Name: 组织工程应用中植物组织去细胞的两种方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 学习植物组织去细胞的两种方法，包括基于洗涤剂和不含洗涤剂的技术，用于组织工程支架制备。这些方法可保留细胞外基质结构，适用于多种植物茎组织，无需专用设备即可实现可扩展制造。

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我们感谢奥尔布里希花园的约翰·韦尔斯（John Wirth）慷慨提供本项目所用的标本。本研究部分由美国国家心肺血液研究所（R01HL115282，授予 G.R.G.）、美国国家科学基金会（DGE1144804，授予 J.R.G. 和 G.R.G.）以及威斯康星大学外科系和校友基金（H.D.L.）资助。本研究还部分得到了美国环境保护局（STAR 资助编号 83573701）、美国国立卫生研究院（R01HL093282-01A1 和 UH3TR000506）以及美国国家科学基金会（IGERT DGE1144804）的支持。

1. 使用基于去污剂的方法对植物组织进行脱细胞处理
<ol>
	<li>使用新鲜或冷冻的 F. hispida，叶片样品。将未使用的 Fresh 样品置于 -20 °C 冰箱中冷冻保存，以备后续使用（最长一年）。 
	注意：可使用几乎所有所需植物的茎或叶组织。长时间储存可能导致组织受损。
	<ol>
		<li>根据样品的预期用途确定待处理样品的大小和形状（即 将样品切成条状非常适用于机械测试应用，而8 mm的圆片样品则适用于多孔培养应用。在室温（20–25 °C）去离子水下，使用锋利洁净的活检打孔器将叶片切割成8 mm的圆片。2O. 
		注意：本方案可用于完整的叶片和茎段，但较小的样品脱细胞速度更快。</li>
		<li>在室温（20–25 °C）下将样品孵育 5–10 分钟，使用去离子 H2在低速摇床上振荡，以洗涤和/或解冻样品。使用足量的去离子水2O 以确保所有样品完全润湿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制10%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）的去离子水溶液2O. 将样品置于合适的容器中（玻璃或塑料培养皿最为理想），加入SDS溶液以完全覆盖样品。将样品在室温（20–25 °C）下于摇床中孵育5天，摇床设置为低速以防止样品受损。 
	注意：容器内样本不可过密，否则会减缓脱细胞进程，并导致SDS处理不均匀。此步骤中，样本应呈现棕色。
	<ol>
		<li>5 天后，将 SDS 溶液更换为去离子 H2O. 将样品在摇床平台上继续孵育10-15分钟，以充分洗去残留的SDS溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制1%（v/v）非离子型表面活性剂的10%（v/v）次氯酸钠溶液。制备500 mL溶液时，将5 mL非离子型表面活性剂与50 mL次氯酸钠混合，再加入445 mL去离子H₂O。2将样品浸入新配制的溶液中。 
	注意：非离子型表面活性剂/次氯酸钠溶液的保存期限较短，因此应在配制后48小时内使用。</li>
	<li>每24小时更换一次非离子型表面活性剂/漂白剂溶液，直至样品完全透明（参见 图1A 用于视觉对比）。随后将样品置于去离子水中，在摇床中孵育2分钟，以洗去多余的非离子表面活性剂/漂白剂溶液。将摇床调至低速设置，以防止样品受损。 
	注意：清除样本所需时间因植物种类和物种而异。样本完全褪色表明去细胞化已彻底完成（可通过DNA定量检测以确认清除效果）。
	<ol>
		<li>将样品冻干后保存，可储存长达一年（推荐使用液氮速冻，也可在-80 °C条件下冷冻），并置于室温（20–25 °C）、低湿度环境中保存。</li>
		<li>在 Tris-HCl（10 mM，pH 8.5）中重悬样本，用量以能够包被样本为宜。使用前用无血清培养基轻轻冲洗样本 2–3 次，每次用移液器操作即 使用150-300 µL进行清洗，适用于标准的24孔板。 
		注意：Tris-HCl 缓冲液和无血清培养基（即 DMEM，但任何基础细胞培养基均可替代）在降低SDS处理样本对细胞活力的影响方面，比经去离子水处理的样本更有效2O alone。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 采用无去垢剂脱细胞方法制备样品
注意：本实验步骤的初始部分与步骤 1.1-1.1.2 相同（见上文）。
<ol>
	<li>配制含5% (v/v) 次氯酸钠（NaClO）和3% (w/v) 碳酸氢钠（NaHCO3）的溶液。在通风橱中将溶液置于加热板上加热并搅拌，使其温度升至60–70 °C，用于处理切成8 mm圆片的 F. hispida 叶片样品。 
	注意：碳酸氢钠可用碳酸钠（Na2CO3）或氢氧化钠（NaOH）替代。所需温度变化范围较大（从室温至90 °C），应根据所用样品的特性进行调整。</li>
	<li>当溶液达到目标温度范围后，将样品浸入其中，并降低搅拌速度以避免损伤样品。待样品明显透明化后（可参考 图1B 进行视觉对比），小心将其从溶液中取出。随后将样品在去离子水（H2O）中浸泡一次，持续1–2分钟，以去除残留的漂白液。 
	注意：样品透明化所需时间差异较大。例如，切碎的欧芹可在10–15分钟内完成透明化，而较厚或较大的样品（如整片叶片或茎段）在高温溶液中可能需要数小时才能完全透明。</li>
	<li>将样品进行冷冻干燥，并在低湿度条件下于室温（20–25 °C）保存。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了两种植物组织脱细胞的方法。此处展示的结果，结合先前研究的结果25，表明所提出的方案可能适用于多种植物物种，并可在茎和叶上实施。这些操作步骤简单，无需特殊设备，因此植物脱细胞可在大多数实验室中进行。值得注意的是，脱细胞后的支架必须经过功能化处理，以促进哺乳动物细胞的黏附。其他文献中已描述了多种可在植物组织上实现哺乳动物细胞黏附与生长的不同功能化技术25，但这些内容不在本论文的讨论范围之内。
本文所介绍的两种脱细胞化方案的最后一步（图1）对其成功至关重要。在实施任一方法时，切勿使容器内样本过于密集，否则会导致透明不均匀。这些方法可用于整片叶片和茎段，但会延长完全透明所需的时间。务必确保样本完全浸没，以保证整个样本的透明过程一致。理想的脱细胞化应尽可能清除植物组织中的大部分细胞成分，同时将结构损伤降至最低。无洗涤剂方法很可能可根据所需样本的特性进行适当调整。较高的水浴温度可能缩短透明时间，但如果孵育过度，也可能导致样本损伤加...

