Name: 电化学检测氘动力学同位素对希瓦氏菌 oneidensis MR-1 细胞外电子传输的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 了解电化学检测氘动力学同位素效应的方法，用于研究希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1胞外电子传输中质子转运的作用机制。该技术有助于深入理解微生物电子传递过程。

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本工作获得了日本学术振兴会（JSPS）科学研究费特别推进研究（KAKENHI 项目编号 24000010、17H04969 和 JP17J02602）以及美国海军研究全球办公室（N62909-17-1-2038）的资助。Y.T. 是 JSPS 研究员，并获得 JSPS 研究生院领先项目（MERIT）的支持。

1. 在 ITO 电极上形成 S. oneidensis MR-1 的单层生物膜（图 1）
注意：为防止其他微生物污染电化学反应器，所有培养基、器具及电化学反应器的组件均应预先灭菌。使用 S. oneidensis MR-1 细胞并构建电化学反应器时，所有操作均应在超净工作台内进行。
<ol>
	<li>培养 S. oneidensis MR-1 细胞 
	注：在 ITO 电极上形成的 S. oneidensis MR-1 单层生物膜，其培养条件依据先前报道的方法4。
	<ol>
		<li>为培养 S. oneidensis MR-1 细胞，将一块含有 Luria-Bertani（LB，20 g/L）和细菌琼脂（bacto agar，15 g/L）的琼脂平板上生长的 S. oneidensis MR-1 单菌落接种至 15 mL LB 培养基（20 g/L）中，在 30 °C、有氧条件下以 160 rpm 振荡培养 24 小时。</li>
		<li>将细胞悬液在 6,000 × g 条件下离心 10 分钟，弃上清，将所得细胞沉淀重悬于 15 mL 定义培养基（DM，pH 7.8）中（DM 成分为：NaHCO3 [2.5 g/L]、CaCl2·2H2O [0.08 g/L]、NH4Cl [1.0 g/L]、MgCl2·6H2O [0.2 g/L]、NaCl [10 g/L] 和 2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸 [HEPES；7.2 g/L]），并补充 10 mM 乳酸和 0.5 g/L 酵母提取物作为碳源，以及适用于 S. oneidensis MR-1 的微量元素溶液。</li>
		<li>将上述细胞悬液在 30 °C 条件下继续有氧振荡培养 12 小时（160 rpm），然后再次在 6,000 × g 条件下离心 10 分钟。用 DM 培养基将所得细胞沉淀洗涤两次，每次在 6,000 × g 条件下离心 10 分钟，之后用于电化学实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建三电极电化学反应器（图 1）
	<ol>
		<li>将一块 ITO 基底&#160;作为工作电极置于反应器底部。</li>
		<li>随后插入一个玻璃圆筒（直径 2 cm）和一个聚四氟乙烯（PTFE）盖子。再将 Ag/AgCl（饱和 KCl）电极和铂丝分别插入反应器中作为参比电极和对电极。 
		注：为防止空气和溶液泄漏，各组件之间应夹入丁基橡胶垫片。</li>
		<li>向电化学反应器中加入 4.0 mL DM 培养基，并补充 10 mM 乳酸和 0.5 g/L 酵母提取物。</li>
		<li>确认电化学反应器无泄漏后，向其中通入氮气超过 20 分钟，以维持反应器内部的厌氧环境。 
		注：为防止其他微生物污染，通入的气体应在进入电化学反应器前经过滤处理。</li>
		<li>将电化学反应器连接至电化学工作站，并对 ITO 电极施加 +0.4 V（相对于标准氢电极，SHE）的电位，同时使用外部水循环系统将反应器温度维持在 30 °C。 
		注：为避免外部电场干扰，电化学反应器应置于法拉第笼中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>S. oneidensis MR-1 细胞的电化学培养（图 1 和 图 2）
	<ol>
