质在玻片上加盖盖玻片。在共聚焦显微镜下观察细胞。经 TGF-2 处理后，细胞显示出粗大的应力纤维发生重组。这表明 TGF-2 具有诱导内皮细胞发生内皮-间质转化（EndMT）的能力。TGF-2 处理 72 小时后，弃去培养基，并用 0.5 至 1 ml 的 50% 冷甲醇和 50% 丙酮固定细胞 5 分钟。然后用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞，共三次。完成三次洗涤后，在4摄氏度避光条件下，用封闭缓冲液将细胞与一抗共同孵育过夜。次日，再次用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞，共三次。然后在避光条件下，用含绿色染料标记的VE-钙黏蛋白二抗工作液在封闭缓冲液中孵育细胞1小时。再次用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次。随后在室温下用氰基核酸结合染料对细胞核染色5分钟。五分钟后，冲洗载玻片，并使用封片剂将盖玻片封固在载玻片上。随后在共聚焦显微镜下观察细胞。经 TGF-β2 处理 48 至 72 小时后，细胞显示出 VE-钙黏蛋白表达减少，平滑肌肌动蛋白表达增加。在进行胶原凝胶收缩实验之前，将MS-1细胞在有或无TGF-2的条件下培养72小时。然后在冰上制备I型胶原凝胶。随后，将800 µL胶原凝胶溶液与200 µL对照组或经TGF-2处理的内皮细胞混合。接下来，将1 mL该混合物加入12孔细胞培养板的每个孔中。在37摄氏度下静置30至60分钟，使凝胶凝固。凝胶完全凝固后，加入1 mL含10%胎牛血清、50单位/毫升青霉素和50 µg/毫升链霉素的MEM Alpha培养基，使凝胶漂浮。然后将凝胶从孔壁上分离，将游离的凝胶在37摄氏度下孵育48小时。孵育48小时后，使用扫描仪从培养板底部扫描凝胶的图像。可见明显的形态学变化，由于暴露于TGF-2处理72小时，细胞从铺路石样形态转变为间充质纺锤形结构。有趣的是，用 TGF-β2 处理 48 至 72 小时后，MS-1 细胞中平滑肌肌动蛋白的 mRNA 和蛋白表达水平均有所升高。胶原凝胶收缩实验也显示，在 TGF-β2 处理后，I 型胶原凝胶显著收缩。有趣的是，去除 TGF-β2 后，平滑肌肌动蛋白水平降至基础水平，细胞恢复铺路石样形态，表明内皮-间质转化（EndMT）是一个动态过程。事实上，使用LNA microRNA抑制剂在MS-1细胞中抑制microRNA 31，可减弱间充质标志物的诱导表达。然而，该抑制剂并不影响TGF-靶基因（如Fibronectin 1、PAI-1和Smad 7）的诱导表达。通过采用该方法进行基因表达分析、基因敲低或微阵列调控等后续实验，可进一步探究特定基因和microRNA在内皮-间充质转化（EndMT）中的功能。

molecular-analysis-endothelial-mesenchymal-transition-induced

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

转化生长因子β信号诱导内皮-间质转移的分子分析

本文描述了一种在多种细胞类型中诱导上皮细胞向间充质细胞转化（EMT）的简便方法，并包含了通过免疫细胞化学分析处于EMT状态细胞的方法。...

上皮间质转化的诱导与分析

已证明可变剪接调控参与上皮-间质转化（EMT），EMT 是多种生理和病理过程中的重要细胞程序。本文介绍了一种利用可诱导 EMT 模型检测 EMT...

上皮-间质转化过程中可变剪接的检测

本文介绍了凝胶收缩实验的建立及其应用，用于评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞的收缩功能。...

一种的开发 体外 评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞收缩功能的实验方法

本论文描述了一种管形成实验，通过在受控环境中利用内皮细胞的管形成能力，来定量评估特定化合物或条件对血管生成的影响。...

内皮细胞管形成实验的优化策略：比较细胞外基质与生长因子减除型细胞外基质

本文介绍一种基于过表达miR-200家族成员与grainyhead样2（GRHL2）来诱导肉瘤细胞发生间充质-上皮转化（MET）的细胞培养方法。该方法适用于深入理解表型可塑性对癌症侵袭性及治疗反应的生物学影响。...

肉瘤细胞中诱导间充质-上皮转化

我们介绍一种使用硅橡胶（PDMS）制备的高通量牵引力检测方法。该新型检测方法适用于研究细胞收缩力在多种生物学、生物医学过程及疾病中的物理变化。我们通过检测上皮-间质转化过程中TGF-β依赖性的收缩力增强，展示了该方法的应用价值。...

使用PDMS的高通量牵引力显微技术揭示转化生长因子-β对上皮-间质转化的剂量依赖性效应

miRNA 治疗在调控癌症进展方面具有重要意义。本文展示了用于鉴定联合 miRNA...

联合miRNA治疗调控细胞周期与血管生成的分析

我们描述了一种系统性工作流程，通过研究TGF-β信号通路中涉及的蛋白和基因表达，来探究TGF-β信号传导及TGF-β诱导的上皮-间质转化（EMT）。该方法包括蛋白质印迹（Western...

研究乳腺癌及正常细胞中TGF-β信号通路与TGF-β诱导的上皮-间质转化

我们描述了通过观察细胞形态变化以及利用免疫荧光染色检测内皮-间质转化（EndMT）相关标志物表达变化，来研究TGF-β2诱导内皮细胞发生EndMT的方法。同时介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术，并用于敲除编码Snail的基因，以探究其在TGF-β2诱导EndMT过程中的作用。...

TGF-β介导的内皮细胞向间充质细胞转化（EndMT）及利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对EndMT效应分子的功能评估

本文建立了一种实验方案，用于在暴露于病理性和生理性流体剪切应力条件下的内皮细胞中，通过邻位连接实验（proximity ligation assay,...

利用邻近连接技术在不同流体剪切应力条件下可视化与定量TGFβ/BMP/SMAD信号通路

本方案可实现对经典方法中形成的管状结构的回收 体外...

从血管生成-管腔形成实验中回收滋养层细胞用于分化标志物表达分析

学习利用TGF-β2诱导MS-1小鼠胰腺微血管内皮细胞发生内皮-间质转移的体外方法，分析形态学及分子标志物变化。该方案为研究血管生物学和疾病中的EndMT机制提供了可靠平台。

转化生长因子-β信号诱导的内皮-间充质转化的分子分析

探索更多视频