组织工程于20世纪80年代兴起，旨在创造活体组织替代物，以应对严重的器官和组织短缺问题1。其中一种策略是利用支架材料来刺激并引导机体再生缺失的组织或器官。尽管3D打印等先进制造技术已能制备出具有独特物理特性的支架，但制造具备多样化物理和生物学特性的支架仍面临挑战2,3。此外，由于缺乏功能性血管网络，这些技术在再生三维组织方面受到限制4,5,6,7。利用去细胞化的动物和人体组织作为支架有助于克服这一难题。然而，去细胞化动物支架存在成本高、批次间差异大以及供应有限等问题，可能限制其广泛应用8。此外，还存在向患者传播疾病的风险，以及对某些去细胞化哺乳动物组织产生免疫反应的担忧9。
纤维素来源于植物和细菌，已被广泛用于制备再生医学中多种应用的生物材料。例如：骨10,11软骨12,13,14 以及伤口愈合15由纤维素构成的支架具有一项额外优势，即其具有良好的耐久性，并且不易被哺乳动物细胞降解。这是因为哺乳动物细胞无法产生分解纤维素分子所需的酶。相比之下，使用细胞外基质中的大分子（如胶原蛋白）制备的支架则容易被降解16 且可能不适用于长期应用。胶原支架可通过化学交联进行稳定，但由于交联剂本身具有毒性，会影响支架的生物相容性，因此存在权衡。17相反，纤维素有可能在植入部位长期存留，因为它对哺乳动物细胞的酶降解具有抗性。18,19,20通过水解预处理调节降解速率，并结合纤维素酶共递送支架，可实现对此的调控。21脱细胞植物源性纤维素支架的生物相容性 体内 在一项针对小鼠的研究中也已得到证实22.
经过数亿年的进化，植物不断优化其结构和组成，以提高液体运输和保持的效率。根据默里定律（Murray's law）23，植物维管束通过分支形成更细的导管，以最小化流体阻力，其结构类似于哺乳动物的血管系统。去细胞化后，植物复杂的导管网络和相互连通的孔隙结构得以保留。鉴于自然界中大量可获取的植物物种，植物来源的支架有望克服当前组织工程中支架设计所面临的诸多限制24,25。例如，Modulevsky 等 研究表明，将去细胞化的苹果组织植入小鼠背部皮下后，可观察到血管生成和细胞迁移现象22。同样，Gershlak 等 证实内皮细胞可在去细胞化叶片的维管系统内生长24。在另一项独立实验中，Gershlak 等 还证明心肌细胞可在叶片表面生长并实现收缩功能24。
植物从细胞到宏观尺度都具有复杂的结构层次，即使是目前最先进的制造技术也难以实现这种复杂性。植物组织的复杂层级结构使其强度超过其各组分单独性能的总和26。植物具有多种多样的力学特性，从茎等坚硬且强韧的结构，到叶片等柔韧性和可塑性更高的部分27。叶片在不同物种间存在差异，其大小、形状、断裂强度、维管化程度以及亲水性程度各不相同。总体而言，这些植物特性表明，去细胞化植物可作为独特且高度功能化的医疗器械，例如用于组织工程的支架材料。
本方案重点介绍两种用于脱细胞化植物组织（如叶片和茎）的方法，以将其用作组织工程中的支架材料。第一种方法是基于去垢剂的技术，通过一系列浸泡溶液去除DNA和细胞物质，该技术借鉴自一种广泛用于脱细胞化哺乳动物和植物组织的常用方法。6,22,25,28,29,30第二种方法无需使用去污剂，源自一种 &#34;去骨化&#34; 去除叶片软组织的常用实验方案31先前的研究表明，将叶片在漂白剂和碳酸氢钠溶液中缓慢加热有助于分离维管组织与周围的软组织。31该技术可追溯至17世纪进行的实验。th 和 18th 几个世纪以来，例如阿尔伯图斯·塞巴的工作32 和 Edward Parrish33这些实验主要将植物材料（如叶片和果实）浸没在水中较长时间（数周至数月），使其较柔软的组织自然腐解。此处的 &#34;去骨化&#34; 该方法采用更温和的条件，例如在较低温度下延长孵育时间，以去除细胞残留物，同时避免对软组织结构造成显著破坏。在本研究详述的实验中，共使用了三种植物类型： Ficus hispida, Pachira aquatica 和一种 藤黄属描述了两种方法的DNA定量结果、力学测试结果以及对细胞代谢活性的影响。

