组织工程应用中植物组织去细胞的两种方法
May 31st, 2018
在这里, 我们介绍, 并对比两个协议用于 decellularize 植物组织: 洗涤剂为基础的方法和无洗涤剂的方法。这两种方法都留下了植物组织的细胞外基质, 然后可以用作组织工程应用的支架。
这些方法可以帮助解决生物材料领域的关键问题，例如开发具有出色流体传输能力、复杂超结构和可扩展制造的支架。这些技术的主要优点是它们可以应用于大多数植物的干细胞组织，而无需专门的设备。首先，收集新鲜或冷冻的 F.hispida 叶样品。
将剩余的新鲜样品储存在零下 20 摄氏度以备将来使用。让叶子在 20 至 25 摄氏度的去离子水中保持浸泡。使用干净的活检打孔器将叶子切成直径为 8 毫米的圆盘。
接下来，要清洗叶子样品，请在摇动板上用去离子水低速孵育 5 到 10 分钟。然后在去离子水中制备 10% 重量（按体积计）的 SDS。制备 SDS 溶液后，将叶子样品放在塑料盘上。
然后添加 SDS 溶液以完全覆盖样品。将 SDS 浸出的叶样品盖上，放在摇动板上以防止蒸发。然后将叶子样品在室温下孵育 5 天。
孵育 5 天后，用去离子水替换 SDS 溶液。将浸泡在去离子水中的样品在摇动板上孵育 10 至 15 分钟。接下来，将 5 毫升非离子表面活性剂与 50 毫升漂白剂混合。
将此混合物添加到 445 毫升去离子水中。然后将样品浸入新鲜制备的非离子表面活性剂漂白剂溶液中。继续每 24 小时更换一次非离子表面活性剂漂白剂溶液，直到样品被清除。
然后将澄清的样品放在摇床板上，在去离子水中浸泡 2 分钟。对于不含洗涤剂的脱细胞，在 3% 重量比的碳酸氢钠溶液中制备 5% 体积比的漂白剂。接下来，在通风橱内的热板上将溶液加热至 60 至 70 摄氏度。
一旦溶液达到所需温度，立即浸泡叶子样品。然后降低搅拌板的速度以防止损坏样品，寻找明显清除的样品，并小心地将它们从浴中转移。最后，将样品在去离子水中孵育 1 到 2 分钟。
由于所有样品在本质上都是不同的，因此建议大约每 15 分钟检查一次脱细胞进度，以确保样品没有损坏。首先研究 MTM 、 SAF 和 UTS 参数，以研究 P.aquatica 和 F.hispida 物种独特的脱细胞支架特性。事实上，使用基于去污剂的脱细胞方法和不含去污剂的脱细胞方法，所有三个参数都显示出相似的机械性能。
然而，F.hispida 的 UTS 机械性能显示使用 SDS 而不是漂白剂进行脱细胞的平均值显着更高。与未脱细胞样品相比，所研究的澄清植物物种的基因组 DNA 含量在脱细胞后也显著降低。接下来，在脱细胞的水生假单胞菌或藤黄菌支架存在下也测量人真皮甲状腺母细胞的代谢活性。
有趣的是，不含去污剂的支架对细胞代谢活动的影响降低，但与单独用去离子水洗涤相比，用三盐酸盐缓冲液洗涤，然后在 SDS 清除后用无血清培养基洗涤，减少了对细胞代谢活性的影响。最后，这里显示了用钙碱染色的间充质干细胞在 F.hispida 叶结构表面的生长。一旦掌握，如果执行得当，这些技术可以在大约 7 天到短短 15 分钟内完成。
在执行这些程序时，重要的是要记住在样品脱细胞时对其进行监测，因为样品可能因批次而异，这可能导致不同的透明化时间。按照此程序，可以应用其他方法（例如去量化或机械测试）来回答其他问题，例如样品的清除程度以及样品与哪些其他组织在机械上相似。开发后，这项技术为组织工程领域的研究人员制造可灌注支架铺平了道路。
观看此视频后，您应该对如何使植物组织脱细胞以用作支架有很好的了解。不要忘记，使用洗涤剂和漂白剂烟雾可能很危险，因此在执行这些程序时应始终采取预防措施，例如使用适当的防护设备和使用通风橱。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文介绍并对比了两种用于植物组织去细胞化的协议：基于洗涤剂的方法和无洗涤剂方法。两种方法都能保留细胞外基质，这可以作为组织工程应用的支架。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物材料
- 组织工程
- 植物生物学
背景
- 去细胞化技术对于创建支架至关重要。
- 支架可以增强流体传输能力。
- 方法可以应用于各种植物茎组织。
- 这些技术不需要专门的设备。
研究目的
- 比较基于洗涤剂和无洗涤剂的去细胞化方法。
- 评估植物细胞外基质作为支架的潜力。
- 解决组织工程支架开发中的挑战。
使用的方法
- 收集新鲜或冷冻的F.hispida叶子样本。
- 将样本在-20摄氏度下储存。
- 在20至25摄氏度的去离子水中浸泡叶子。
- 使用活组织检查器将叶子切成直径为八毫米的圆盘。
主要结果
- 两种去细胞化方法都有效地保留了细胞外基质。
- 所创建的支架可以用于各种组织工程应用。
- 支架的流体传输能力得到了增强。
- 这些方法是可扩展的，适用于大多数植物种类。
结论
- 去细胞化技术为组织工程提供了可行的支架。
- 两种方法各有优势，可以根据具体需求进行选择。
- 未来的研究可以探索植物衍生支架的其他应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Plant-derived scaffolds address critical biomaterials challenges in tissue engineering by offering scalable, biocompatible alternatives to autologous, synthetic, and animal-derived grafts. The described decellularization methods enable reproducible production of scaffolds with preserved extracellular matrix architecture, supporting fluid transfer and mechanical functionality essential for regenerative medicine applications. This positions plant-based systems as a strategic option for de-risking early-stage scaffold development in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of extracellular matrix contributions to scaffold biocompatibility and mechanical integrity.