		<li>用补充了 10 mM 乳酸和 0.5 g/L 酵母提取物的 DM 培养基，将步骤 1.1 所得细胞悬液的浓度调节至在 600 nm 处的光密度（OD600）为 1.43。 
		注：为准确测定 OD600，在调节至 OD600 = 1.43 前，应先将 OD600 ≤ 0.8 的细胞悬液用于紫外-可见分光光度计测定。</li>
		<li>使用注射器通过进样口向电化学反应器中加入 0.3 mL 细胞悬液：此时反应器内的 OD600 变为 0.1。 
		注：将 0.3 mL、OD600 = 1.43 的细胞悬液加入含有 4.0 mL 培养基的电化学反应器中，最终形成 4.3 mL 溶液，其 OD600 = 0.1。若使用其他体积不同的反应器，需重新计算细胞接种密度。</li>
		<li>继续对 ITO 电极施加 +0.4 V（相对于 SHE）的电位，持续 25 小时。 
		注：为形成 ITO 电极上的单层生物膜，需确保产生的电流与 图 2 所示曲线的偏差小于 50%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用含 10 mM 乳酸盐的新鲜 DM 培养基替换上清液（图 3）
<ol>
	<li>停止施加电位，并将电化学反应器从恒电位仪和水循环系统上断开。</li>
	<li>用含 10 mM 乳酸的新鲜 DM 培养基替换上清液
	<ol>
		<li>向装有含 10 mM 乳酸 DM 培养基的瓶子中通入氮气 20 分钟，以去除培养基中的氧气。</li>
		<li>在持续通入氮气的条件下，使用注射器缓慢吸除电化学反应器内的全部上清液（图 3a，b）。 
		注意：为避免氮气破坏 ITO 电极上的生物膜，应使气体仅流经液面上方。</li>
		<li>使用注射器加入 4.0 mL 含 10 mM 乳酸的新鲜 DM 培养基（图 3c）。 
		注意：为避免破坏 ITO 电极上的生物膜，应沿电化学反应器内壁缓慢注入培养基。为保持生物膜湿润，应在去除上清液后立即添加培养基。在去除上清液后 1 分钟内完成培养基的注入，不会影响 S. oneidensis MR-1 生物膜的电流产生。</li>
		<li>倾斜电化学反应器，以去除附着在器壁上的全部上清液。</li>
		<li>总共重复步骤 2.2.2–2.2.4 三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>停止通气，重新将电化学反应器连接至恒电位仪，并在 303&#160;K 下对 ITO 电极施加 +0.4 V（相对于 SHE）。</li>
</ol>
3. 添加重水以测量EET过程的动力学同位素效应（图4）
<ol>
	<li>确认单层生物膜 S. oneidensis MR-1 的当前电流输出稳定，且未迅速上升。若电流急剧增加，需等待电流在10分钟内波动不超过5%时再进行后续操作。 
	注：此前已有研究通过rDNA序列分析及ITO电极上生物膜的扫描电子显微图像，证实了在ITO电极上形成的单层生物膜未受其他微生物菌株污染4。为验证电子传递过程（EET）为速率限制步骤，可监测添加穿梭型电子介体（如100 µM 蒽醌-1-磺酸盐（α-AQS））对电流的影响。有关更多细节，请参见代表性结果部分及参考文献15。</li>
	<li>使用注射器向电化学反应器中加入40 µL无氧的50% (v/v) D2O，使反应器中D2O的终浓度为0.5% (v/v)。 
	注：为防止D2O加入对生物膜造成损伤，应逐滴加入D2O。</li>
	<li>等待电流稳定后，继续逐步添加D2O，直至其浓度达到4.0% (v/v)。 
	注：为获得动力学同位素效应（KIE）值（即在D2O与H2O存在条件下电流产量的比值），需检测加入相同体积H2O对电流产量的影响。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与蛋白质电化学相比，我们的全细胞电化学检测方法具有多项技术优势。蛋白质纯化需要多步且耗时的流程，而我们的全细胞方法仅需在细胞培养后进行一天的自组织生物膜形成。为了实现外膜 c-细胞色素（OM c-Cyts）与电极之间的稳定相互作用，我们仅需对电极表面进行灭菌和清洁，无需对电极进行修饰以调控蛋白质的取向4，例如，S. oneidensis MR-1 可天然附着于电极表面，同时将外膜 c-细胞色素以相同方向排列25,26,27。相比之下，蛋白质的电化学反应对蛋白质中氧化还原活性位点与电极之间的距离高度敏感，因此必须谨慎控制纯化后蛋白质的取向28,29。更重要的是，全细胞电化学检测可直接表征嵌入脂质膜中的外膜 c</...