<table><tbody><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma Life Science</td><td>75746-1KG</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>807426</td><td>论文中引用的非离子型表面活性剂。该试剂黏度较高，吸取时可将移液器吸头尖端剪去一段以便操作。</td></tr><tr><td>浓缩漂白剂（8.25% 次氯酸钠）</td><td>Clorox</td><td>Item #: 31009</td><td>标准的浓缩漂白剂。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Acros Organics</td><td>217120010</td><td>可用氢氧化钠或碳酸钠替代。</td></tr><tr><td>8 mm Biopunch</td><td>HealthLink</td><td>15111-80</td><td>适用于切割适合放入24孔板的样品。</td></tr><tr><td>Belly Dancer-Shake 摇床</td><td>Stovall Life Sciences</td><td>BDRAA115S</td><td>应使用低速以避免损伤组织。可使用任意型号或品牌的摇床。</td></tr><tr><td>Isotemp 加热/搅拌板</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>可使用任意类型或品牌的加热/搅拌板。</td></tr><tr><td>烧杯</td><td>任意</td><td></td><td>可使用任意尺寸的烧杯，只要能容纳样品且不造成过度拥挤即可。</td></tr><tr><td>Tris 盐酸盐</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT50003PC</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA 检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>P11496</td><td>可使用任何现有的双链DNA定量方法。</td></tr></tbody></table>

