电化学检测氘动力学同位素对希瓦氏菌 oneidensis MR-1 细胞外电子传输的影响

该方案的总体目标是通过检测氘动力学同位素效应来观察质子传输对细菌细胞外电子传输速率的贡献。我们的方法揭示了质子转运对通过外膜 c 型细胞色素从细菌到电极的细胞外电子传递或 EET 动力学的影响。我们的检测反映了 EET 中的天然质子管理，因为我们使用的是活细菌而不是纯化的酶。

然而，我们面临的挑战是去除其他细胞过程中的噪音。称为 KIE 的氘动力学同位素效应是检查质子传输对相关电子传输过程的贡献的最佳技术之一。为了培养希瓦氏菌 MR-1 细胞，将在琼脂平板上生长的一个细胞集落转移到 15 毫升 LB 培养基中。

在有氧条件下，在 30 摄氏度下以 160 rpm 振荡培养细胞 24 小时。将细胞悬液以 6， 000 倍重力离心 10 分钟。然后，将所得细胞沉淀重悬于 15 毫升成分确定的培养基中，补充有 10 毫摩尔乳酸作为碳源，每升酵母提取物 0.5 克作为细胞的微量元素。

30 摄氏度下以 160 rpm 的速度振荡，用 6， 000 倍重力再次离心细胞悬液 10 小时后。在电化学实验之前，用 DM 培养基在 6， 000 倍重力下离心 10 分钟，洗涤所得细胞沉淀两次。要构建三电极电化学反应器，请在反应器底部放置 ITO 衬底作为工作电极。

随后，插入玻璃圆筒和聚四氟乙烯盖，并插入铂丝作为对电极。然后，将氯化银电极插入反应器中作为参比电极。接下来，将 4 毫升补充有 10 毫摩尔乳酸和 0.5 克/升酵母提取物的 DM 加入电化学反应器中。

确认电化学反应器无泄漏后，将氮气流入电化学反应器超过 20 分钟，以保持电化学反应器内的厌氧条件。将电化学反应器连接到电化学工作站，并向 ITO 电极施加 0.4 伏的正电压，使用外部水循环系统将电化学反应器的温度保持在 30 摄氏度。为了进行电化学培养，首先将悬浮液的细胞密度调节至 600 纳米处的光密度为 1.43，其中 DM 补充有 10 毫摩尔乳酸和 0.5 克/升酵母提取物。

使用注射器通过进样口将 0.3 毫升细胞悬液添加到电化学反应器中。反应器中的 OD 600 变为 0.1。以 0.4 伏的正电压继续对 ITO 电极进行电位应用，持续 25 小时。

停止电位应用并断开电化学反应器与电化学工作站和水循环系统的连接。在 20 分钟内将氮气流入含有 10 毫摩尔乳酸的 DM 的瓶子中，以去除培养基中的氧气。现在，在流动的氮气下，使用注射器极其缓慢和轻柔地从电化学反应器内去除所有上清液。

然后，使用注射器加入 4 毫升含有 10 毫摩尔乳酸的新鲜 DM。倾斜电化学反应器以去除反应器壁上的所有上清液。总共重复这些步骤三次。

停止气流并再次将电化学反应器连接到电化学工作站，在 303 开尔文的 ITO 电极上施加 0.4 伏的正电压。确认希瓦氏菌 MR-1 的单层生物膜的当前产量是稳定的，并且不会迅速增加。如果电流急剧增加，请等待电流稳定下来，在 10 分钟内增加 5%。

使用注射器极其缓慢和温和地将 40 微升缺氧 50 体积百分比的 D2O 添加到电化学反应器中，使反应器中的浓度为 0.5 体积百分比 D2O。为防止 D20 添加对生物膜造成损害，请滴加 D2O。等待电流稳定，然后将 D2O 添加至 4.4 体积百分比以获得 KIE 值，即电流产生与 D2O 和 H2O 存在的比率。

检查相同体积的 H 2 O 添加对当前生产的影响。在这里，实线是 D2O 添加引起的微生物电流变化的代表性结果。添加 D2O 在 10 秒内显著降低了微生物电流，而 H20 几乎没有电流降低，如虚线所示。

为了确认观察到的 D2O 电流降低归因于电子通过外膜细胞色素的传递，使用了扩散电子介质。在这里，添加 100 微摩尔 α-AQS 将当前产量提高了五倍以上，并且当前产量不受 D2O 添加的影响。这些结果表明，代谢反应的动力学足够快，因此细胞外电子转移过程是限速的。

评估这一点的另一种方法是将黄素分子添加到电化学反应器中。黄素添加的瞬时阳极电流增加表明通过外膜细胞色素的电子传递过程的速率受到限制。看完这个视频后，你应该对如何检查动力学同位素对细胞外电子传递过程的影响有了很好的了解。

成功获得动力学同位素效应的最关键点是阐明和确认通过外膜细胞色素的电子传递限制电流产生速率的条件。在本视频中，我们介绍了两种确认这种情况的方法，即通过添加黄素和添加扩散额外介质（如 α-AQS）来观察电流变化。一旦确认速率限制，该系统不仅可以用于氘实验，还可以用于外膜细胞色素的生化表征。

此外，该协议可能适用于检查其他电活性微生物，只要细胞外电子传递过程是限速的。我们的方法提供了一种基本和通用的技术，用于研究体内通过外膜细胞色素的细胞外电子传递过程。