近年来，随着金属还原型微生物菌株（如 S. oneidensis MR-1 或 Geobacter sulfurreducens PCA，其外膜上暴露有细胞外的c型细胞色素复合物（OM c-Cyts）1,2,3,4,5. OM c细胞色素介导电子从呼吸链向胞外固体底物的传递，该过程称为胞外电子传递（EET）。1,6 并且是微生物燃料电池等新兴生物技术的关键过程6因此，为了理解EET的动力学和机制及其与微生物生理的关联，OM c-已采用全细胞电化学方法对细胞进行研究4,7，结合显微镜技术8,9，光谱学10,11，以及分子生物学2,4相比之下，研究EET相关阳离子转运影响的方法， 例如， 质子对活细胞中电子传递链动力学的影响尚未得到充分阐明，尽管质子跨细菌膜的运输在信号传导、稳态维持和能量产生中具有关键作用12,13,14在本研究中，我们描述了一种用于检测质子传递对胞外电子传递（EET）动力学影响的技术 S. oneidensis 使用全细胞电化学测量方法研究MR-1细胞的微生物电流产生过程中的限速步骤15.
评估质子传递对相关胞外电子传递（EET）贡献的一种直接方法是氘代动力学同位素效应（KIE）。当用氘离子取代质子时，电子传递动力学会发生变化，该变化即可体现为KIE，从而反映质子传递对电子传递动力学的影响16。KIE理论本身已通过使用纯化酶的电化学测量得到充分建立17。然而，由于S. oneidensis MR-1的电流产生源于多种多样且动态变化的过程18，因此无法简单地将EET确定为限速步骤。为了观察与EET相偶联的质子传递过程中的KIE，我们需要确认微生物电流的产生受限于通过外膜c-细胞色素（OM c-Cyts）向电极的电子传递。为此，在进行KIE测量之前，我们将上清液更换为新鲜培养基，其中含有高浓度乳酸作为电子供体，并在最适pH和温度条件下进行操作；此更换步骤具有两个作用：（1）提高了上游代谢过程的速率，使其快于EET；（2）去除了从工作电极（掺铟氧化锡（ITO）电极）表面单层生物膜脱落并进入上清液的游动细胞。本方案提供的详细操作流程旨在帮助新使用者维持并确认EET过程为限速步骤。

<table><tbody><tr><td>玻璃圆筒</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>定制，用作电化学反应器</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（PTFE）盖板和底座</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>定制，用作电化学反应器的盖子和基座</td></tr><tr><td>丁基橡胶</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>定制，插入电化学反应器各组件之间</td></tr><tr><td>隔垫（Septa）</td><td>GL Science</td><td>3007-16101</td><td>用作电化学反应器的进样口</td></tr><tr><td>掺铟氧化锡（ITO）电极</td><td>GEOMATEC</td><td>No.0001</td><td>用作工作电极，5&amp;Omega;/sq</td></tr><tr><td>氯化银/银（Ag/AgCl）饱和KCl电极</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HX-R5</td><td>用作参比电极，&amp;Phi;0.30mm</td></tr><tr><td>铂丝</td><td>The Nilaco Cooporation</td><td>PT-351325</td><td>用作对电极</td></tr><tr><td>LB培养基（Luria-Bertani Broth, Miller）</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>244620</td><td>用于 &lt;em&gt;S. oneidensis&lt;/em&gt; MR-1 的预培养</td></tr><tr><td>细菌琼脂（Bacto agar）</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>蒽醌-1-磺酸盐（&amp;alpha;-AQS）</td><td>TCI</td><td>A1428</td><td></td></tr><tr><td>黄素单核苷酸（FMN）</td><td>Wako</td><td>184-00831</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td>用于定义培养基（DM）</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>用于DM</td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Wako</td><td>011-03015</td><td>用于DM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>用于DM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>用于DM</td></tr><tr><td>2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）</td><td>DOJINDO</td><td>346-08235</td><td>用于DM</td></tr><tr><td>乳酸钠溶液</td><td>Wako</td><td>195-02305</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物（Bacto Yeast Extract）</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>重水（D，99.9%）</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-4-PK</td><td>用于动力学同位素效应实验的添加剂</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.</td><td>LTI-601SD</td><td>用于预培养</td></tr><tr><td>摇床</td><td>TAITEC</td><td>NR-3</td><td>用于预培养</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>TOMY SEIKO CO. LTD.</td><td>LSX-500</td><td>用于电化学反应器和培养基的灭菌</td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>SANYO</td><td>MCV-91BNF</td><td>用于防止其他微生物污染电化学反应器和培养基</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>要求转速可达6000&amp;times;g</td></tr><tr><td>氮气发生器</td><td>Puequ CO. LTD.</td><td>PNTN-2</td><td>也可使用氮气钢瓶替代气体发生器</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>SHIMADZU</td><td>UV-1800</td><td>用于优化细胞密度</td></tr><tr><td>电化学工作站</td><td>BioLogic</td><td>VMP3</td><td>用于生物膜形成和动力学同位素效应实验</td></tr><tr><td>恒温水浴循环器</td><td>AS ONE</td><td>TR-1A</td><td>用于维持电化学反应器的温度</td></tr><tr><td>法拉第屏蔽笼</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HS-201S</td><td>用于电化学实验</td></tr></tbody></table>