用于组织工程应用的植物组织脱细胞两种方法

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

目前用作组织替代支架的自体、合成及动物来源移植物，由于来源有限、生物相容性差以及成本较高，存在诸多局限性。植物组织具有多种有利特性，使其非常适合作为支架材料，例如高比表面积、优异的水分运输与保持能力、相互连通的孔隙结构、预先存在的维管网络，以及广泛的力学性能。本文介绍了两种用于组织工程应用的植物去细胞化方法。第一种方法基于洗涤剂浸泡以去除细胞成分，类似于此前已建立的清除哺乳动物组织的方法。第二种方法为无洗涤剂法，改编自一种分离叶片维管系统的方案，通过加热的次氯酸钠与盐溶液处理来清除叶片和茎部。两种方法获得的支架均具有相似的力学性能和较低的细胞代谢影响，因此使用者可根据具体应用需求选择更适合的方案。

两种方法均获得了适用于细胞培养和组织工程应用的支架。 图1 展示了使用完整叶片进行基于去污剂法、以及使用切割样本（直径8 mm）进行无去污剂法的脱细胞过程总体工作流程。成功实现了脱细胞 Ficus hispida 两种方法处理的组织均获得了清晰且完整的样本（图1A 和 1B）。能够对整个植物组织进行脱细胞处理（图1A）；然而，较小的样本似乎清除速度更快且效果更佳。在基于去污剂的方法中观察到的一个潜在问题是，由于过早从非离子型表面活性剂溶液中取出，导致脱细胞化不均一。图1C）。无去污剂方法的一个缺点是，在加热浴中长时间孵育可能导致损伤（图1D).
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本文介绍并对比了两种用于植物组织脱细胞的实验方案：基于去污剂的方法和无去污剂的方法。这两种方法均能保留所用植物组织的细胞外基质，该基质随后可作为组织工程应用中的支架材料。

目前用作组织替代支架的自体移植材料、合成材料及动物源性移植物，由于来源有限、性能不佳……

这些方法有助于解决生物材料领域中的关键问题，例如开发具有优异流体传输性能、复杂超微结构且可规模化生产的支架材料。这些技术的主要优势在于，无需特殊设备即可将其应用于大多数植物的茎组织。首先，采集新鲜或冷冻的 F.hispida 叶片样品。将任何剩余的新鲜样品在 -20 摄氏度下保存，以备后续使用。将叶片浸没于 20 至 25 摄氏度的去离子水中。使用洁净的活检打孔器将叶片切成直径为 8 毫米的圆片。接下来，为了清洗叶片样品，将其浸入去离子水中，在摇床平台上以低速振荡孵育5至10分钟。然后，用去离子水配制10%（重量/体积）的SDS溶液。配制好SDS溶液后，将叶片样品置于塑料培养皿中。然后加入SDS溶液，完全覆盖样品。将浸入SDS的叶片样品加盖后置于摇床中，以防止蒸发。随后在室温下孵育叶片样品五天。孵育五天后，将 SDS 溶液替换为去离子水。将样品在去离子水中浸泡，并在摇床中孵育 10 至 15 分钟。接着，将 5 毫升非离子型表面活性剂与 50 毫升漂白剂混合。将此混合物加入445毫升去离子水中。然后将样品浸入 freshly prepared 非离子表面活性剂漂白溶液中。每24小时更换一次非离子表面活性剂漂白溶液，直至样品透明。然后将澄清的样品置于去离子水中，在摇床上浸没孵育两分钟。对于无洗涤剂的脱细胞处理，用3%（重量/体积）的碳酸氢钠溶液配制5%（体积/体积）的次氯酸钠溶液。接下来，在通风橱内，将该溶液在加热板上加热至60至70摄氏度。当溶液达到所需温度后，立即将叶片样品浸入。随后降低搅拌器的转速，以防止样品受损，并观察明显透明的样品，小心地将其从水浴中转移。最后，将样品在去离子水中孵育一到两分钟。由于所有样品本质上均不相同，建议每隔约15分钟检查一次脱细胞进程，以确保样品不受损伤。首先研究MTM、SAF和UTS参数，以探究P.aquatica和F.hispida两个物种脱细胞支架的独特特性。事实上，采用基于洗涤剂和无洗涤剂的两种脱细胞方法时，这三个参数均表现出相似的力学性能。然而，使用SDS而非漂白剂进行脱细胞处理时，F.hispida的UTS力学性能表现出显著更高的平均值。与未脱细胞的样品相比，所研究的脱细胞植物物种的基因组DNA含量也显著降低。接下来，还测量了人皮肤甲状腺母细胞在脱细胞处理的P.aquatica或Garcinia支架存在下的代谢活性。有趣的是，基于无去污剂的支架对细胞代谢活性的影响较小，但与仅使用去离子水洗涤相比，在SDS清除后先用Tris盐酸缓冲液洗涤，再用无血清培养基处理，可进一步降低对细胞代谢活性的影响。最后，本文展示了在F.hispida叶片结构表面用钙黄绿素染色的间充质干细胞的生长情况。一旦掌握，这些技术在正确操作的情况下，可在大约七天到短短15分钟内完成。在执行这些步骤时，重要的是要持续监测样本的脱细胞过程，因为不同批次