- Operational Value: Provides standardized plant tissue preparation workflows applicable across species without specialized equipment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields scaffolds with quantifiable mechanical properties (UTS, MTM, SAF) for comparative biomaterial screening.
- Operational Value: Supports assay-ready scaffold production with low cellular metabolic impact, enabling reproducible cell-seeding experiments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates evaluation of human cell responses (e.g., dermal thyroblasts, mesenchymal stem cells) on plant-derived matrices.
- Operational Value: Offers dual-method flexibility (detergent-based vs. detergent-free) to optimize scaffold properties for specific tissue engineering endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
These decellularization methods integrate into the discovery continuum by providing preparatory scaffolds for cell-based assays, supporting progression from biomaterial screening to preclinical validation in tissue engineering workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing regarding plant extracellular matrix suitability as a scaffold foundation.
- Screening: Delivers reproducible scaffolds with measurable mechanical and biological outputs for comparative evaluation.
- Analytics: Generates quantifiable data (genomic DNA reduction, metabolic activity, UTS) to inform scaffold selection criteria.
- Translational Research: Supports continuity from biomaterial discovery to preclinical testing via standardized scaffold production.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform-agnostic protocol adaptable to multiple plant species, enhancing resource efficiency across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in scaffold performance by decoupling cellular and extracellular matrix contributions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized incubation times, solution concentrations, and washing steps.
- Strategic Value: Lowers development barriers by eliminating need for specialized equipment, enabling broader lab adoption.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing scaffolds with tunable properties (e.g., UTS modulation via SDS vs. bleach).
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial handling and decellularization monitoring to prevent over-processing.
- Necessitates access to standard lab equipment (shake plate, hot plate, fume hood, biopsy punch) and reagents (SDS, bleach, sodium bicarbonate).
- Demands cross-team standardization of clearing endpoint assessment (e.g., visual inspection timing) to ensure batch consistency.
- Requires adaptation of incubation durations based on plant species and tissue thickness, as noted in sample variability observations.
- Involves safety considerations for handling detergents and bleach, including PPE use and fume hood operation during heated steps.