电化学检测shewanella oneidensis mr-1中胞外电子传递的氘动力学同位素效应

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

直接电化学检测 c-嵌入细菌外膜的细胞色素复合物（外膜 c-型细胞色素复合物；OM c细胞色素（Cyts）最近作为一种新型的全细胞分析方法出现，用于表征细菌呼吸链向细胞外传递电子的过程，即胞外电子传递（extracellular electron transport, EET）。尽管EET反应中电子传递的通路和动力学已有研究，但用于考察与EET相关阳离子转运影响的全细胞电化学方法尚未建立。本研究提供了一种生化技术示例，通过外膜（OM）考察氘代动力学同位素效应（deuterium kinetic isotope effect, KIE）对EET的影响。 c-使用模式微生物的细胞研究， Shewanella oneidensis MR-1的描述。如果通过OM的EET过程的KIE可以获取 c-Cyts 是微生物电流产生过程中的限速步骤。因此，在添加 D 之前2O，将上清液更换为含有足量电子供体的新鲜培养基，以支持上游代谢反应的速率，并去除工作电极上均匀单层生物膜中的浮游细胞。其他方法可用于验证微生物电流产生中的限速步骤是通过外膜的电子传递（EET） c-细胞色素也进行了描述。我们用于研究质子转运动力学的全细胞电化学检测技术可应用于其他电活性微生物菌株。

在 +0.4 V（相对于标准氢电极）施加电位 25 小时后，ITO 玻璃工作电极表面形成单层生物膜，该结果此前已通过扫描电子显微镜或共聚焦显微镜证实4电流产生的代表性时间过程 S. oneidensis MR-1 在单层生物膜形成过程中的表现如图所示 图2尽管每次测量时电流都会变化，但所产生的电流与该值相比偏差不超过50% 图2 如果单层生物膜均匀形成。
为了最大限度提高代谢速率并清洗单层生物膜，在用含10 mM乳酸的新鲜DM替换上清液后（图3），在施加+0.4 V（相对于SHE）时可观察到稳定的阳极电流（约10分钟内增加5%）（图4a）。如果阳极电流...

本文介绍了一种全细胞电化学实验方案，用于研究质子传递对Shewanella oneidensis MR-1菌株中外膜细胞色素复合物介导的胞外电子传递速率的贡献。

电化学检测Shewanella oneidensis MR-1中胞外电子传递的氘动力学同位素效应

直接电化学检测嵌入细菌外膜的c型细胞色素复合物（外膜c型细胞色素复合物；OM ...