two-methods-for-decellularization-plant-tissues-for-tissue

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

组织工程应用中植物组织去细胞的两种方法

灌注脱细胞是一种新型技术，可用于制备保留肝脏细胞外基质成分和微结构的全肝支架。本文描述了利用灌注脱细胞法制备全器官支架并随后接种肝细胞的方法。通过该技术可生成具有功能且可移植的肝脏移植物。...

全肝脱细胞与再细胞化

本文描述了一种通过逆行灌注快速且完全去除完整猪心脏中细胞成分的方法。该方法可获得具有部位特异性的心脏细胞外基质支架，具有多种临床应用的潜力。...

通过逆行冠状动脉灌注法对猪心脏进行脱细胞处理的步骤

本文描述了一种从大鼠肠道制备无细胞基质的方法。肠道支架的构建对于组织工程、干细胞生物学以及药物测试等未来应用具有重要意义。...

一种用于制备天然去细胞肠道基质的脱细胞方法

组织特异性的细胞外基质（ECM）是调控细胞功能的关键介质。本文介绍了一种合成纯ECM来源的泡沫材料和微载体的方法，这些材料在培养中稳定，无需化学交联，可用于先进的三维体外细胞培养模型或作为促再生生物支架。...

用于组织特异性细胞培养与递送的细胞外基质来源泡沫及微载体的制备

心脏细胞外基质（ECM）是由多种分子构成的复杂网络，可在整个生命周期中协调组织和器官的关键生理过程，并经历生理性的重塑。对胎儿和成人心脏进行标准化脱细胞处理，可在三维环境中保留其天然结构和生物力学特性，从而实现两种组织的对比实验研究。...

用于体外研究的胎儿与成人心脏组织外植体的可比性脱细胞三维样平台

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人脐静脉脱细胞与再细胞化方法

该方法通过基于渗透冲击和离子型去污剂灌注的简单方案，实现对复杂实体器官的脱细胞处理，同时最大程度减少对器官基质的破坏。该技术包含一种新颖的人类心脏脱细胞方法，将心脏置于加压袋内，并对流动动力学和细胞碎片流出进行实时监测。...

在加压袋内以倒置方向对完整人类心脏进行脱细胞处理

本方案介绍了一种利用去细胞化大鼠肾脏制备支架的方法。该方案包括去细胞化和再细胞化过程，以验证其生物可利用性。去细胞化过程使用Triton...

大鼠脱细胞肾脏支架的制备

该方案描述了通过定制的灌注生物反应器，将十二烷基硫酸钠洗涤剂经皮瓣血管系统灌注，从而对手术获取的带血管猪皮瓣进行脱细胞处理的过程。...

定制灌注生物反应器中猪带血管皮瓣的获取与灌注脱细胞处理

在本研究中，我们详细描述了脱细胞化、物理表征、成像以及 体内...

脱细胞苹果来源支架在骨组织工程中的应用 体外 和 体内

学习植物组织去细胞的两种方法，包括基于洗涤剂和不含洗涤剂的技术，用于组织工程支架制备。这些方法可保留细胞外基质结构，适用于多种植物茎组织，无需专用设备即可实现可扩展制造。

用于组织工程应用的植物组织脱细胞两种方法

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