本实验方案的总体目标是通过检测氘代动力学同位素效应，观察质子传递对细菌胞外电子传递速率的贡献。我们的方法揭示了质子传递对细菌通过外膜c型细胞色素向电极进行胞外电子传递（EET）动力学的影响。由于我们采用的是活体细菌而非纯化的酶，因此本检测方法能够反映EET过程中天然的质子调控机制。然而，我们的挑战是从其他细胞过程中去除噪声。氘动力学同位素效应（简称 KIE）是研究质子传递对相关电子传递过程贡献的最佳技术之一。培养希瓦氏菌 MR-1 细胞时，将琼脂平板上生长的一个菌落转移至 15 毫升 LB 培养基中。在30摄氏度、有氧条件下以160 rpm振荡培养细胞24小时。将细胞悬液在6,000 × g离心10分钟。然后，将所得细胞沉淀重悬于15毫升定义培养基中，培养基中添加10毫摩尔乳酸作为碳源，以及0.5克/升酵母提取物作为细胞所需的微量元素。将细胞悬液在30摄氏度下振荡培养12小时（转速160 rpm），进行好氧培养后，再次在6,000 × g 条件下离心10分钟。在进行电化学实验前，用DM培养基将所得细胞沉淀通过离心（6,000 × g，10分钟）洗涤两次。构建三电极电化学反应器时，将ITO基底作为工作电极置于反应器底部。随后，插入一个玻璃圆筒和一个聚四氟乙烯盖子，并将一根铂丝作为对电极插入。然后，将氯化银电极插入反应器中作为参比电极。接下来，向电化学反应器中加入4毫升DM培养基，其中添加10毫摩尔乳酸和0.5克/升酵母提取物。确认电化学反应器无泄漏后，向电化学反应器中通入氮气20分钟以上，以维持反应器内的厌氧环境。将电化学反应器连接至电化学工作站，并对ITO电极施加+0.4伏的电压，同时利用外接水循环系统将电化学反应器的温度保持在30°C。进行电化学培养时，首先用添加了10毫摩尔乳酸和0.5克/升酵母提取物的DM培养基，将菌悬液的细胞密度调节至600纳米处的光密度为1.43。使用注射器通过进样口向电化学反应器中加入0.3毫升细胞悬液。反应器中的OD 600变为0.1。继续在氧化铟锡（ITO）电极上施加正0.4伏电压，持续25小时。停止施加电位，将电化学反应器从恒电位仪和水循环系统中断开。将氮气通入装有含10毫摩尔乳酸的DM培养基的瓶中，持续20分钟，以去除培养基中的氧气。现在，在持续通入氮气的条件下，使用注射器极其缓慢而轻柔地将电化学反应器内的所有上清液移除。然后，使用注射器加入 4 毫升含有 10 毫摩尔乳酸的新鲜 DM。倾斜电化学反应器，以去除反应器壁上的所有上清液。总共重复这些步骤三次。停止气体流动，再次将电化学反应器连接到恒电位仪，在303 K下对ITO电极施加0.4伏的正电压。确认来自Shewanella MR-1单层生物膜的电流产生稳定，且未迅速增加。如果电流急剧上升，则需等待电流稳定，即在10分钟内增幅不超过5%。使用注射器极其缓慢且轻柔地向电化学反应器中加入 40 微升无氧的 50 体积百分比 D2O，使反应器中 D2O 的浓度为 0.5 体积百分比。为防止 D2O 加入时对生物膜造成损伤，应逐滴加入 D2O。等待电流稳定后，继续将 D2O 加入至 4.4 体积百分比，以获得 KIE 值，该值为电流生成量在 D2O 与 H2O 存在条件下的比值。检测加入相同体积的H2O对电流产生的影响。其中，实线代表加入D2O后微生物电流变化的典型结果。加入D2O后，微生物电流在10秒内迅速下降，而加入H2O几乎未引起电流下降，如虚线所示。为了证实D2O引起电流下降的现象归因于外膜细胞色素介导的电子传递，实验中使用了一种可扩散的电子媒介体。在此条件下，添加100 µM的α-AQS可使电流产生增加五倍以上，且D2O的加入对电流产生无影响。这些结果表明，代谢反应的动力学速度足够快，使得胞外电子传递过程成为限速步骤。评估这一过程的另一种方法是将黄素分子添加到电化学反应器中。添加黄素后若立即出现阳极电流增加，则表明细胞外膜细胞色素介导的电子传递过程是限速步骤。观看本视频后，您应能够充分理解如何检测动力学同位素效应对胞外电子传递过程的影响。成功获得动力学同位素效应最关键的要点是明确并确认电子通过外膜细胞色素传递的过程限制了电流产生的速率。在本视频中，我们介绍了两种用于确认该条件的方法：通过添加黄素以及添加可扩散的外源介体（如α-AQS）来观察电流的变化。一旦确认了速率限制步骤，该系统不仅可用于氘代实验，还可用于外膜细胞色素的生化表征。此外，只要胞外电子传递过程是限速步骤，该方案也可适用于研究其他电活性微生物。我们的方法提供了一种基础且通用的技术，用于在体内研究通过外膜细胞色素介导的胞外电子传递过程。

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生物化学

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使用电化学传感器进行细菌检测与鉴定

来源：Tokunou, Y., 等，电化学检测重氢动力学同位素效应对Shewanella oneidensis MR-1胞外电子传递的影响。J. Vis. Exp.

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